Assay תיקון קרום התא באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים לייזר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את יכולת התיקון של קרום הפלזמה בתאי חולי ניוון שרירים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בניוון שרירים, כגון מה הקשר בין מוטציה נתונה לקינטיקה של איטום מחדש של הממברנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת כימות בזמן אמת של קינטיקה של איטום מחדש של הממברנה בתאים חיים.

התחל בתרבית תאי פיברובלסטים בבקבוק T225 המכיל 40 מיליליטר של מצע גידול בחממת פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר התרבית מגיעה למפגש של 70 עד 80%, יש לשטוף את התאים פעמיים עם 40 מיליליטר PBS לכל שטיפה, ואחריה תוספת של חמישה מיליליטר של 0.05% טריפסין למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מתנתקים, עצרו את התגובה עם 40 מיליליטר של מצע גידול טרי וזרעו שני מיליליטר תאים בריכוז של 100,000 תאים למיליליטר לתוך צלחות זכוכית מצופות קולגן בגודל 35 מילימטר לדגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

הוסף 150 מיקרוליטר של מדיום טרי נטול סרום לצינור אחד של 1.5 מיליליטר לכל תרבית טרנספקציה. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה לכל צינור, ודגר את הצינורות למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר. בזמן שהצינורות דוגרים, הוסף 175 מיקרוליטר של מדיום שמקורו בסרום ו-3.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד דיספרלין לצינור נוסף של 1.5 מיליליטר לצלחת.

לאחר מכן שלב 150 מיקרוליטר של תמיסת ה-DNA של הפלסמיד עם 150 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה לצינור חדש אחד לכל צלחת לדגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. למחרת בבוקר, החלף את מצע הגידול בשני מיליליטר של מדיום שמקורו בסרום. בתום הדגירה, יש לחלק באופן שווה את כל 300 המיקרוליטר של תמיסת הפלסמיד על פני כל צלחת, ולדגור את הצלחות למשך 24 שעות בחממת הפחמן הדו חמצני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, החלף את סופרנטנט הפלסמיד במדיום גידול טרי והחזיר את הצלחות לחממה למשך 24 שעות נוספות. כדי להכין את התאים לבדיקת פציעה של שני פוטונים, שטפו את התרביות המועברות פעם אחת עם מיליליטר אחד של תמיסת טירוד. לאחר מכן הוסיפו לתאים מיליליטר אחד של תמיסה טרייה של טירוד בתוספת מיקרוליטר אחד של צבע FM4-64 בגודל 2.5 מילי-מולרי.

לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, צור מטרה של 0.2 על שני מיקרון בתוכנת המיקרוסקופ, ומקם את המטרה בקצה קרום התא כך שקו המטרה חופף ומונח בניצב לקרום התא. בחר לייזר ניאון הליום 543 ננומטר כדי לעורר את אות צבע ה-FM, ולייזר ארגון 488 ננומטר כדי לעורר את אות ה-GFP, והגדר את טווח הזיהוי עבור 600 עד 760 ננומטר ו-500 עד 550 ננומטר בהתאמה. לאחר מכן צור סידרת זמן של חמש דקות של סריקות תמונות ברצף.

כדי ליצור נגע ממברנה, השתמש בלייזר דו-פוטוני ל-820 ננומטר בעוצמת לייזר של 15% עם 10 איטרציות כדי להלבין את התאים 25 שניות לאחר תחילת סדרת הזמן. כדי לכמת את הקרינה של צבע FM4-64, השתמש בתוכנה כדי לצייר אזור עניין של שישה על שישה מיקרון, ולמקם את אזור העניין בסמוך למיקום הפציעה בתוך התא. לאחר מכן הפחיתו את ערך הרקע וחלקו את העלייה נטו בערך הקרינה בזמן אפס כדי לחשב את ערכי הקרינה היחסית עבור כל נקודת זמן.

תאי פיברובלסטים אנושיים בריאים מציגים רמות נמוכות של הפעלת פלואורסצנטיות FM4-64 לאחר פציעה בלייזר בעוד שפיברובלסטים של מטופלים שאינם מטופלים מציגים רמה גבוהה של עוצמת פלואורסצנטיות יחסית לאחר פציעה. תאי חולים שעברו טרנספטציה עם פלסמיד דיספרלין באורך מלא מפגינים עוצמת פלואורסצנטית יחסית נמוכה של FM4-64 בהשוואה לבקרות חולים שלא טופלו, אך דומה לערכי הקרינה שנצפו בבקרות בריאות. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתאים ימותו לאט בתמיסת החיץ, אז עבדו במהירות והחליפו לתאים טריים במרווחי זמן קבועים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחדש את נגעי הממברנה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני וכיצד לכמת את איטום הממברנה בזמן אמת.