Name: Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: למד טכניקת פוטוקונברסיה של תאים בודדים בדג זברה חי באמצעות חשיפת UV לאזורים המביעים חלבון Eos. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בזמן אמת ומספקת תובנות חשובות לביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ברנרד Kulemaka וחברי המעבדה סמית שלהם הערות מועילות והדרכה ריאגנט, סאם קונל, ברנט רדפורד של 3עכשיו עבור פילדינג הדמיה שאלות, דבורה באנג, קארן הקשבה, קיי סטיוארט לטיפול דג זברה. עבודה זו נתמך על ידי את אוניברסיטת נוטרה דאם, האליזבת, מייקל משפחה, אלפרד פ סלואן קרן, מרכז מחקר דג זברה אוניברסיטת נוטרה, מרכז של תאי גזע, רפואה רגנרטיבית-אוניברסיטת נוטרה דאם. מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל נעשו בהתאם אוניברסיטת נוטרה דאם IACUC ד ר קודי סמית.

מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת Notre Dame אכפת חיה המוסדית והוועדה שימוש.
1. הכנת דג זברה הדגימה
<ol><li>מקום אחד גבר בוגר אחד למבוגרים נקבה Tg (חלבון להמרה) לתא ההזדווגות לפי נהלי13. כתב יד זה, להשתמש Tg(sox10:eos) דגים9 בגלל גישה אבל קווים הטרנסגניים אחרים עם חלבון photoconvertible יכול לשמש באותה מידה. הגדרת תא אחד או יותר למקרה דגים אל תרים. לאפשר את הדג להישאר בבית הבליעה למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, לאסוף את הביצים בתוך צלחות פטרי 100 מ מ. לאפשר ביצים להבשיל עד 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לפני ההקרנה.</li>
	<li>אם חיות לעיל היו heterozygotes על transgene מסך 24 מנות hpf עבור Tg(sox10:eos) + העוברים עם 488 ננומטר מקור אור ואביזרים GFP לסנן סטים על מיקרוסקופ ויבתר. לבודד Tg(sox10:eos) + עוברי ולאפשר להבשיל ל-48 hpf.</li>
	<li>Dechorionate עוברי ידנית עם מחט או פינצטה.</li>
	<li>הכנה של מיקרוגל 5 מ של 0.8% פתרון agarose נקודת התכה נמוכה.<ol>
<li>לאחר agarose קרירות למגע, מקום 3-4 Tg anesthetized (sox10:eos) + 48 hpf דגים במרכז זכוכית 10 מ מ- coverslip בתחתית צלחת פטרי.</li>
		<li>הוסף agarose מספיק כדי לכסות את פני השטח של coverslip, כ 1 מ"ל. שימוש במחט בדיקה לסדר את הדג על הצדדים שלהם. לאפשר agarose לגבש כדי להבטיח הרכבה של בעלי חיים. יתכן צורך ללא הרף לארגן את דג זברה מחדש עד אגר עפור14. התמצקות לוקח כ 2 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר agarose התחזק למשך 2 דקות, להוסיף לאט העובר בינוני המכיל 0.02% חומצה aminobenzoic אסתר (Tricaine) לדרוש עד מהמשטח התחתון של אגר, מאכל שקוע. זה צריך להיות כ 3 מ.</li>
</ol>2. מיקרוסקופ הרכבה והדמיה מראש המרה
<ol><li>פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דגים הדמיה."</li>
	<li>במקום הדגימה על היקף קונאפוקלית ולהביא להתמקד באמצעות קורס וידיות התאמת משובח.</li>
	<li>פתח את החלון המוקד ואתר האזור הרצוי של הריבית (כלומר השורש העזוב הגרעינים).</li>
	<li>בחר את הלייזר c488 תחת תפריט להגדיר מסנן. הגדר את החשיפה 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].</li>
	<li>סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. הטווח שניתן עלה או ירד כדי לאכלס העומק של אזור ההדמיה. עבור חוט השדרה ערך בטווח בין 35-40 ערימות היא בדרך כלל מספיק [איור 5].</li>
	<li>בחר במיקום הנוכחי [איור 5].</li>
	<li>לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.</li>
</ol>3. תא בודד Photoconversion
<ol><li>פתח את תוכנת קונאפוקלית ובחר החלונות לכידת ונוחות [איור 1]. תחת החלון לכידת, בחר בהגדרה הדמיה מעבדה ספציפי ההמרה תחת התפיסה הגדרת הנפתחת בכרטיסייה [איור 1]. כאן ההגדרה מעבדה ספציפי נקרא "דג ablate שבב מלא".</li>
	<li>בחר הלייזר c488 ו- c541 תחת תפריט להגדיר מסנן. אם אינך משתמש בתוכנה מיקרוסקופ זהה, למצוא תפריט כדי לבחור לייזרים שונים, בחר 488 ננומטר, לייזרים nm 541. הגדר את חשיפות 300 ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2]. הגדרות אלה לייזר נבחרו על סמך הפקת מספיק אותות פלואורסצנט מבלי לגרום photobleaching או רעילות. אם רעילות או photobleaching הוא מדמיין, להפחית את עוצמת הלייזר או חשיפה.</li>
	<li>פתח את החלון המוקד ולחץ על הכרטיסיה photomanipulation בחלון המוקד. להתאים את הפרמטרים לייזר בהתאם. לשנות את עוצמת הלייזר מחסנית ל- 2 ולאחר מכן לחץ על ללכת. לשנות את גודל הבלוק רסטר 1 ולחץ על הגדר. לשנות את גודל פעמיים ל- 4. לשנות את קו לייזר v405 [איור 3].</li>
	<li>פתח את קביעות הלכידה מתקדמות בחלון הלכידה. בחר את הכרטיסיה photomanipulation ולשנות את מספר החזרות פעמיים 2. לחץ על אישור [איור 4].</li>
	<li>בחר את הכרטיסיה XY בחלון המוקד. בדוק את הפרמטרים לייזר משלב 2 בכרטיסיה ' photomanipulation ' [איור 3, איור 4]. קבע את הגדרות לייזר כדי photoconvert התא של הריבית בלי photoconversion של התאים שמסביב.<ol>
<li>אם photoconversion של תאים סמוכים, להפחית את עוצמת הלייזר. אם photoconversion של תאים לא התרחשה, כוחות לייזר יכול להיות מוגברת. בצורה אופטימלית, הגדר עוצמת הלייזר photoconvert רק האזור של עניין לא ובסביבותיו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סמן את התיבה timelapse תחת ללכוד את סוג. לאחר מכן, לחץ על התחל [איור 6A].</li>
	<li>לאחר פתיחת החלון timelapse בשידור חי, בחר בכלי עיגול בסרגל הכלים העליון [איור 7]</li>
	<li>לצייר עיגול באזור centermost של התא. קליק ימני המעגל מצוירות, בחר אזור FRAPוהמתן 3 שניות. האזור שנבחר צריך להיות דימר [איור 8]. לחץ על עצור לכידה.</li>
	<li>אם הדמיה חיה יותר מפעם אחת, לחזור אל הכרטיסיה XY המוקד תפריט, בחר במיקום 2. . אז, חזור על השלבים 4.1-4.6.</li>
	<li>כדי להמיר אוכלוסיה של תאים, בצע את הפרמטרים פרוטוקול ו לייזר עבור שלבים 4.1-4.4 למעט במקום לצייר עיגול FRAP האזור של הריבית, השתמש בכלי שורת. צייר קו על האזור של הריבית, FRAP האזור באמצעות אותם פרמטרים המפורטים לעיל.</li>
</ol>4. פוסט-photoconversion הדמיה
<ol><li>לאחר כל נקודות photoconverted. בחר הערימה תמונה רגילה מעבדה ספציפי הגדרת שמתואר precoversion הדמיה שלב 3. זה נמצא תחת התפיסה הגדרת הנפתחת tab בחלון לכידת [איור 5].</li>
	<li>בחר את הלייזר c488, להגדיר את החשיפה 300ms, לייזר כוח 5, ולהגדיל ל 75 [איור 2].</li>
	<li>בחר את הלייזר c541 נמצא תחת התפריט כמו הלייזר c488. הגדר את החשיפה 500 ms, לייזר כוח 10, ולהגדיל ל 75 [איור 9].</li>
	<li>סמן את התיבה 3D תחת המקטע ללכוד את סוג . במקטע ' לכידת תלת-ממד ', בחרו להשתמש תפקיד נוכחי וסמנו טווח בסביבה הנוכחית. באותו מקטע, הגדר את הטווח 35, מספר מטוסים ל- 36, ואת גודל שלב 1. המספר טווח עשויה להגדיל או להקטין כדי להתאים את עומק ההדמיה הרצויה [איור 5].</li>
	<li>אם ישנן נקודות מרובות בכרטיסיה המוקד XY, בחר באפשרות רשימת רב-נקודתי בחלון הלכידה. אם לא, בחר במיקום הנוכחי.</li>
	<li>לחץ על התחל בתחתית החלון הלכידה כדי להשיג את התמונה.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ברקמות מורכבות, סוגי תאים נפרדים לארגן לתחומים ספציפיים. לאחרונה כבר מנוצל טכניקות תווית בתאים בודדים בתוך אלה רקמות גדולות מבנים1,2,3. כאן נדגים שתי טכניקות באופן דומה יכול להיות מנוצל כדי להמחיש תא בודד אינטראקציות והן תא אינטראקציות האוכלוסייה בתוך רקמות מורכבות. היתרון של השיטה photoconversion הוא השליטה במרחב שהמדען יש לתייג במובהק תא. עם מיקרוסקופ בעל יכולת לחשוף קטן הדמיה אזורים בתוך חלון הדמיה גדול יותר, אזורים קטנה כפי ...

תאים נפרדים מרובים אינטראקציה לבנות ולתחזק מורכבים רקמות. תאים אלה הם לעתים קרובות intercalated, שקשה להבדיל בין שכנים ברמה תא בודד ללא מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה הדורשים קיבוע של רקמות. עם זאת, כדי להבין כיצד אלה הטופס רקמות, מתוחזק, ולהיות חולה, זה היה חיוני לחקור איך חד תאים בתוך הרקמה אינטראקציה לאורך זמן. באופן אידיאלי, ניסויים אלה דורשים תיוג של תאים בודדים בתוך רקמה בצורה לא פולשנית ללא הדרישה של קיבעון. כעת, מדענים פיתחו טכניקות רבות כדי להשלים את המשימות1,2,3,4.
לצורך גילוי והיישום של החלבון הניאון מדוזה ירוק (GFP) היה אחד גישה מרגש המותר עבור תיוג של תאים נפרדים ב- הסביבה הרקמה1. באמצעות תאים ספציפיים היזמים, זה אפשרי לבחירת גנטית בתאים המסומנות1. לחלופין, ביטוי מושרה ויראלי של GFP יכול להיות מנוצל עבור המשתמש שנבחר ביטוי של GFP3,4. למרות שימושי למדי, הגנטי בתיווך של GFP אינה מאפשרת המשתמש שנבחר הביטוי בתוך קבוצת משנה של תאים בתוך הרקמה; וניתן ביטוי נגיפי ה-GFP, למרות יתרון, פולשני. עם כניסתו של GFP נגזרים וטכניקות חכם כמו Brainbow לבטא חלבונים פלורסנט ברורים יותר בדלילות בתוך רקמות, זה הפך אפשר לדמיין תאים בודדים ואינטראקציות ביניהם רקמות מורכבות2, 5. עם זאת, גישות אלה תווית תאים באופן אקראי. אם הניסוי הרצוי דורש ויזואליזציה של תא בודד או אוכלוסיית תאים אשר מוגדרת על ידי הנסיין, הם לכן מוגבל. עם ניסויים כאלה, זה יהיה יתרון יש חלבון פלואורסצנטי ביטוי גנטית אפשר לגרום להם להבחין, באופן תא בודד, זה של תאים אחרים פלורסנט, הלא-פלורסנט.
כדי להשיג מטרה זו, ולהמחיש את ביולוגיה של התא של תאים בודדים בתוך רקמת החיים מורכבים, הקהילה המדעית משתמש photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט ברורים-6,-7,-8. באמצעות גנטית מבוקר הביטוי של photoconvertible חלבון (קרי, eos, קאךה, וכו ') זה המעברים מ ירוקה למצב ניאון אדום כאשר הם נחשפים UV (488 ננומטר) אור, אנחנו. יכולים להבחין תא בודד מן שלה שכותרתו fluorescently השכנים6,7,8. גישה זו מנצל מכשירים המחוברים שלנו מיקרוסקופ קונפוקלי אשר יכולים לכוון את האור מאוסף לייזר לאזור מוגבל עקיפה של עניין. בטכניקה זו, אנו יכולים גם תווית תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות צורה על-ידי המשתמש9,10,11. הטכניקה היא פולשנית בהשוואה לתא בודד זריקות של נגיפי ה-GFP. מהווה הוכחה של המושג, אנחנו מראים שאנחנו יכולים photoconvert תאים בודדים בתוך גנגליון מערכת העצבים ההיקפית, photoconvert אוכלוסיות גדולות יותר כמו תאים ממוקם על הצד הבטני של חוט השדרה9,10, 11,12. אנחנו מכן יכול לדמיין photoconverted תא אוכלוסיות אלה 24 שעות מאוחר יותר כדי לזכות בתובנה שלהם התנועה ובידול במהלך הפיתוח.

<table><tbody><tr><td>Tg(sox10:eos) דגי זברה חיות</td><td></td><td></td><td>דגים הושגו ונחצו ממתקן הדגים באוניברסיטת נוטרדאם</td></tr><tr><td>100 X 15 מ"מ צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>מדיום</td><td></td><td></td> <td>עוברימדיום העובר מיוצר מדי שבוע ומסופק על ידי מתקן הדגים באוניברסיטת נוטרדאם המכיל 5 ליטר מים RO, 30uL מתילן כחול ומלאי מלח 200 מ"ל.</td></tr><tr><td>0.8% נקודת התכה נמוכה Agarose</td><td>dot Scientific Inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 מ"מ כיסוי זכוכית צלחת פטרי תחתונה</td><td>טד פלה בע"מ</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr>בדיקת <td></td><td></td><td></td><td>ניתוח מחט</td></tr><tr><td>0.002% אסטר חומצה אמינו-בנזואית (טריקאין)</td> <td>פלוקה אנליטי</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ חיתוך פלואורסצנטי עם מסנני GFP</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי עם לייזרים לעורר ערכות מסנני GFP ו-RFP</td><td>3i מסתובב דיסק קונפוקלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקור אור UV (לייזר) עבור photoconversion</td><td>405 nm לייזר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook תוכנה</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

רקמה חיה and הצומח מורכב של אוכלוסיות שונות של תאים. תאים אלה אינטראקציה לאורך זמן לבנות ולתחזק את הרקמה והוא יכול לגרום לטטנוס כאשר משובשות. מדענים פיתחו טכניקות חכם כדי לחקור את המאפיינים ואת הדינמיקה הטבעית של תאים אלה בתוך רקמת ללא פגע על ידי הבעת פלורסנט חלבונים בתוך קבוצות משנה של תאים. עם זאת, לעתים, ניסויים דורשים יותר שנבחר ויזואליזציה של תאים בתוך הרקמה, לפעמים על האופן תא בודד או אוכלוסייה-של-תאים. כדי להשיג זאת דמיינו תאים בודדים בתוך אוכלוסייה של תאים, נעזרו מדענים photoconversion תא בודד של חלבונים פלורסנט. להפגין טכניקה זו, אנו מציגים כאן כיצד לכוון אור UV לתא Eos-הבעת התעניינות שלם, חי דג זברה. אנחנו מכן תמונה באותם תאים Eos+ photoconverted 24 שעות מאוחר יותר כדי לקבוע איך הם שינו ברקמה. אנו מתארים שתי שיטות: יחיד תא photoconversion ו- photoconversions של אוכלוסיות של התא. שיטות אלה ניתן להמחיש אינטראקציות תא-תא, תא-גורל בידול, ואת נדידת תאים, הפיכתה טכניקה הרלוונטיים בשאלות ביולוגיות רבות.

Photoconversion של חלבונים פלורסנט ניתן לסמן תאים נפרדים בתוך רקמת6. כדי להדגים את זה, Tg(sox10:eos) דגים9 שימשו כדי להביע את החלבון photoconvertible Eos תחת רצפי רגולטוריות sox10. החיות Tg(sox10:eos) של 48 hpf היה רכוב קודם ולאחר מכן עם תמונה כדי לזהות כל photoconversion שאינם ספציפיים שייתכן שהתרחשה. Eos אשר האות פלורסנט עם אות ניאון photoconverted Eos הקטן היה אז דמיינו (איור 10). ח...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

המטרה הכוללת של טכניקת המרת פוטו זו היא להבחין בין תאים בודדים בבעל חיים בודד לבין אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים אחרות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות התפתחותיות מרכזיות בתחום, ולאפשר לנו לדמיין נדידת תא בודד לאורך זמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא זעיר פולשנית וניתן להשתמש בה לתיוג תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות יותר.בנוסף, המשתמש יכול לבחור את אזור העניין הספציפי ולהמיר תמונה את היעד הרצוי. לאחר הזדווגות של דג זברה טרנסגני זכר ונקבה המבטא חלבון הניתן להמרה ואיסוף הביצים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוסקופ מנתח עם מקור אור של 488 ננומטר וערכות מסנני GFP כדי לסנן 24 עוברי hpf. בעזרת מחט או פינצטה, יש לפרק ידנית את העוברים.מכינים במיקרוגל, חמישה מיליליטר של 0.8% תמיסת אגרוז נקודת התכה נמוכה. לאחר שהאגרוז מקורר למגע, הניחו שלושה עד ארבעה דגי sox10 eos חיוביים 48 hpf מורדמים במרכז צלחת פטרי תחתונה של כיסוי זכוכית של עשרה מילימטרים. הוסף כמילימטר אחד, או מספיק אגרוז כדי לכסות את פני השטח של החלקת הכיסוי.לאחר מכן, השתמשו במחט בדיקה כדי לסדר את הדגים על דפנותיהם, והתאימו אותם לפי הצורך, בזמן שהאגרוז מתמצק, מה שייקח כשתי דקות. לאחר שהאגרוז התמצק במשך שתי דקות, הוסיפו לאט לאט מדיום עוברי המכיל 0.02% חומצה אמינובנזואית אסטר טריקאין לתבשיל, עד שהמשטח התחתון של האגר והמנה שקוע. כדי לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית, פתח תוכנה קונפוקלית ובחר את חלונות הלכידה והמיקוד.כדי לבצע הדמיה לפני המרה, תחת חלון הלכידה וכרטיסייה הנפתחת של הגדרות לכידה, בחר את פרמטרי ההדמיה. להלן הגדרת הערימה הספציפית למעבדה נקראת, הדמיית דגים. הנח את הדגימה על המיקרוסקופ הקונפוקלי והשתמש בכפתורי הכוונון הגסים והעדינים כדי להכניס אותה למיקוד.לאחר מכן פתח את חלון המיקוד ואתר את אזור העניין הרצוי, כגון גנגליון השורש הגבי. בתפריט ערכת המסננים, בחר את הלייזר c488, הגדר את החשיפה ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75. לאחר מכן, תחת סוג הלכידה סמן, סמן את התיבה תלת מימדית.באזור 'לכידת תלת-ממד', בחרו 'השתמש במיקום הנוכחי' וסמנו את הטווח סביב הזרם. באותו סעיף הגדר את הטווח ל-35, את מספר המטוסים ל-36 ואת גודל המדרגה לאחד. בחר את המיקום הנוכחי ולאחר מכן לחץ על התחל בתחתית חלון הצילום כדי לקבל תמונה.לפני תהליך ההמרה לאור, הקפד לבדוק פעמיים ושלוש את פרמטרי הלייזר. לפעמים יש צורך להתאים מחדש את הגדרות ההמרה, כאשר חלון ההמרה פתוח. בחלון הלכידה, תחת הכרטיסייה הנפתחת של הגדרת חלון הלכידה, בחר את הגדרת הדמיית ההמרה הספציפית למעבדה.כאן נקראת ההגדרה הספציפית למעבדה, צ'יפס מלא של דגים. תחת ערכת תפריט המסנן, בחר את הלייזרים c488 ו-c541. הגדר את החשיפות ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75, מה שיפיק מספיק אות פלואורסצנטי מבלי לגרום להלבנת אור או רעילות.בחלון המיקוד, לחץ על הכרטיסייה פוטומניפולציה, ושנה את עוצמת הלייזר לשניים ואז לחץ על בצע. שנה את גודל גוש הרסטר לאחד ולחץ על הגדר. לאחר מכן שנה את גודל הלחיצה הכפולה לארבע ואת קו הלייזר ל-v405.לאחר מכן, בחלון הלכידה פתח את הגדרות הלכידה המתקדמות. בחר את הכרטיסיה Photo Manipulation ושנה את חזרות הלחיצה הכפולה לשתיים ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר את הכרטיסיה xy בחלון המיקוד.בכרטיסייה פוטומניפולציה, בדוק שוב את פרמטרי הלייזר. לאחר מכן, הגדר הגדרות לייזר כדי להמיר את התא המעניין, ללא המרה של התאים שמסביב. תחת סוג לכידה, סמן את התיבה קיטועי זמן ולאחר מכן לחץ על התחל.לאחר פתיחת חלון ה-Timelapse החי, בחר בכלי העיגול בסרגל הכלים העליון. צייר עיגול באזור המרכזי ביותר של התא ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על העיגול המצויר, בחר אזור FRAP והמתן שלוש שניות. האזור שנבחר אמור להיות עמום יותר, כאשר הוא לוחץ על הפסק לכידה.אם אתה מצלם יותר מחיה אחת, חזור ללשונית xy בתפריט המיקוד ובחר מיקום שתיים. לאחר מכן, חזור על המרת הצילום. כדי להמיר אוכלוסיית תאים, עקוב אחר הפרוטוקול ופרמטר הלייזר באמצעות פתיחת חלון ה-Timelapse.כעת, במקום לצייר עיגול כדי לסמן את אזור העניין, השתמשו בכלי הקו כדי לצייר קו על אזור העניין. לאחר מכן, FRAP את האזור באמצעות אותם פרמטרים שהודגמו זה עתה. לאחר המרת כל הנקודות, תחת הכרטיסייה הנפתחת הגדרת לכידה בחלון הלכידה, בחר את הגדרת הערימה הסטנדרטית הספציפית למעבדה שתוארה קודם לכן בסרטון זה.בחר את הלייזר c488 והגדר את החשיפה ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75. בחר את הלייזר c541 והגדר את החשיפה ל-500 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לעשר ואת העצמה ל-75. תחת סוג הלכידה סמן את התיבה תלת מימדית.באזור 'לכידת תלת-ממד', בחרו 'השתמש במיקום הנוכחי' וסמנו את הטווח סביב הזרם. באותו סעיף, הגדר את הטווח ל-35, את מספר המטוסים ל-36 ואת גודל המדרגה לאחד. מספר הטווח עשוי לגדול או לקטן, כדי להתאים לעומק ההדמיה הרצוי.אם יש נקודות כפל בכרטיסיית המיקוד xy, בחלון הלכידה, בחר באפשרות רשימת ריבוי הנקודות. אם לא, בחר מיקום נוכחי. לבסוף, בתחתית חלון הלכידה, לחץ על התחל כדי לרכוש תמונה.לוחות אלה מציגים תא המרה יחיד לפני הצילום, בתוך גנגליון מדג זברה טרנסגני, המבטא את חלבון ה-EOS הניתן להמרה לאור, תחת שליטת רצף הרגולציה של sox10. לאחר המרת האור, EOS היה נוכח באופן מובהק באזור העניין, בעוד שלא סומנו תאים שכנים. כדי להדגים את התועלת של טכניקת המרת אור זו, אוכלוסיית תאים בצד הגחון של חוט השדרה נחשפה לאור UV, באמצעות קו.לאחר מכן, צולמו תמונות המציגות את חלבון ה-eos שהומר לאור באזור הקו. חלבון eos שאינו מומר לאור נראה בכל האזורים האחרים. מספר שעות לאחר ההמרה לאור, צולמו תמונות זהות שהראו תאים חיוביים ל-EOS שהומרו לאור מפוזרים בכל אזור חוט השדרה, הן במיקומים הגביים והן בגחוניים.ממצא זה עולה בקנה אחד עם ההשערה שתאי עמוד השדרה הגחוניים עברו למיקומים גביים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 עד 45 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. כשאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור לצלם תמונה לאחר ההמרה, כדי לוודא שאזור העניין שלך אכן חווה המרה בתמונות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית זמן-lapse על מנת לצפות בנדידת תאים ודינמיקה לאורך זמן. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להבחין בין תאים בודדים בתוך אוכלוסיית תאים פלואורסצנטיים. אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת ביצוע הליך זה.לדוגמה, לעולם אל תבהה ישירות באור.

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.

תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

כאן אנו מציגים שיטה להפעלה פוטו-אקטיבית של חלבוני פלואורסצנציה הניתנים להמרה פוטו-כימית (PCFPs) בעובר דג זבוב חי, ומעקב המשך אחר החלבון שהומר בנקודות זמן ספציפיות במהלך ההתפתחות. מתודולוגיה זו מאפשרת ניטור של אירועים ביולוגיים תאיים העומדים בבסיס תהליכי התפתחות שונים באורגניזם חולייר חי.

מעקב נייד באמצעות חלבוני Photoconvertible במהלך פיתוח דג זברה

סרטון זה מדגים מעקב אחר גיוס לויקוציטים באמצעות זחלי דגי זברה טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן להמרה פוטו-מיטבית. הזרקה מראש של חיידקים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי אדום לתוך שלפוחית העין וגרימת המרת אור מאפשרת תצפית על נדידת לויקוציטים, פגוציטוזה ופיזורם בכל הגוף, ומספקת תובנות חשובות לגבי דינמיקת התגובה החיסונית.

מעקב לויקוציטים מבוסס פוטו-המרה בדגי זברה טרנסגניים נגועים בחיידקים

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

הקמנו את מערכת ה-PSmOrange הניתנת להמרה ככלי רב עוצמה, ישר קדימה וזול למעקב אחר תאים in vivo ברקעים טרנסגניים של GFP. פרוטוקול זה מתאר את יישומו במערכת המודל של דג הזברה.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

פרוטוקול זה מתאר שיטה photoconversion של חלבון פלואורסצנטי קאךה בתאים endocardial של החיים העובר דג זברה המאפשרת המעקב של תאים endocardial במהלך תעלת atrioventricular ופיתוח שסתום הלב atrioventricular .

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול יעיל, קל לשימוש עבור הכנת תרביות תאים הראשי של דג זברה העוברים על תרביות תאים, תא חי הדמיה, כמו גם פרוטוקול להכין ראשי תאים מהמוח דג זברה למבוגרים.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

למד טכניקת פוטוקונברסיה של תאים בודדים בדג זברה חי באמצעות חשיפת UV לאזורים המביעים חלבון Eos. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי נדידת תאים בזמן אמת ומספקת תובנות חשובות לביולוגיה התפתחותית.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

גלה סרטונים נוספים