Name: הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: למד ליצור ספריות Hi-C ברזולוציה גבוהה מעוברי Drosophila melanogaster בשלבים מוקדמים. שיטה זו מאפשרת חקר ארכיטקטורת כרומטין והשפעתה על ביטוי גנים בהתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי חברת מקס פלנק. C.B.H. נתמכה על ידי התחברות מאסכולת המחקר פלאנק מקס הבינלאומי – וההתערבות מולקולרית. אנו מודים שלבי בליית, אריק Wieschaus על הקו melanogaster דרוזופילה eGFP-PCNA מתן בחביבות.

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+Domains%2C+Metagenes%2C+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li>
<li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li>
<li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li>
<li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li>
<li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li>
<li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li>
<li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li>
<li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li>
<li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5094/drosophila-melanogaster-embryo-and-larva-harvesting-and-preparation">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , JoVE, Cambridge, MA. (2017).</li>
<li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li>
<li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections%2C+Treatments%2C+and+Incubations%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li>
<li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183(2015).</li>
<li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-bench%3A+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li>
<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li>
<li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+systems%22%5BJournal%5D)">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li>
<li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hitchhiker%27s+guide+to+Hi-C+analysis%3A+Practical+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopDom%3A+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70(2016).</li>
<li>Kruse, K., Hug, C. B., Hernández-Rodríguez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TADtool%3A+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li>
<li>Lévy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), Oxford, England. i386-i392 (2014).</li>
<li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Algorithms+for+molecular+biology%3A+AMB%22%5BJournal%5D)">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14(2014).</li>
<li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li>
<li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+systems%22%5BJournal%5D)">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/08/115063">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063(2017).</li>
<li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/31/121889">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889(2017).</li>
<li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li>
<li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li>
<li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+mitotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li>
<li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+decade+of+3C+technologies%3A+detailed+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes & development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול המוצג כאן הוא יעיל מאוד יצירת מפות באיכות גבוהה של האדריכלות כרומטין ב מוקדם עוברי דרוזופילה . בהשוואה של פרוטוקול קודמות34, הגישה המתוארת כאן משתמש מעודכן בחיי עיר ויטמינצ'יק הליך5, וכתוצאה מכך עיבוד מהיר יותר, ברזולוציה גבוהה יותר, ופחות ריאגנט השימוש. ההליך הכולל כולל הפרוטוקול ויטמינצ'יק בחיי עיר צפוי לעבוד על מגוון רחב של שלבים ומערכות ניסיוני חוץ דרוזופילה. מאז הפרוטוקול יש דרישה קלט נמוך, זה יכול לשמש גם על אוכלוסיות תאים מבודדים. דרוזופילה, כאשר המשתמשים בפרוטוקול עבור עוברי מחוץ לטווח המתוארים כאן, מספר פרמטרים, בפרט הקיבעון של החומר, ייתכן שיהיה עליך להתאימם. מאז עוברי בוגרים לפתח לציפורן אטום מאוד, העלאת הריכוז של פורמלדהיד והארכת קיבוע עשוי להיות מתאים. אוסף של העוברים בשלבים שאינו גרעיני מחזור 14, בתקופת הדגירה עוברי 25 ° c בשלב 1.4 צריכים להיות מותאמים כדלקמן: גרעיני מחזור 12, 70 דקות; גרעיני מחזור 13, 90 דקות; 3-4 hpf, 3:30 שעות.
במהלך לחטיבות המחשוף 13 (שלב 1-4), צפיפות גרעינים מוכפל בערך עם כל חטיבה. הגרעינים יכול בקלות להיות מזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית החיובי שלהם GFP. במהלך מיטוזה, eGFP-PCNA אינו נמצא בגרעין, האות מפוזרת בכל רחבי העובר. תכונה זו הופכת עוברי מזהים זה עוברים חטיבה המחשוף סינכרונית אפשרי. לימוד כרומטין קונפורמציה, אלה העוברים mitotic הם בדרך כלל לא רצוי, מאז הארגון mitotic של כרומטין שונה באופן דרסטי הארגון לאטמוספרה35. זה אפשרי להתאים הפרוטוקול לבחירת במיוחד העוברים העוברים חלוקה mitotic סינכרוני. במקרה זה, העוברים היחיד עם מפוזר, לא גרעיני הפצה של eGFP-PCNA צריך להישמר, כל העוברים האחרים צריכים להיות מושלך. מאז לא ניתן לקבוע את צפיפות גרעינית, חייב להיות מועסק שיטות אלטרנטיביות למניעת שלב עוברי מאת שלהם מורפולוגיה צפו ב המשודרת במיקרוסקופ אור. נוכחות של תאי מוט ואת הגרעינים בפריפריה העובר מציינים כי העובר סיים לפחות הגרעין מחזור 9, ואילו cellularization גלוי בפריפריה מציין גרעיני מחזור 1412.
שלום-C ניסויים יכול בהצלחה להתבצע באמצעות מבחר רחב של אנזימי הגבלה5. לגישות בדרך כלל להשתמש אנזימים מזהה גם 4-בסיס רצף של, כגון MboI, או אתר בסיס 6 זיהוי, כגון HindIII. היתרון של בסיס 4 חותכני על בסיס 6 חותכני הוא בכך שהם מציעים פוטנציאליים ברזולוציה גבוהה יותר, נתון מספיק עומק רצף, כיסוי אפילו יותר של הגבלת אתרים ברחבי הגנום. יש אין יתרון ברור בבחירת אחד חותך 4-בסיס מעל עוד5,23,36,37. שני אנזימים הנפוצות ביותר, MboI, DpnII, שניהם מזהה זיהוי GATC באותו האתר. DpnII הוא פחות רגישים CpG מתילציה, אשר לא יהווה בעיה בדרוזופילה. פרוטוקול המובאות כאן ניתן גם בהצלחה להשלים באמצעות DpnII כמו באנזים הגבלה. בסעיף 4.2. אנזים הגבלה מאגר יש יותאם לתאימות DpnII, על פי ההמלצות של היצרן.
אם גודל המקטע של הספרייה רצף סוטה משמעותית מהטווח המוצג באיור 2A, היווצרות אשכול במהלך רצף עשוי להיות פחות יעילה, או לכשל מוחלט. במקרה זה, יש לבדוק את התפלגות גודל לאחר הטיה, הטיית פרמטרים מותאמים בהתאם. פסגות בתחום ההפצה של שברי DNA של קטן מאוד (< 100 bp) או גדולים מאוד (> 1,000 bp) גדלים מעיד על בעיות עם בחירת גודל, כגון לשאת מעל של חרוזים או תגובת שיקוע שאמורים להיות מושלך. לעיתים קרובות ספריות אלה עם שיאים קטנים בגדלים האלה לא רצויים, כגון עדיין הם בתמונה, אחד רציף בהצלחה רק ירידה קטנה במספר אשכולות יעילות.
שיעור גבוה של שכפול PCR להימנע בגלל זה מפחית במידה רבה את מספר הקריאות רצף שמיש. הקצב של PCR כפילויות קשורה ישירות כמות החומר קלט. באמצעות קלט יותר ולכן בדרך כלל מקלה על בעיות עם שכפול ה-PCR.
המספרים גבוהים יותר הקריאות מסוננים בגלל כיוון קריאהלהבין 2B) (מציינים מספיקים לעיכול, אשר יכול להיות התוצאה של באמצעות אנזים מעט מדי, יותר מדי קלט חומר או המגון לא שלם של העוברים.

לכידת קונפורמציה כרומטין (3 ג) התפתחה שיטה שימושית במיוחד כדי לחקור את הטופולוגיה של כרומטין גרעין1. הגרסה 3 ג ויטמינצ'יק מאפשרת מדידה התדרים קשר של כל האינטראקציות כרומטין שמתרחשות בגרעין ניסוי יחידה2. יישום של ויטמינצ'יק שיחק תפקיד חשוב הגילוי, אפיון רבים עקרונות היסוד של ארגון כרומטין, כגון TADs, תאים לולאות3,4,5.
לימודי האדריכלות כרומטין בהקשר של מעברים התפתחותיים ובידול תא משמשים יותר ויותר כדי לחשוף את המנגנונים של הכונה במהלך אלה תהליכים6,7,8, 9. אחד האורגניזמים דגם עניין רב הוא דרוזופילה melanogaster, הגנום ופיתוח אשר מאופיינים היטב. עם זאת, מחקרים מעטים לחקור אדריכלות כרומטין דרוזופילה מחוץ במבחנה תרביות רקמה הגדרות כבר ערכו10,11. עוברי 16 – 18 h שלאחר ההפריה, TADs, תאים מזכיר מבנים דומים אצל יונקים היו מזוהה10, אשר מעלה השאלה של איזה תפקיד הם משחקים בהכונה במהלך דרוזופילה העובר פיתוח. במיוחד בשלבים המוקדמים של פיתוח, לפני gastrulation, מחקרים כאלה הן מבחינה טכנית מאתגר. לפני gastrulation, עוברי דרוזופילה עוברים 13 דיביזיות גרעיני סינכרונית להמשיך בקצב מסחרר של 8 – 60 דקות לכל מחזור12,13. בנוסף לכך, חוסר של תכונות חזותיות כדי להבחין בין השלבים השונים להקשות להשיג חומר העובר בשלבים בחוזקה בכמויות מספיקות.
כדי לפתח פרוטוקול המאפשר ללמוד אדריכלות כרומטין בהתפתחות המוקדמת דרוזופילה ברזולוציה מחזור גרעינית, שילבנו בין שתי שיטות קיימות: בחיי עיר Hi-C, אשר מאפשר את הדור של רזולוציה גבוהה כל הגנום מפות קשר5ו- staging העובר באמצעות שורת דרוזופילה הטרנסגניים לבטא13,transgene14eGFP-PCNA. Transgene זו רגישה את הגרעין במהלך לאטמוספרה, והוא מפזר לאורך blastoderm syncytial במהלך מיטוזה. באמצעות מאפיין זה, אפשרי להבחין בקלות שלבים שונים על ידי צפיפות גרעינית שלהם ואת mitotic העוברים על ידי הפיזור של אות ה-GFP.
יחד, טכניקות אלה מאפשרות לימוד מבנה תלת ממדי של כרומטין ברזולוציה גבוהה מגם עוברי דרוזופילה 20 בהיקף. פרוטוקול זה כולל את ההוראות קציר ומיון עוברי דרוזופילה להשיג אוכלוסיות של העוברים של מחזור מחטיבה גרעיני. בהמשך מתאר כיצד העוברים שהושג משמשות לביצוע בחיי עיר היי-סי התוצאה הסופית היא ספריית נוקלאוטיד מתאים רצף על מכונות רצף ' הדור הבא '. ואז ניתן לעבד את קריאות רצף שנוצר לתוך מפות אינטראקציה עם כרומטין מפורטת המכסה את כל הגנום דרוזופילה .

<table><tbody><tr><td>ביוטין-14-dATP</td><td>Life Technologies</td><td>19524016</td><td></td></tr><tr><td>MboI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0147L</td><td></td></tr><tr><td>DNA פולימראז I Klenow Fragment</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher</td><td>EL0012</td><td>T4 DNA Ligase Buffer כלול</td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>AppliChem</td><td>A4392</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז מלאים ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext אוליגוס מולטיפלקס עבור Illumina&nbsp;( סט פריימרים לאינדקס 1)</td> <td>מתאם ריצוף של New England Biolabs</td><td>E7335</td>, <td>פריימר PCR קדימה (לא באינדקס) ופריימר PCR הפוך (אינדקס) ואנזים USER המשמשים בסעיף הכנת הספרייה הם מרכיבים של ערכה זו</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לספריית ה-DNA NEBNext Ultra II New</td><td>England Biolabs</td><td>E7645</td><td>תערובת אנזים להכנה סופית, מאגר תגובה להכנה סופית, משפר קשירה, תערובת מאסטר קשירה ותערובת מאסטר פולימראז המשמשים בסעיף הכנת הספרייה הם רכיבי ערכה זו</td></tr><tr><td>Covaris S2 AFA System</td><td>Covaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030108051</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאי פלקון 100 ומיקרו; m</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>סלי איסוף עוברים</td></tr><tr><td>37% פורמלדהיד</td><td>VWR</td><td>437536C</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>AppliChem</td><td>122062.1612</td><td></td></tr><tr><td>M165 FC מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M165 FC מצלמת DFC</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתכת מיקרו עלי</td><td>קארל רוט</td><td>P985.1</td><td>משמש לליז עוברים ב שלב 4.1.4</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>AppliChem</td><td>A3832,0050</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65002</td><td>חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין</td></tr><tr><td>Ampure XP חרוזים</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 3.0 פלואורומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>צינורות בדיקת קיוביט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקה של Qubit dsDNA HS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>eGFP-PCNA זבובים</td><td>מתנה מ- S. Blythe ו- E. Wieschaus</td> נתרן היפוכלוריט <td></td><td></td></tr><tr><td>13%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) לביולוגיה מולקולרית</td><td>AppliChem</td><td>A4577</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>Greiner Bio-One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>SDS לביולוגיה מולקולרית</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>10x CutSmart buffer</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B7204S</td><td>מאגר אנזים הגבלה</td></tr><tr><td>PCR תערובת נוקלאוטידים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>11814362001 dCTP ללא שינוי, dGTP, dTTP</td></tr><tr><td>BSA, כיתה ביולוגיה מולקולרית ניו</td><td>אינגלנד Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M פתרון לביולוגיה מולקולרית</td><td>AppliChem</td><td>A4892</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט 3 M pH 5.2</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>מעמד מגנטי</td></tr><tr><td>Intelli-Mixer RM-2L</td><td>Omnilab</td><td>5729802</td><td>Rotator</td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td>מיקסר</td></tr><tr><td>כלובי איסוף עוברים קטנים</td><td>Flystuff.com</td><td>59-100</td><td>כלוב איסוף ביצים</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5424&nbsp; R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000413</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>רצועות צינור PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673275</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td>T4 DNA Polymerase buffer</td></tr></tbody></table>

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

חוקרים את הארכיטקטורה תלת מימדי של כרומטין מציע תובנה מנגנוני הכונה שלא יסולא בפז. כאן, אנו מתארים עבור ביצוע ה כרומטין קונפורמציה לכידת טכניקה בחיי עיר ויטמינצ'יק על פרוטוקול מבוים דרוזופילה melanogaster העובר אוכלוסיות. התוצאה היא ספריה רצף המאפשר את המיפוי של כל האינטראקציות כרומטין שמתרחשות בגרעין בניסוי יחיד. עובר מיון נעשית באופן ידני באמצעות סטריאו מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וקו לטוס הטרנסגניים המכילה סמן גרעינית. ניתן להשיג באמצעות טכניקה זו, העובר אוכלוסיות של כל מחזור החטיבה גרעינית, ועם מצב מוגדר מחזור התא, עם טוהר גבוהה מאוד. הפרוטוקול עשוי גם להיות מותאם כדי למיין בוגרים עוברי מעבר gastrulation. העוברים מיון משמשים כקלט בחיי עיר היי-סי כל הניסויים, לרבות קביעת רצף ספריית הכנה, יכולה להסתיים בעוד חמישה ימים. הפרוטוקול יש דרישות הקלט נמוך ועובד בצורה אמינה באמצעות 20 blastoderm שלב עוברי כחומר קלט. התוצאה הסופית היא ספריית רצף עבור רצף הדור הבא. לאחר רצף, ניתן לעבד את הנתונים לתוך הגנום כולו כרומטין אינטראקציה עם מפות מסוגל לנתח באמצעות מגוון רחב של כלים זמינים כדי לקבל מידע לגבי topologically שיוך מבנה קבוצת המחשבים (טד) כרומטין לולאות, כרומטין תאים במהלך הפיתוח דרוזופילה .

מיון אוכלוסיות העובר-גרעיני מחזור 12, 13, ו 14 (המקביל ל- 1:30, 1:45, 10:2 שעות פוסט הפריה, בהתאמה12) ו- 3-4 h פוסט הפריה (hpf) התקבלו על-פי ההליכים המתוארים בפרוטוקול. על ידי לקיחת תמונות של האות eGFP-PCNA של כל אצווה עובר מיון, זה ניתן לתעד את שלב ומצב מחזור התא מדויק של כל עובר יחיד המשמש בניסויים במורד הזרם. תמונות דוגמא של העוברים של אוכלוסיות ממוינים מוצגים איור 1B-E. הפלט של פרוטוקול ויטמינצ'יק בחיי עיר היא ספריית נוקלאוטיד מוכנים להיות וסודרו על מכונות רצף ' הדור הבא '. למטרה זו, ריכוז ספריית הסופי לפחות 2 – 4 nM נדרש בדרך כלל. באמצעות את הכמויות המומלצות של חומר קלט, הריכוז הזה היא אמינה מושגת (טבלה 1).
התפלגות גודל הצפוי של מקטעי דנ א לאחר גודל הבחירה היא בין 300-600 bp, עם מקסימום כ-500 bp (להבין 2A), בהתאם אמש המדויק ופרמטרים בחירת גודל. עבור רצף, אנו ממליצים לזווג-end קריאות לפחות 75 אורך bp כדי לצמצם את מספר קטעים הגבלת שאינו ניתן למיפוי הגנום. ניתן להשיג מפות ברזולוציה גבוהה עם 1-2 kb סל בגודל 400 מיליון קריאות. אנו ממליצים על קביעת רצף משכפל ביולוגי מרובים בעומק התחתון של 150 מיליון ~ קורא אחד, במקום רצף של שכפול יחיד בעומק גבוהה מאוד. זה מאפשר הערכה של וריאציית ביולוגי ומוביל מספר נמוך יותר של קריאות שנמחקו עקב כפילות PCR. לייצוג חזותי, משכפל יכול להיות משולב. לפני שתתחייב על רצף מדגם בעומק גבוהה, מומלץ לרוץ דגימות באמצעות רצף רדוד (כמה קריאות מיליון עבור דגימה) כדי לקבוע מדדי איכות ספריית בסיסיים כמו דמות 2B.
ניתוח של נתוני ויטמינצ'יק דורש מומחיות ומשאבים ביואינפורמטיקה חישובית משמעותית. כמו מבט קשוח, קריאות לזווג ממופים באופן עצמאי הגנום הפניה, במערכים וכתוצאה מכך הסינון של איכות, התמצאות, ואז מטריצה של אנשי קשר ברמה הרזולוציה, או קטע נתון סל יכול להיווצר מן מסוננים היישורים. המטריקס קשר היא הבסיס לניתוח כל עוד יותר במורד הזרם, חקר TADs, לולאות, תאים. עבור הניתוח הראשוני הקריאות רצף, מספר צינורות ביואינפורמטיקה זמינים המאפשרים עיבוד הקריאות גולמיים לתוך מטריצות קשר בלי הרבה ביואינפורמטיקה מיוחדים ידע18,19, 20,21,22,23. כיצד מתבצע ניתוח נוסף אאוט תלויה במידה רבה השאלה ביולוגי מדויק שנבחנה, וייתכן שיידרשו ניסיון משמעותי תכנות ו- scripting R או פיתון. עם זאת, מספר כלים ואלגוריתמים להתקשר TADs הם זמינים5,24,25,26,27,28, וכן תוכנה לניתוח, סקור נתונים ויטמינצ'יק בדפדפן האינטרנט וכן יישומי שולחן עבודה עצמאית29,30,31,32.
לאחר עיבוד, האיכות של הספרייה ניתן לקבוע באמצעות מדדים אחרים (איור 2B). ראשית, הקצב של PCR כפילויות, המהווה מספר זוגות קריאה ברצף הנובעים אותה המולקולה המקורי, צריך להיות נמוך ככל האפשר להגביל את כמות קריאות רצף מבוזבז. עם זאת, גם ספריות עם &gt; שכפול PCR 40% יכולים להיות מעובדים לתוך מפות קשר איכותי אם הכפילויות מסוננים. שנית, קצב הקריאות מסוננים בשל האוריינטציה שלהם, כפי שמתואר4, באופן עקבי להיות נמוך יותר מ-10% של זוגות קריאה מיושר.
במהלך פיתוח מראש gastrular דרוזופילה בין מחזור גרעיני 12 ו 14, הארכיטקטורה גרעינית היא שופצה באופן דרסטי33 (איור 3). -גרעיני מחזור 12, TADs כמה מזוהים, ההתפלגות הכוללת של הקשר היא מאוד חלקה ללא תכונות רבות ניכרת. זה באופן דרמטי השתנה-מחזור גרעיני 13 ו-14, כאשר TADs בולטות יותר ויותר קשרים ארוכי טווח לא ספציפי מתרוקנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> איור 1: נציג תמונות של eGFP-PCNA העוברים במהלך מיון. (א) eGFP-PCNA האיתות אוכלוסיה ממוינת של העוברים לאחר 60 דקות ואוסף הדגירה 2 h ב- 25 ° C (B-E) דוגמאות העוברים של אוכלוסיות ממוינות על הגרעין מחזור 12 (B), גרעיני מחזור 13 (ג), (14 מחזור גרעינית D), מן העוברים עוברים מיטוזה סינכרונית (E). גודל ברים = 200 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> איור 2: דוגמאות בחיי עיר ויטמינצ'יק מדדי איכות הספרייה. Bioanalyzer (א) עקבות מציג את ההתפלגות בגדלים מקטע DNA מספריית ויטמינצ'יק מוצלחת (ספריית 1, העליון) וממנו ספריה מציגה לשיא של קטעים גדולים מדי עבור רצף (ספריית 2, למטה). ספריית 2 היה רציף בהצלחה, אך כמויות גדולות יותר ואפילו שברי DNA רצויה עלול להוביל רצף ירד התשואות. (B) סינון נתונים סטטיסטיים של שתי ספריות ויטמינצ'יק: המוצג הוא מספר זוגות קריאה מיושר שאינם נכללים בין ניתוח נוסף בשל קריאה כיוון ומרחק (פנימה, כלפי חוץ)4 או שכפול ה-PCR (כפולים). כל בר, מותווים מספר קריאות עובר את המסנן (שנותרו) ולהיכשל (מסונן). האחוז של קריאות עובר את המסנן בנוסף מוצג כטקסט. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> איור 3: שלום-C אינטראקציה מפות מעוברים בשלבים. מפות-C אינטראקציה מנופה ברזולוציה 10 kb, מאוזן כפי שתואר לפני33. המוצג הוא אזור בכרומוזום 2 ל' <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>הספרייה</td>
			<td>הבמה</td>
			<td>מספר העוברים</td>
			<td>כמות ה-DNA לפני הטיה (ng)</td>
			<td>PCR מחזורים</td>
			<td>ספריית הסופי ריכוז (אן אם)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>גרעיני מחזור 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>גרעיני מחזור 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>גרעיני מחזור 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>גרעיני מחזור 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>גרעיני מחזור 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>גרעיני מחזור 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>גרעיני מחזור 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>גרעיני מחזור 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>גרעיני מחזור 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: רשימת רצפי נציג ספריית סטטיסטיקה. עבור כל ספריה ברשימה, מספר העוברים ששימשו עבור הדור שלה, כמות ה-DNA הכולל לפני הנפתח ביוטין ו הטיה נמדדת קיוביט, המספר של ה-PCR מחזורי להשתמש הגברה של הריכוז הסופי של הספרייה רצף לאחר טיהור ובחירת גודל מצוינים.

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ארכיטקטורת הכרומטין כגון כיצד המבנה 3D של כרומטין יכול להשפיע על ביטוי גנים ופיתוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תצוגה ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת כרומטין ועוברים זבוב מבוים במדויק. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך ארגון כרומטין ופיתוח, אפשר גם להשתמש בקווים קיימים מספריות זבוב מהודק כדי לבדוק את השפעתם בארגון כרומטין.כדי להתחיל את הפרוטוקול, התאם את הנפח הכולל של עוברים שנאספו בעבר לשני מיליליטר עם PBST. הוסיפו שישה מיליליטר של הפטאן ו-100 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד במים. לאחר הוספת פורמלדהיד, לנער במרץ את הצינור למעלה ולמטה במשך דקה אחת.השלב הממימי וה האורגני ישתלב כדי ליצור עקביות דמוית שמפו. להתסיס את התערובת על מערבל סיבובי במשך 10 דקות. צנטריפוגה הצינור ב 500 פעמים g במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף עוברים בתחתית הצינור.שאפו את כל הנוזל דמוי השמפו והשליכו אותו, ודאגו לא לשאף עוברים. 15 דקות לאחר הוספת פורמלדהיד, להשתמש מחדש את העוברים בחמישה מיליליטר של PBST עם 125 מילימולר גליצין. לנער את העוברים למעלה ולמטה במרץ במשך דקה אחת.לאחר צנטריפוגה, שאף את העל-טבעי. באמצעות פיקט 1,000 מיקרוליטר, להעביר קבוצה של 100 עוברים לכלי זכוכית קטן מתאים למיון, רצוי על רקע כהה למקם אותו על קרח. מיין עוברים לפי צפיפות גרעינית ומעמד מחזור התא באמצעות מחט או קצה מזרק.הסר את כל העוברים המיטוטיים הניתנים לזיהוי על ידי ההפצה המפוזרת שלהם, הלא גרעינית של EGFP PCNA ועוברים שמבינים חלקית אות GFP לא גרעיני. כדי לסייע במיון, יש לסדר את עוברי הייחוס במחזורים הגרעיניים 12, 13 ו-14 בכל אצווה כדי להתאים עוברים לאחד העוברים המוזכרים. פיפטה את העוברים הרצויים באמצעות פיפסת 1,000 מיקרוליטר.מעבירים אותם לצינור טרי ומ מניחים אותם על קרח. המשך עד שיימוינו מספיק עוברים לניסוי המתוכנן. צינורות ספין לזמן קצר ב 100 פעמים g בטמפרטורת החדר.מוציאים את העל-טבעי ומבטיחים שהעוברים יבשים ככל האפשר להקפאה. פלאש להקפיא עוברים על ידי שקוע הצינורות בחנקן נוזלי ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות עם עוברים קפואים על קרח.תן לעוברים 500 מיקרוליטרים של חיץ תזה קרה כקרח. המתן דקה אחת כדי לאפשר לעובר להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן, טוחנים את העוברים עם עלה מיקרו מתכת מקורר מראש על קרח שנועד להתאים בחוזקה צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.כדי למנוע תסיסה העוברים, להכניס את העלי לאט עד שהוא נוגע בחלק התחתון של הצינור. לדחוף למטה ולאחר מכן לטחון על ידי סיבוב העלי פעמיים בשני הכיוונים. הרם את העלי מעט מאוד.לדחוף לתחתית הצינור שוב ולחזור על הליך שחיקה 10 פעמים או עד העוברים הם lysed לחלוטין. הפתרון צריך להיות הומוגני ולא שאריות חתיכות גדולות של עוברים צריך להישאר. להדגירה את ההשעיה הומוגנית על קרח במשך 15 דקות.סובב ב 1,000 פעמים 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי ושטפו את גלולת הכדור על-ידי שימוש חוזר במאגר תזה קר כקרח של 500 מיקרוליטר וצנרת למעלה ולמטה. לאחר ספין נוסף, השלך את העל-טבעי.תחוו מחדש את גלולת השטוף ב-100 מיקרוליטרים של 0.5% נתרן דודצ'ל סולפט או SDS. ואז לחלחל הגרעינים על ידי דגירה המדגם במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 10% טריטון X100 ו-120 מיקרוליטר מים.מצליפים בצינור כדי לערבב את התוכן ולהדיר את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בבלוק חום. הוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר אנזימים הגבלה 10X ו 20 יחידות של חמש יחידות לכל MBO1 microliter. החלק את הצינור כדי לערבב את התוכן ולהדגיר את הצינור בבלוק חום כדי לעכל את ה- DNA.הוסף עוד 20 יחידות של MBO1. ממשיכים את הדגירה במשך 90 דקות. לאחר הדגירה השנייה של 90 דקות, הדגירה את המדגם ב 62 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי לא פעיל MBO1.לאחר מכן, להוסיף 18 microliters של 0.4 מילימולרית ביוטין 14-dATP, 2.25 microliters של 3.3 מילימולרית dCTP-dGTP-dTTP לערבב, ושמונה microliters של חמש יחידות לכל שבר פולימראז DNA microliter אני Klenow. מצליפים בצינור כדי לערבב את התוכן ולהדגר את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. לאחר מכן, להוסיף 657 microliters של מים, 120 microliters של 10X T4 מאגר ליגות DNA, 100 microliters של 10% טריטון X100, שישה microliters של 20 מיליגרם לכל אלבומין סרום מיליליטר, ולבסוף חמישה microliters של חמש יחידות לכל רצועות DNA Microliter T4.לאחר מכן, סובבו את הצינור בעדינות במהירות של 20 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. הוסף עוד חמישה מיקרוליטרים של חמש יחידות לכל רצועות דנ"א T4 מיקרוליטר. המשך להסתובב במשך שעתיים נוספות, ולאחר מכן לסובב את הגרעינים ב 2, 500 פעמים גרם במשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה, השלך את העל-טבעי. תוסיפו את גלולת ה-500 מיקרוליטר של חיץ החילוץ ותוסיפו 20 מיקרוליטר של 20 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K.Flick הצינור ותדקר את הצינור כדי לעכל את החלבון. מוסיפים 130 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן ודגירה בן לילה כדי לבטל crosslink.למחרת, פיפטה המדגם לתוך צינור חדש שני מיליליטר עם מאפייני קשירה DNA נמוך. הוסף נפח 0.1X של שלושה אצטט נתרן טוחן ושני microliters של 15 מיליגרם למיליליטר GlycoBlue. מוסיפים 1.6 כרכים של אתנול מוחלט טהור והפוך את התוכן, ואז להדגיר את המדגם במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לאחר הדגירה, צנטריפוגה התוכן. אתר את גלולת ה- DNA אשר ניתן לאתר רק על ידי GlycoBlue. הסר את העל-טבעי בזהירות, והזז את קצה הפיפט לתוך הצינור לאורך הקיר הנגדי מגליעת הדנ"א.לשטוף את גלולה עם 800 microliters של 70% אתנול. מערבבים את המדגם על ידי היפוך וצנטריפוגה אותו ב 20, 000 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. הסר טיפות שנותרו במהלך שלב זה ואת הכביסה הבאה על ידי דחיפת אותם מתוך הצינורות עם קצה P10, ולאחר מכן לפתוח את המכסה לאוויר יבש עד חמש דקות.ברגע שאין נוזל נשאר, להוסיף 50 microliters של 10 מילימולר טריס כלוריד. שוב ושוב pipette הפתרון על האזור שבו גלולה היה ממוקם כדי לבודד את ה-DNA. הוסף מיקרוליטר אחד של 20 מיליגרם למיליליטר RNase A.Mix על ידי הפלת הצינור.הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לעכל RNA. לבסוף, לאחסן את המדגם במקפיא או במקרר עד הכנת הספרייה. תמונות של אות PCNA EGFP של כל אצווה עובר ממוין לחשוף שלב מדויק סטטוס מחזור התא של כל עובר בודד לניסויים במורד הזרם.עקבות Bioanalyzer מראות כי התפלגות הגודל של שברי DNA לאחר בחירת גודל היא בין 300 ל 700 זוגות בסיס עם מקסימום בסביבות 450 זוגות בסיס. מפות אינטראקציה Hi-C מראות כי במחזור הגרעיני 12, כמה תחומים או TADs הקשורים טופולוגית מזוהים אשר משתנה באופן דרמטי במחזורים גרעיניים 13 ו 14 כאשר TADs בולטים יותר ויותר ואנשי קשר ארוכי טווח לא ספציפיים מתרוקנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשטוף את חרוזים ביסודיות ולא להאריך את זמני הדגירה שלא לצורך במיוחד בטמפרטורות גבוהות מאז זה יכול להוביל ספריות באיכות נמוכה Hi-C.טכניקה זו המשלבת בימוי מדויק ומיפוי אישור כרומטין ברזולוציה גבוהה סללו את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה לחקור את תפקידו של ארגון כרומטין תלת מימדי בסביבה התפתחותית in vivo.

generation-genome-wide-chromatin-conformation-capture-libraries-from

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.

הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים

לאחרונה תפוקה גבוהה טכנולוגיית ריצוף גדלה מאוד הרגישות של הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הניסוי מתבקש יישומו באמצעות תאים או רקמות גזור מטוהרים. כאן אנו קובעים שיטה להשתמש בטכניקה שבב...

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות תסיסנית רקמה

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

פרוטוקול זה מתאר את שיטת Capture Hi-C המשמשת לאפיון הארגון התלת-ממדי של אזורים גנומיים ממוקדים בגודל מגה-מבוסס ברזולוציה גבוהה, כולל גבולות של תחומים משויכים טופולוגית (TADs) ואינטראקציות כרומטין ארוכות טווח בין אלמנטים רגולטוריים ורצפי DNA אחרים.

פענוח ארגון כרומטין תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה באמצעות לכידת Hi-C

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תיוג גנים אנדוגני פשוט עבור דרוזופילה, המשתמש בטכניקה מבוססת PCR לזיהוי ללא סמנים של שינויים גנטיים מוצלחים, מה שמקל על פיתוח קווי דפיקה יציבים.

אסטרטגיה מבוססת CRISPR בצעד אחד לתיוג גנים אנדוגניים בדרוזופילה מלנוגסטר

למד ליצור ספריות Hi-C ברזולוציה גבוהה מעוברי Drosophila melanogaster בשלבים מוקדמים. שיטה זו מאפשרת חקר ארכיטקטורת כרומטין והשפעתה על ביטוי גנים בהתפתחות.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

גלה סרטונים נוספים