כרומטין יליד Immunoprecipitation באמצעות המוח מאתר הגידול Neurospheres
29 בינואר 2018
מנגנוני epigenetic משתנים לעתים קרובות ב glioma. כרומטין immunoprecipitation יכול לשמש כדי לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים ב glioma הנובעות משינויים שינויים היסטון המסדירה שעתוק גנים ומבנה כרומטין. פרוטוקול זה מתאר כרומטין יליד immunoprecipitation על המוח מאתר הגידול neurospheres.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות את העשרת סימני ההיסטון במיקום גנומי ספציפי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון כיצד מוטציות בווסתים אפיגנטיים המשנים שינויים בהיסטון משפיעות על תעתיק תאי הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים אינם מקושרים, ולכן הם נמצאים במצב טבעי יותר, מה שיכול לסייע לספציפיות הנוגדנים.
התחל בניתוח הגידול המושרה בניסוי ממוחו של עכבר בצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטרים. אם הגידול מבטא חלבון פלואורסצנטי, דמיין את הגידול באמצעות מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי המכוון לתעלה הפלואורסצנטית המתאימה בהגדלה של פי 0.3. השתמש באזמל ובמלקחיים כדי להפריד את רקמת הגידול מהמוח הרגיל, וטחון את הגידול לחתיכות קטנות בצלחת הפטרי
.העבירו את הגידול המנותח לצינור של 1.5 מיליליטר עם 300 מיקרוליטר של מדיום NSC, והשתמשו במזרק חד פעמי כדי להומוגניזציה עדינה של הגידול. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום ניתוק תאים, ודגר את הדגימה למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.
לאחר מכן, שטפו את המסננת עם 25 מיליליטר מדיום NSC וצנטריפוגה את המתלה ב -300 פעמים G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סילוק הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה בשישה מיליליטר של מדיום NSC והעבירו את תרחיף תאי הגידול לבקבוק תרבית T25. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמה עם אטמוספירה של 95% אוויר ו-5% פחמן דו חמצני עד להיווצרות נוירוספרות.
לאחר קצירת הנוירוספרות, צנטריפוגה אחת כפול 10 לששת תאי הנוירוספרה לכל משקע אמינו ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את כדור הנוירוספירה במיליליטר אחד של תמיסת מלח מאוזנת. העבירו את התרחיף לצינורות מיקרו צנטריפוגה נמוכים של 1.5 מיליליטר ואז צנטריפוגה כמו קודם.
לאחר מכן, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-95 מיקרוליטר של מאגר עיכול, הוסיפו אחד ל-100 עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכל אחד כפול 10 ששת התאים. פיפטה מיד את התאים למעלה ולמטה כדי למנוע גושים ולהימנע מיצירת בועות. לאחר מכן, ערבבו חמישה מיקרוליטרים של נוקלאז מיקרוקוקלי 0.1X ב-145 מיקרוליטר של מאגר עיכול והוסיפו חמישה מיקרוליטרים של מיקרוקוק נוקלאז מדולל לכל אחד כפול 10 לששת התאים.
העבירו את הצינור כדי לערבב והניחו את הצינור בגוש חום של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות בדיוק. עיכול הנוקלאז המיקרוקוקלי לפיצול כרומטין הוא השלב הקריטי ביותר. פיצול כרומטין נכון חשוב להשגת רזולוציה גבוהה עבור ChIP.
כדי להבטיח שהשלב יצליח, דגרו מספר דגימות אחת בכל פעם כדי להבטיח שלא יתרחש עיכול יתר. לאחר 12 דקות, הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר עצירה של נוקלאז מיקרוקוקלי פי 10 לכל אחד כפול 10 לששת התאים. יש לשמור דגימות על קרח מנקודה זו ואילך.
ניתוח ביו-אנלייזר של הדגימה המעוכלת של נוקלאז מיקרוקוקלי מדגים שרוב ה-DNA פוצל למונו, די וטרי-נוקלאוזומים. לאחר מכן, הוסף 110 מיקרוליטר של מאגר ריפה 2X בתוספת אחד ל-100 עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכל אחד כפול 10 לששת התאים. העבירו את הצינור לערבוב, ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב-1700 פעמים G.העבירו את הסופרנטנט המכיל את הכרומטין לצינור מיקרו צנטריפוגה רגיל של 1.5 מיליליטר, והניחו על קרח.
השתמש במאגר ריפה בתוספת מעכבי פרוטאז באחד עד 1000 כדי לדלל את הכרומטין, כך שלכל IP יהיה נפח של 100 עד 200 מיקרוליטר. לאחר מכן, הסר ציטוט שווה ערך ל-10% מאמצעי האחסון ChIP כדוגמת הקלט. הכן את הקלט על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר TE בתוספת חלבון K, ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לאחר טיהור הקלט עם ערכת טיהור PCR, מדוד את ריכוז הקלט באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח. רשום את התוצאות במחברת. הוסיפו 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של חלבון שטופים A ו-G לכל IP שיבוצעו על כל דגימה, ודגרו במשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד.
הנח את הדגימה על מחזיק מגנטי ואפשר לחרוזים להיפרד, ולאחר מכן העביר את הנפח הנדרש לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. הוסף את הנוגדן הרצוי לכל צינור ולאחר מכן עטוף את המכסים בסרט פרפין מפלסטיק כדי למנוע אידוי. דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב כמו קודם.
למחרת, סובבו את הצינורות ב-2000 פעמים G למשך 10 שניות, ואז הוסיפו 10 מיקרוליטר חרוזים לכל IP ודגרו במשך 3 שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים המגנטיים להיפרד. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט, ולאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ ריפה עם מעכבי פרוטאז לכל IP ודגר ב-4 מעלות צלזיוס ב-20 סל"ד למשך חמש דקות.
לאחר תקופת הדגירה, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים המגנטיים להיפרד. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט, ולאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ ליתיום כלוריד בתוספת מעכבי פרוטאז בריכוז נמוך לכל IP, ודגירה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר תקופת הדגירה, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים המגנטיים להיפרד, ואז השתמשו בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט.
לאחר מכן, הוסיפו לחרוזים 150 מיקרוליטר TE קר ללא מעכבי פרוטאז, ודגרו ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך חמש דקות. לאחר שלב הכביסה האחרון, יש להשהות מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE בתוספת הריכוז הסופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז K, ולדגור בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה. לבסוף, טהר את ה-DNA המשקע אמינו באמצעות ערכת טיהור PCR.
לאחר מכן, כדי לבדוק אם ה-IP מצליח, בצע qPCR עם פריימרים הממוקדים לאזורי בקרה חיוביים ושליליים. qPCR בוצע עם IGG ChIP DNA, היסטון-3-ליסן-4-טרימתילציה ChIP DNA והיסטון-3-ליסן-27-טרימתילציה ChIP, תוך שימוש בפריימרים לגליצרלדהיד-3-פוספט-דהידרוגנאז. תוצאות מייצגות מראות כי Gapdh, גן משק בית, מועשר רק בשינוי H3K4me3 הקשור לשעתוק פעיל, ולא בשינוי H3K27me3 הקשור לכרומטין מודחק.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ChIP-C על מנת לזהות שינויים בסימני היסטון, בכל הגנום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ChIP מקורי בנוירוספרות כדי לזהות סימן היסטון באתרי גנים ספציפיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לבחינת שינויים אפיגנטיים בגליומה באמצעות שיקוע חיסוני של כרומטין טבעי (native chromatin immunoprecipitation). באמצעות ניתוח של מודיפיקציות להיסטונים, חוקרים יכולים להפיק תובנות לגבי השפעתן של מוטציות גנטיות על שעתוק גנים בתאי גידול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אפיגנטיקה
- אונקולוגיה
רקע
- מנגנונים אפיגנטיים מופרים לעיתים קרובות בגיליומה.
- מבנה הכרומטין ושעתוק הגנים מוסדרים על ידי מודיפיקציות של היסטונים.
- הבנת שינויים אלו יכולה לספק תובנות לגבי הביולוגיה של הגידול.
- שיטה זו מאפשרת לחקור גידולים במצב טבעי יותר.
מטרת המחקר
- זיהוי העשירה של סימני היסטון במיקומים גנומיים ספציפיים.
- בדיקה כיצד מוטציות ברגולטורים אפיגנטיים משפיעות על התראנסקריפטום של תאי גידול.
- שימוש בטכניקה השומרת על שלמות התאים לצורך שיפור הספציפיות של הנוגדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של נוירוספרות מגידולי מוח של עכברים.
- ויזואליזציה של רקמת הגידול באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- הפרדת רקמת הגידול מרקמת מוח נורמלית.
- קיצוץ הגידול לחלקים קטנים לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מודיפיקציות היסטון ספציפיות הקשורות לגליומה.
- תובנות לגבי תפקידן של שינויים אפיגנטיים בהתקדמות הגידול.
- הדגמה של יעילותה של שיטת שיקוע חיסוני של כרומטין טבעי.
- השלכות פוטנציאליות עבור טיפולים ממוקדים בטיפול בגליומה.
מסקנות
- שיקוע חיסוני של כרומטין טבעי (Native chromatin immunoprecipitation) הוא כלי בעל ערך למחקר של גליומה.
- הבנת מודיפיקציות של היסטונים יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות.
- שיטה זו משפרת את הספציפיות של אינטראקציות הנוגדנים עם הכרומטין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שיקוע חיסוני של כרומטין במצבו הטבעי (Native ChIP) בתוך נוירוספירות של גידולי מוח עכבריים מאפשר מיפוי מדויק של מודיפיקציות היסטונים באתרים גנומיים ספציפיים, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של גילוי אונקולוגי. על ידי שימור המצב הטבעי של הכרומטין, שיטה זו משפרת את ספציפיות הנוגדנים ומספקת תובנות רלוונטיות יותר מבחינה ביולוגית לגבי בקרה אפיגנטית במודלים של גליומה. יכולות אלו הן קריטיות לתיקוף מטרות ולסיוע בקבלת החלטות מותאמות-סיכון בניהול פורטפוליו במחקר ופיתוח בתחום הנוירו-אונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של העשרה של סימני היסטון באloci של גנים הרלוונטיים למחלה במודלים של גידולים סרטניים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של רגולטורים אפיגנטיים המעורבים בפתוגנזה של גליומה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור מצב הכרומטין לשינויים בביטוי גנים.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות אפיגנטיות בנתיבי פיתוח אונקולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זרימת עבודה (workflow) מתוּקפת להכנת כרומטין המופק מנוירוספירות עבור בדיקות שיקוע חיסוני (immunoprecipitation).
- מספק תוצריים כמותיים באמצעות qPCR להערכת העשרה של מודיפיקציות היסטון באזורי בקרה ובאזורי מטרה.
- מאפשר הערכה הדירה של ספציפיות הנוגדנים וביצועי הבדיקה בהקשרי כרומטין טבעיים.
- תומך בהתאמה לשלבים הבאים עבור פלטפורמות סריקה מבוססות ChIP בקנה מידה גנומי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין פרופילי מודיפיקציה של היסטונים לבין ביטוי גנים הרלוונטי למחלה במודלים פרה-קליניים של גליומה.
- מאפשר רציפות מממצאי אפגנטיקה בשלב הגילוי ועד לתיקוף של ביומרקרים פרה-קליניים.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מטרות אפגנטיות בהתבסס על ראיות מכניסטיות.
- מסייע באינטגרציה עם גישות רחבות-גנום לקבלת תובנות תרגומיות נרחבות יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול ChIP טבעי זה ממוקם בתוך הרצף שבין הגילוי המוקדם לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין תיקוף מנגוני של מטרות לבין פיתוח סממנים ביולוגיים תרגומיים במחקר נוירו-אונקולוגי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי ההשפעה הפונקציונלית של מודיפיקציות היסטוניות בנורו-ספירות של גידולים.
- סריקה: מספקת נתוני העשרה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מבוססת qPCR של העשרת סימני היסטון באזורים גנומיים ספציפיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין המצב האפיגנטי לביטוי גנים ולרלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לניתוח כרומטין בתוכניות מחקר שונות בתחום הנוירו-אונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף של מטרות אפיגנטיות ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: משפר את שחזוריות הבדיקה ואת הסטנדרטיזציה באמצעות הכנת כרומטין טבעי.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע להחלטות go/no-go על ידי קישור מצב הכרומטין לוויסות גנים פונקציונלי במודלים של גידולים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון של מטרות אפיגנטיות בקווי פיתוח של נוירו-אונקולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות של נוירוספירות (neurosphere), ביולוגיה של כרומטין וטכניקות של שיקוע חיסוני (immunoprecipitation).
- דורש גישה למכשור ייעודי עבור פרגמנטציה של כרומטין ואנליזת qPCR.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים לבחירת נוגדנים ובקרות של הבדיקה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מודלים שונים של גידולים או חלבונים הקשורים לכרומטין.
- מוגבל לאנליזה של היסטונים או חלבונים הקשורים בחוזקה ל-DNA, כפי שמוכתב על ידי מגבלות של native ChIP.
