ויזואליזציה של מודולי קורטיקליים Cortices יונקים שעברו שיטוח

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט כדי להשיג מקטעים וצורניים שעברו שיטוח של יונקים cortices והמחש מודולים בקליפת המוח באמצעות פתולוגיה ושיטות immunohistochemical.

המטרה הכוללת של הליך זה לשיטוח וצביעה של קליפת המוח היא לדמיין מודולים סלולריים באזורים בקליפת המוח באופן שכבתי. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במדעי המוח, כמו כיצד מבנה קליפת המוח מתפשט לתוך המוח, וכיצד הוא עשוי להיות קשור לתפקוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול להשוות ארכיטקטורה קליפת המוח בצורה למינלית, ולהשוות היבטים שונים שלה, כמו כיצד היא משמרת את האבולוציה המעמדית, או כיצד היא משתנה בתפקודה.

ידגימו את הטכניקה סיימון לאואר ואונדין שניווייב, סטודנט וטכנאי מהמעבדה של פרופסור מישל בלאק. כדי להתחיל, יש לחלחל את החיה באופן טרנס-קרדילי כדי להשיג מוח קבוע באופן הומוגני ונטול דם. לאחר הסרת המוח, טבלו אותו במאגר פוספט מולארי של 0.1

אם רוצים קטעים עם אזורים גדולים בקליפת המוח, יש לשטח את המוח לפני פוסט-קיבוע נוסף. עם זאת, כדי להשיג חלקים של אזורים שקשה להגיע אליהם, כמו קליפת המוח האנטורינלית האמצעית, יש לתקן את המוח ב-4% PFA למשך 24 שעות לפני השטחה. התכוננו לשמור על לחות המוח עם חיץ במהלך כל הדיסקציה.

כדי להתחיל, הפרד את חצאי הכדור באמצעות אזמל. אם המוח לא עבר קיבוע, היזהר בעת הטיפול בו. לאחר מכן, תוך כדי אבטחת המוח על ידי המוח הקטן, הכנס בעדינות את המרית כדי לפתוח מישור דיסקציה בקורפוס קלוסום.

הקצה העגול של המרית צריך להצביע הרחק מקליפת המוח. לאחר מכן, תפעל את המרית כדי לחלק את התלמוס וקליפת המוח. לאחר מכן, הפרד את המבנים התת-קורטיקליים באמצעות סכין גילוח.

לאחר מכן, הפרד את המבנים התת-קורטיקליים באמצעות אזמל או קצה המרית. כדי לשפר את ההשטחה, בצע חתך נקי דרך הסטריאטום, גרעין האקומבנס וקליפת המוח הקדמית המסלולית, מכיוון שהם מגדילים את עובי קליפת המוח באזור הרוחבי. לאחר מכן הוסף חתך מקל בבסיס האזור הפנימי של קליפת המוח הקדם-מצחית.

זה יאפשר התפתחות של חלקים מדיאליים של קליפת המוח. כעת, הניחו קליפת מוח של חצי הכדור למטה על מגלשת זכוכית. לאחר מכן, הניחו שני גלילי חרס משני צידי הרקמה.

החימר חייב להיות דק יותר ב-10 עד 20% מרקמת המוח, שכן החימר מגדיר את מידת ההשטחה. לאחר מכן, הניחו צד זכוכית באופן משיק על קליפת המוח, וצרו קשר תחילה עם החלק הרוחבי. לאחר מכן, הניחו משקל על הזכוכית, כאשר המסה מרוכזת מעל החלק הרוחבי.

כעת, תנו למכלול לשבת שלוש עד חמש שעות במאגר פוספט בארבע מעלות צלזיוס. המפתח האמיתי להכנה הזו הוא להפוך את המוח לשטוח ככל האפשר, מאחר שיש לכך את ההשפעה הגדולה ביותר על התבוננות במפת קליפת המוח. לבסוף, במידת הצורך, השליכו את המוח.

העבירו את חצי הכדור השטוח ל-1% PFA, או 2% PFA אם הוא לא נלקח מבעל חיים מפוצץ. לאחר מכן, הניחו לו להתייצב למשך 24 שעות בחום של 4 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה. ראשית, שטפו את חצי הכדור השטוח במאגר פוספט למשך 15 דקות.

לאחר מכן, פורסים את חצי הכדור באופן משיק על ויברטום. תקן את הרקמה במקומה באמצעות נפח קטן של ציאנואקרילט ולחיצה עדינה. היזהר, מכיוון שיותר מדי דבק עלול להוביל לחיתוך חפצים.

כעת, חותכים את חצי הכדור מהקצה העבה והיציב יותר לכיוון הקצה הדק יותר בעובי הנדרש. אם נעשה שימוש בריכוזי קיבוע נמוכים, חותכים את הרקמה לאט עם משרעת גבוהה. לאחר מכן, שטפו את הרקמה החתוכה במאגר hepes למשך 15 דקות בתסיסה עדינה.

במהלך הכביסה הכינו תמיסת צביעת ציטוכרום אוקסידאז טרייה. והוסף את רכיב ה-DAB ממש לפני השימוש בו. כעת, דגרו את החלקים בתמיסת הצביעה הטרייה בטמפרטורת החדר בעזרת שייקר והשגיחו.

בהתאם לכמות הקיבוע, ניתן להבחין בכתמים תוך 10 דקות או שזה לוקח מספר שעות. אם התגובה איטית מדי, העלו את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את התגובה, העבירו את החלקים לאמבטיה של 4% PFA ותנו להם לדגור במשך 15 דקות בתסיסה עדינה.

לאחר מכן, שטפו את החלקים שלוש פעמים, עם מאגר hepes למשך 10 דקות בכל כביסה. כעת, הרכיבו וייבשו את החלקים על שקופיות זכוכית. ולייבש אותם באמצעות אמבטיות אתנול חזקות יותר ויותר.

לאחר מכן, שטפו את השקופיות באיזופרופנול למשך חמש דקות, ולאחר מכן קסילן למשך חמש דקות. לאחר אמבט הקסילן, הוסף מיד אמצעי הרכבה מתקשה במהירות שאינו על בסיס מים. מדיומים על בסיס מים ישפילו את הכתם.

לאחר הוספת פתק כיסוי, אחסן את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס עד לתמונה. חלקים קליפת המוח הסומטוסנסורי במגוון מוחות עובדו, תוך שימוש בהליכים המתוארים. גישה השוואתית זו מאפשרת לחקור את הכוחות האבולוציוניים המעצבים את קליפת המוח, כגון הייצוג השמור ביותר של ויבריסאר מיסטקסיאלי במכרסמים ולגומורפה כחביות.

הארכיטקטורה של קליפת המוח האנטורינלית האמצעית נצפתה בקטעים מקבילים למשטח הקליפה, באמצעות חתך משיקי של קליפת המוח האנטורינלית הרפואית בעכברים, חולדות ועטלפי פירות מצריים. בנוסף, מוחות אנושיים עובדו באמצעות השטחה עדינה של קליפת המוח ופרוסות משיקות. כל המוחות נשמרו בהקפאה, ונחתכו על קריוסטט ב-60 מיקרון.

צביעה חיסונית שימשה לתיוג מודולי תאים פרמיטליים חיוביים לקלבינדין. בקליפת המוח האנטורינלית, מודולי הקלבינדין מראים מחזוריות יוצאת דופן בכל מין, ומשתנים בגודלם בפקטור של 10 בלבד, על פני שונות של פי 20,000 בגודל המוח. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג קטעים משיקים לניתוח.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך מספר שעות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטח את המוח כראוי, במקום את הגודל, האיכות או התוצאות הסופיות. אל תשכח שעבודה עם סוכנים כמו PFA ו-DAB יכולה להיות מסוכנת ביותר, ואתה תמיד צריך ללבוש ביגוד מגן ולעבוד תחת אור השטח.