Name: Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: למד כיצד לכמת את יכולת תיקון קרום התא בתאי חולי דיסטרופיה שרירית באמצעות מיקרוסקופ לייזר שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תהליכי התיקון בפיברובלסטים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אלברטה הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים, חברים של גארט קאמינג מחקר יו ר הקרן, קרן כיסא של מחקרים המדע של HM Toupin נוירולוגיות, ניוון שרירים קנדה, קנדה קרן עבור חדשנות (CFI), אלברטה מתקדם החינוך והטכנולוגיה (הארכה), קנדי מוסדות הבריאות מחקר (CIHR), המסע של ג'סי - הקרן ג'ין, טיפול בתאי, הנשים, הילדים הבריאות מכון המחקר (WCHRI), ומחדש אלברטה פתרונות בריאות (AIHS ).
ברצוננו להודות ד ר סטיבן לאוול לספק לנו פלסמיד dysferlin באורך מלא. אנחנו רוצים גם תודה ד ר קצויה מיאקי עצות טכניות.

תאי פיברובלסט האנושי השתמשו במחקר זה נעשה שימוש באישור ועדת האתיקה האנושית של הפקולטה לרפואה, רפואת שיניים באוניברסיטת אלברטה.
1. תרביות תאים תאים עם פלסמיד DYSF באורך מלא
<ol>
	<li>התרבות תאי פיברובלסט בבקבוקון T225 המכיל 40 מ של צמיחה מדיה - בינוני נשר שונה (DMEM) של 36 מ"ל Dulbecco, 4 מיליליטר סרום שור עוברית (FBS) ו 20 µL של פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) - ב חממה2 CO ב 37 º C. הערה: התאים צריכים להיות בתרבית עד כ 70-80% confluency, אסור להפוך confluent לחלוטין.</li>
	<li>כדי להתכונן זריעת תאי, לשטוף את התאים 40 מ ל תמיסת פוספט buffered (PBS) פעמיים ולאחר מכן הוסף 5 מ של 0.05% טריפסין כדי לנתק את התאים. להחזיר התאים 37 ° C CO2 מגשים, דגירה התאים במשך 5 דקות.<ol>
		<li>כאשר התאים מנותק לחלוטין, להוסיף 40 מ"ל של צמיחה מדיה כדי לעצור את התגובה טריפסין.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer או תא אחר ספירת ההתקנים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>זרע 2 מ"ל של תאים-עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל 35 מ מ מצופה קולגן זכוכית-התחתון מנות. דגירה בין לילה בתאים חממה2 CO ב 37 º C. הערה: תאים צריך להיות כ- 50-60% confluent למחרת.</li>
	<li>מסיר את המדיה צמיחה ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של הפרעות-סרום התקשורת (מדיה צמיחה בלי FBS).</li>
	<li>Transfect התאים עם פלסמיד באורך מלא dysferlin באמצעות lipotransfection.<ol>
		<li>להכין µL 150 של הפרעות-סרום מדיה צינור 1.5 mL (שפופרת אחת עבור כל מנה להיות transfected).</li>
		<li>להוסיף 3 µL של תרביות תאים ריאגנט כל שפופרת 1.5 mL המכיל הפרעות-סרום מדיה. דגירה זה לפחות 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>בשפופרת mL 1.5 נפרדת, מוסיפים µL 175 של מדיה הפרעות-סרום µg 3.5 של פלסמיד ה-DNA. הערה: להכפיל את הכמויות הנ עבור כל מנה נוספת להיות transfected.</li>
		<li>לשלב 150 µL של המדיה המכילה פלסמיד DNA לתוך צינור עם 150 µL הפרעות-סרום ומדיה ריאגנט תרביות תאים. תקופת דגירה זה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>פזר באופן שווה 300 µL של התקשורת עם ריאגנט פלסמיד, תרביות תאים על-פני המנה. דגירה הכלים במשך 24 שעות ביממה ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>החלף את המדיה צמיחה טריים המדיה המכילה סרום, תקופת דגירה זה של h 24 נוספים ב חממה2 CO ב 37 º C.</li>
</ol>
2. הכנה של תאים assay ופצעו שני הפוטונים
<ol>
	<li>להסיר כלי התקשורת על-ידי pipetting, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של הפתרון של Tyrode טריים המכילים µL 1 של 2.5 מ מ FM צבע 4-64. הערה: הריכוז הסופי של FM 4-64 צבען הוא 2.5 מיקרומטר.</li>
	<li>אם הערכה של תיקון קרום בסביבה מדולדל סידן רצוי, לשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של PBS המכיל 1 מ מ EGTA. הערה: כפי PBS יגרמו התאים לנתק לאורך זמן, וזמינותו wounding צריך להשלים מהר ככל האפשר.</li>
</ol>
3. שני הפוטונים לייזר assay ופצעו
<ol>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה והתוכנה התוכנית המשויכת אליו, ליצור מטרה מיקרומטר 0.2 µm x 2 והנח אותו בקצה של קרום התא כך קו המטרה חופף הוא בניצב לכיוון קרום התא (איור 2).</li>
	<li>משתמשים בלייזר הנה 543-nm לרגש FM לצבוע אות ולקבוע טווח זיהוי עבור 600-760 ננומטר. השתמש לייזר ארגון 488 ננומטר לרגש GFP אות (איור 4) ולקבוע טווח זיהוי עבור 500-550 ננומטר.<ol>
		<li>צור סידרה זמן 5 דקות של סריקות תמונה רציפה, הדמיה תאים כל 5 s.</li>
		<li>ליצירת פצע ממברנה, אקונומיקה התאים באמצעות לייזר שני הפוטונים מוגדר כ- 820-nm, באמצעות 15% לייזר כוח עם 10 חזרות, אקונומיקה תאים 25 s לאחר תחילת סדרת הזמן.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>כדי לכמת FM 4-64 לצבוע פלורסצנטיות, להשתמש בתוכנה לצייר אזור מיקרומטר מיקרומטר x 6 6 עניין (ROI) ואת למקם אותו סמוך אל המיקום wounding, בתוך התא (איור 3). הערה: להימנע דגימה תחומי פיקסל oversaturation באמצעות הפונקציה "טווח מחוון" בתוכנה - ביישום זה, הפיקסלים האדומים מייצגים פיקסלים רווי. לייצא ערכים פלורסצנטיות גולמיים לתוך גיליון אלקטרוני אלקטרונית של לשם ניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>לחשב פלורסצנטיות יחסי ערכים עבור כל נקודת זמן על-ידי חיסור הערך רקע (זריחה אומר ערך של timepoints לפני ממברנה ופצעו) ואת חלוקת העלייה נטו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הערך ב- t = 0 (איור 5, 6) .</li>
</ol>

<ol><li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li>
<li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li>
<li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emergency+response+team+for+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li>
<li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Repair%3A+Mechanisms+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li>
<li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+free+Ca2%2B+and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li>
<li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li>
<li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li>
<li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li>
<li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li>
<li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+behave+as+Ca2%2B-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li>
<li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li>
<li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi%2Fbeige+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li>
<li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos%3A+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li>
<li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li>
<li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li>
<li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Curr%22%5BJournal%5D)">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298(2012).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li>
<li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li>
<li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li>
<li>Lee, J., Yokota, T. Ch 6. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLee%2C+J+%22Translational+Research+in+Muscular+Dystrophy%22">Translational Research in Muscular Dystrophy</a>. Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. , Springer Japan. 87-102 (2016).</li>
<li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שני הפוטונים לייזר פציעתו של קרום התא הוא טכניקה מדויק ופסיביות להערכת את הדינמיקה של קרום חתימה מחדש בתוך חוץ גופית. במאמר זה, אנו המתואר פרוטוקול לקביעת קרום התא חתימת יכולת בתאי החולה dysferlinopathy באמצעות הלייזר שני הפוטונים ופצעו וזמינותו. התוצאות שלנו להראות כי dysferlinopathy החולה תאים פגומים ב קרום התא חתימה, אשר עולה בקנה אחד עם הממצאים על ידי חוקרים אחרים, אשר בהמשך מדגיש את הדמיון הבולט בקרום התא חתימת דינמיקה בין שרירים ו תא שריר שאינו סוגי3,11<...

קרום התא של התאים האיקריוטים מורכב שכבה כפולה של פוספוליפידים משובץ-חלבון אשר מגדיר את סביבת חוץ-על/תאי "אינטרה" של התא היא חיונית לשמירה על הישרדות הומאוסטזיס ותא הסלולר. קרום התא פציעות הנובעות עלבונות כימי או מכני הם דבר שבשגרה בסוגים בתרבית של תאים שונים, לרבות שלד, שריר הלב, הקיבה והריאות תאים1,2,3,4. בנוסף פציעות הסוגר יומי תפקיד פיזיולוגי, קרום התא יכול גם להיות נפגע על ידי עלבונות סביבתיים רעלים חיידקי, פגיעה reperfusion איסכמי5. כישלון כדי לחתום מחדש יתבקע קרום התא מוביל תזרים ללא פיקוח של חוץ-תאית Ca2 +- יחד עם רכיבים אחרים חוץ-תאית רעיל - לתוך התא, מפעילה cascades האות במורד הזרם, אשר עלולה לגרום במהירות בתא מוות1,4,5,6.
עד כה, היו מספר דגמים המוצע לתיקון ממברנה בתאים. אולי ניתן להפעיל מנגנוני תיקון שונים תלוי בגודל אופי העלתה קרום. כך למשל, הוא הציע כי קרום התא עשויים לנצל זרימת לרוחב או חלבון סתימת לתקן שיבושים קטנים (&#60; 1 ננומטר). המודל פיוז'ן לרוחב מציעה כי קרום יתבקע במהירות לתיקון דרך גיוס לרוחב של המכילות dysferlin ממברנה7, ואילו החלבון סתימת דגם מרמז כי נקבים קטנים הם לתיקון דרך הצטברויות של חלבון (בעיקר annexins) 8. לעומת זאת, לעורר נגעים ממברנה גדולות Ca2 +-שלפוחית התלויים, בתיווך dysferlin פיוז'ן ועל היווצרות טלאי תיקון. במודל טלאי תיקון, Ca2 + הזרימה המהירה לתוך התא מפעילה הגיוס של חלבונים מרובים (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 ו EDH חלבונים) אשר ליצור מתחם או "תיקון", יחד עם שילוב של שלפוחית תאיים או lysosomes באתר של הממברנה גורם נזק4,9,10,11,12. חשוב לשים לב כי מודלים אלה אינם בהכרח סותרים, אולי לעבוד ביחד כדי להקל על תיקון קרום. כשל לחתום כראוי נזק קרום התא משויך מספר מצבי מחלה, כולל ניוון שרירים (dysferlinopathy - כולל מיושי מיופתיה, חגורת הגפיים-ניוון שרירים מסוג IIB, מיופתיה דיסטלי עם תחילת הטיביאלי הקדמי) 13, קרדיומיופתיה14ו- Chediak-היגאשי תסמונת (CHS)15.
נתון זה שלמות קרום התא המתאים וחתימה מחזות תפקיד כה חשוב על בריאות ומחלה, הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המולקולריים הבסיסית של תיקון קרום התא יהיה מועיל בחיפוש אחר הרומן אסטרטגיות טיפוליות. לכן,, יש להחזיק טכניקות ניסיוני המתאים כדי לפקח על קינטיקה, להעריך את היכולת של תיקון קרום התא. מספר במבחנה שיטות לסימולציה תיקון קרום עוצבו. אסטרטגיה אחת כרוכה פגיעה מכנית, אשר ניתן להקל באמצעות תא גירוד עם תער/להב פיפטה/כירורגי או על ידי גלגול חרוזי זכוכית על תאי ה-16. עם זאת, סוג זה של פציעה מכני יוצר נגעים גדולים ויוצרת רמה גבוהה של וריאציה תא לפציעה, הן בתוך והן בין תרבויות.
שיטה נוספת של יצירת פצעים ממברנה היא אבלציה לייזר על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים. בניגוד לייזר מסורתיות מיקרוסקופיה קונפוקלית מעסיקה עירור פוטון יחיד, הלייזר שני הפוטונים משתמשת בו זמנית שני פוטונים ארוך באורך הגל, אנרגיה נמוכה כדי להקל את עירור של אלקטרון בעל אנרגיה גבוהה17. תהליך ליניארי זה יוצר עירור אך ורק בתוך המטוס מוקד וגם לא לאורך כל הנתיב אור17 (איור 1). זה מופחת עירור העוצמה מסייעת למזער את נזקי כאשר הדמיה תאים חיים18,19. חוקרים ולכן מסוגלים לייצר נגעים מדויקת קרום התא וחתימה צג ממברנה בזמן אמת באמצעות צבעי פלורסנט ו התבוננות שינויים בעוצמת פלורסצנטיות כמו קרום התא יתבקע ולאחר מכן החתימות מחדש.
בגישה זו נעשה שימוש שוב ושוב ללמוד ממברנה ופצעו בתוך חוץ גופית ו ויוו וסוגי בתא מספר20,21. לדוגמה, ממברנה לתקן פגמים fibroblasts, myotubes נגזר dysferlinopathy חולים היו העריך באמצעות טכניקה זו,22,23. כמו כן, סיבי שריר בודד מבודד עכברים שימשו כדי לפקח על תיקון תיקון היווצרות13,24,25. התנועה של חלבונים מתויגות fluorescently יכול גם להיות שנצפו במהלך תיקון קרום סיבי השריר יחידה9. יתר על כן, התהליך של תיקון sarcolemmal בעקבות שני הפוטונים לייזר ופצעו בדג זברה העוברים נראים גם בזמן אמת אין ויוו26.
במאמר זה, אנו מכינים מתודולוגיה להערכת הדינמיקה תיקון קרום התא של fibroblasts באמצעות לייזר שני הפוטונים ופצעו, למרות מתודולוגיה זו שניתן להחיל על סוגי תאים שונים לצורך לכימות קרום פלזמה חתימת יכולת במבחנה. בשיטה זו, תאים מודגרת עם FM4-64, צבע lipophilic, התא אטום אשר במהירות שזוהר כמו זה נקשר באופן שלילי טעונה פוספוליפידים בתוך הציטופלסמה עם כניסתו לתא דרך ממברנה הנגע (איור 2&#38; 3)-כימות של זריחה צבע סמוכים הנגע ממברנה מאפשר ניטור הזמן שלוקח את קרום התא לחתום מחדש את עצמו. לצורך המחשה השירות של שיטה זו, אנו משתמשים dysferlinopathy החולה fibroblasts transfected עם פלסמידים מצומדת-GFP באורך מלא dysferlin (DYSF) כדי להעריך את החילוץ של תיקון קרום התא.

<table><tbody><tr><td>Thermo Fisher</td><td>11320033</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 יחידות למ"ל)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול</td><td>אדום Thermo Fisher</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco s פוספט חוצץ</td><td>מלח Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות זכוכית מצופות קולגן</td><td>MatTek</td><td>P53GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>מדיה נטולת סרום</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>מגיב טרנספקציה</td><td>תרמו פישר</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64 צבע</td><td>Invitrogen</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s תמיסת מלחים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2397</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>זיקית לייזר דו-פוטוני</td><td>קוהרנטי</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

עלבונות pathophysiological רבים יכולים לגרום נזק קרום התא, כאשר משולב עם פגמים מולדים תיקון קרום התא או תקינות, עלול לגרום למחלות. להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס סביב תיקון קרום התא, לפיכך, הוא מטרה חשובה להתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות הרומן המחלות הקשורות dynamics קרום התא לא מתפקדת. מחקרים רבים בתוך חוץ גופית ו ויוו להבנת קרום התא חתימת בהקשרים שונים של המחלה לנצל אבלציה לייזר שני הפוטונים כסטנדרט לקביעת תוצאות תפקודי בעקבות ניסיוני טיפולים. ב הזה assay, קרום התא הם נתון ופצעו עם לייזר שני הפוטונים, הגורמת קרום התא ועד לשתל הפלורסנט לחדור לתא. ניתן לנטר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך התא ואז לכמת את היכולת של התא לאטום מחדש את עצמו. ישנן מספר שיטות חלופיות להערכת קרום התא בתגובה לפציעה, כמו גם וריאציה נהדרת הלייזר שני הפוטונים ופצעו את הגישה עצמה, לכן, מודל אחד, מאוחד של התא ופצעו ישרת לטובה כדי להקטין וריאציה בין אלה מתודולוגיות. במאמר זה, אנו מכינים לייזר שני הפוטונים פשוטה ופצעו את פרוטוקול להערכת קרום התא תיקון במבחנה בשני בריא וב פיברובלסט החולה dysferlinopathy תאים transfected עם או בלי פלסמיד dysferlin באורך מלא.

Fibroblasts אנושי בריא fibroblasts החולה dysferlinopathy שאינם מטופלים, החולה fibroblasts transfected עם פלסמיד המכיל רצף באורך מלא dysferlin היו נתונים שני הפוטונים לייזר ופצעו להעריך ממברנה חתימת יכולת בזמן אמת. פיברובלסטים אנושי בריא מוצגים רמות נמוכות של הפעלת פלורסצנטיות FM 4-64 בעקבות לייזר ופצעו. שאינם מטופלים fibroblasts החולה הציגו רמה גבוהה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית היחסי בעקבות פגיעה (איור 5&amp; 6 ). התאים המטופלים היו transfect...

קרום התא ופצעו באמצעות לייזר שני הפוטונים שיטה הנפוצה להערכת יכולת חתימה מחדש קרום, שניתן להחיל על סוגי תאים מרובים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור במבחנה לחיות-הדמיה של קרום חתימת בתאי החולה dysferlinopathy בעקבות אבלציה לייזר שני הפוטונים.

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את יכולת התיקון של קרום הפלזמה בתאי חולי ניוון שרירים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בניוון שרירים, כגון מה הקשר בין מוטציה נתונה לקינטיקה של איטום מחדש של הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת כימות בזמן אמת של קינטיקה של איטום מחדש של הממברנה בתאים חיים.התחל בתרבית תאי פיברובלסטים בבקבוק T225 המכיל 40 מיליליטר של מצע גידול בחממת פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התרבית מגיעה למפגש של 70 עד 80%, יש לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מיליליטר PBS לכל שטיפה, ואחריה תוספת של חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מתנתקים, עצרו את התגובה עם 40 מיליליטר של מצע גידול טרי וזרעו שני מיליליטר תאים בריכוז של 100,000 תאים למיליליטר לתוך צלחות זכוכית מצופות קולגן בגודל 35 מילימטר לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום טרי נטול סרום לצינור אחד של 1.5 מיליליטר לכל תרבית טרנספקציה. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה לכל צינור, ודגר את הצינורות למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר. בזמן שהצינורות דוגרים, הוסף 175 מיקרוליטר של מדיום שמקורו בסרום ו-3.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד דיספרלין לצינור נוסף של 1.5 מיליליטר לצלחת.לאחר מכן שלב 150 מיקרולי

cell-membrane-repair-assay-using-a-two-photon-laser-microscope

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

סרטון זה מתאר אבלציה של אקסונים בלייזר דו-פוטוני בזחל Drosophila melanogaster ופרוטוקול לדוגמה לגרימת פציעה ותמונה של אתר הפגיעה.

פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה בתאי יונקים. התאים נחשפים לרעלן חיידקי היוצר נקבוביות, היוצר נקבוביות בקרום התא. בנוכחות יוני סידן חוץ-תאיים, הנקבובית גורמת לזרימת סידן, וגורמת לאירועים של איטום מחדש של הממברנה. יעילות האיטום מחדש מוערכת באמצעות צבע פרופידיום יודיד קושר DNA, אשר נכנס רק לתאים ללא קרום אטום מחדש.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות חוץ גופית למדידת יעילות האיטום מחדש של קרום הפלזמה

הדמיה חיה של תאים שנחשפו לצבע lipophilic FM1-43 מאפשרת קביעה מדויקת של קינטיקה שבו רעלים יוצרים נקבוביות יוסרו מקרום הפלזמה. זה assay רגיש שיכול לשמש כדי להעריך את הדרישות לCa 2 +, sphingomyelinase וגורמים אחרים על תיקון קרום פלזמה.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

כאן נתאר של תפוקה גבוהה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד קרום פלזמה חתימת יעילה באמצעות ניתוחים fluorometric, הדמיה בתאים חיים. Assay הזה יכול לשמש לסינון סמים או היעד גנים המווסתים קרום פלזמה חתימת בתאי יונקים.

תפוקה גבוהה מדידה של קרום פלזמה חתימת יעילות בתאים בתרבית

שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.

גישה תרמופלסמונית לחקר תיקון קרום פלזמה בתאים חיים וקרומי מודל

למד כיצד לכמת את יכולת תיקון קרום התא בתאי חולי דיסטרופיה שרירית באמצעות מיקרוסקופ לייזר שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תהליכי התיקון בפיברובלסטים חיים.

Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

גלה סרטונים נוספים