Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה
19 במרץ 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להראות איך תא photoconversion מושגת באמצעות חשיפה UV על אזורים מסוימים להביע החלבון הניאון, אאוס, בבעלי החיים.
המטרה הכוללת של טכניקת המרת פוטו זו היא להבחין בין תאים בודדים בבעל חיים בודד לבין אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים אחרות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות התפתחותיות מרכזיות בתחום, ולאפשר לנו לדמיין נדידת תא בודד לאורך זמן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא זעיר פולשנית וניתן להשתמש בה לתיוג תאים בודדים או אוכלוסיות גדולות יותר.
בנוסף, המשתמש יכול לבחור את אזור העניין הספציפי ולהמיר תמונה את היעד הרצוי. לאחר הזדווגות של דג זברה טרנסגני זכר ונקבה המבטא חלבון הניתן להמרה ואיסוף הביצים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוסקופ מנתח עם מקור אור של 488 ננומטר וערכות מסנני GFP כדי לסנן 24 עוברי hpf. בעזרת מחט או פינצטה, יש לפרק ידנית את העוברים.
מכינים במיקרוגל, חמישה מיליליטר של 0.8% תמיסת אגרוז נקודת התכה נמוכה. לאחר שהאגרוז מקורר למגע, הניחו שלושה עד ארבעה דגי sox10 eos חיוביים 48 hpf מורדמים במרכז צלחת פטרי תחתונה של כיסוי זכוכית של עשרה מילימטרים. הוסף כמילימטר אחד, או מספיק אגרוז כדי לכסות את פני השטח של החלקת הכיסוי.
לאחר מכן, השתמשו במחט בדיקה כדי לסדר את הדגים על דפנותיהם, והתאימו אותם לפי הצורך, בזמן שהאגרוז מתמצק, מה שייקח כשתי דקות. לאחר שהאגרוז התמצק במשך שתי דקות, הוסיפו לאט לאט מדיום עוברי המכיל 0.02% חומצה אמינובנזואית אסטר טריקאין לתבשיל, עד שהמשטח התחתון של האגר והמנה שקוע. כדי לבצע מיקרוסקופיה קונפוקלית, פתח תוכנה קונפוקלית ובחר את חלונות הלכידה והמיקוד.
כדי לבצע הדמיה לפני המרה, תחת חלון הלכידה וכרטיסייה הנפתחת של הגדרות לכידה, בחר את פרמטרי ההדמיה. להלן הגדרת הערימה הספציפית למעבדה נקראת, הדמיית דגים. הנח את הדגימה על המיקרוסקופ הקונפוקלי והשתמש בכפתורי הכוונון הגסים והעדינים כדי להכניס אותה למיקוד.
לאחר מכן פתח את חלון המיקוד ואתר את אזור העניין הרצוי, כגון גנגליון השורש הגבי. בתפריט ערכת המסננים, בחר את הלייזר c488, הגדר את החשיפה ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75. לאחר מכן, תחת סוג הלכידה סמן, סמן את התיבה תלת מימדית.
באזור 'לכידת תלת-ממד', בחרו 'השתמש במיקום הנוכחי' וסמנו את הטווח סביב הזרם. באותו סעיף הגדר את הטווח ל-35, את מספר המטוסים ל-36 ואת גודל המדרגה לאחד. בחר את המיקום הנוכחי ולאחר מכן לחץ על התחל בתחתית חלון הצילום כדי לקבל תמונה.
לפני תהליך ההמרה לאור, הקפד לבדוק פעמיים ושלוש את פרמטרי הלייזר. לפעמים יש צורך להתאים מחדש את הגדרות ההמרה, כאשר חלון ההמרה פתוח. בחלון הלכידה, תחת הכרטיסייה הנפתחת של הגדרת חלון הלכידה, בחר את הגדרת הדמיית ההמרה הספציפית למעבדה.
כאן נקראת ההגדרה הספציפית למעבדה, צ'יפס מלא של דגים. תחת ערכת תפריט המסנן, בחר את הלייזרים c488 ו-c541. הגדר את החשיפות ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75, מה שיפיק מספיק אות פלואורסצנטי מבלי לגרום להלבנת אור או רעילות.
בחלון המיקוד, לחץ על הכרטיסייה פוטומניפולציה, ושנה את עוצמת הלייזר לשניים ואז לחץ על בצע. שנה את גודל גוש הרסטר לאחד ולחץ על הגדר. לאחר מכן שנה את גודל הלחיצה הכפולה לארבע ואת קו הלייזר ל-v405.
לאחר מכן, בחלון הלכידה פתח את הגדרות הלכידה המתקדמות. בחר את הכרטיסיה Photo Manipulation ושנה את חזרות הלחיצה הכפולה לשתיים ולאחר מכן לחץ על אישור. בחר את הכרטיסיה xy בחלון המיקוד.
בכרטיסייה פוטומניפולציה, בדוק שוב את פרמטרי הלייזר. לאחר מכן, הגדר הגדרות לייזר כדי להמיר את התא המעניין, ללא המרה של התאים שמסביב. תחת סוג לכידה, סמן את התיבה קיטועי זמן ולאחר מכן לחץ על התחל.
לאחר פתיחת חלון ה-Timelapse החי, בחר בכלי העיגול בסרגל הכלים העליון. צייר עיגול באזור המרכזי ביותר של התא ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על העיגול המצויר, בחר אזור FRAP והמתן שלוש שניות. האזור שנבחר אמור להיות עמום יותר, כאשר הוא לוחץ על הפסק לכידה.
אם אתה מצלם יותר מחיה אחת, חזור ללשונית xy בתפריט המיקוד ובחר מיקום שתיים. לאחר מכן, חזור על המרת הצילום. כדי להמיר אוכלוסיית תאים, עקוב אחר הפרוטוקול ופרמטר הלייזר באמצעות פתיחת חלון ה-Timelapse.
כעת, במקום לצייר עיגול כדי לסמן את אזור העניין, השתמשו בכלי הקו כדי לצייר קו על אזור העניין. לאחר מכן, FRAP את האזור באמצעות אותם פרמטרים שהודגמו זה עתה. לאחר המרת כל הנקודות, תחת הכרטיסייה הנפתחת הגדרת לכידה בחלון הלכידה, בחר את הגדרת הערימה הסטנדרטית הספציפית למעבדה שתוארה קודם לכן בסרטון זה.
בחר את הלייזר c488 והגדר את החשיפה ל-300 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לחמש ואת העצמה ל-75. בחר את הלייזר c541 והגדר את החשיפה ל-500 אלפיות השנייה, את עוצמת הלייזר לעשר ואת העצמה ל-75. תחת סוג הלכידה סמן את התיבה תלת מימדית.
באזור 'לכידת תלת-ממד', בחרו 'השתמש במיקום הנוכחי' וסמנו את הטווח סביב הזרם. באותו סעיף, הגדר את הטווח ל-35, את מספר המטוסים ל-36 ואת גודל המדרגה לאחד. מספר הטווח עשוי לגדול או לקטן, כדי להתאים לעומק ההדמיה הרצוי.
אם יש נקודות כפל בכרטיסיית המיקוד xy, בחלון הלכידה, בחר באפשרות רשימת ריבוי הנקודות. אם לא, בחר מיקום נוכחי. לבסוף, בתחתית חלון הלכידה, לחץ על התחל כדי לרכוש תמונה.
לוחות אלה מציגים תא המרה יחיד לפני הצילום, בתוך גנגליון מדג זברה טרנסגני, המבטא את חלבון ה-EOS הניתן להמרה לאור, תחת שליטת רצף הרגולציה של sox10. לאחר המרת האור, EOS היה נוכח באופן מובהק באזור העניין, בעוד שלא סומנו תאים שכנים. כדי להדגים את התועלת של טכניקת המרת אור זו, אוכלוסיית תאים בצד הגחון של חוט השדרה נחשפה לאור UV, באמצעות קו.
לאחר מכן, צולמו תמונות המציגות את חלבון ה-eos שהומר לאור באזור הקו. חלבון eos שאינו מומר לאור נראה בכל האזורים האחרים. מספר שעות לאחר ההמרה לאור, צולמו תמונות זהות שהראו תאים חיוביים ל-EOS שהומרו לאור מפוזרים בכל אזור חוט השדרה, הן במיקומים הגביים והן בגחוניים.
ממצא זה עולה בקנה אחד עם ההשערה שתאי עמוד השדרה הגחוניים עברו למיקומים גביים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 עד 45 דקות, אם היא מבוצעת כראוי. כשאתה מנסה הליך זה, חשוב לזכור לצלם תמונה לאחר ההמרה, כדי לוודא שאזור העניין שלך אכן חווה המרה בתמונות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הדמיית זמן-lapse על מנת לצפות בנדידת תאים ודינמיקה לאורך זמן. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להבחין בין תאים בודדים בתוך אוכלוסיית תאים פלואורסצנטיים. אל תשכח שעבודה עם אור אולטרה סגול עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות הדרושים בעת ביצוע הליך זה.
לדוגמה, לעולם אל תבהה ישירות באור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להשגת פוטו-המרה של תאים באמצעות חשיפה ל-UV בבעלי חיים חיים, תוך התמקדות באזורים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי Eos. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה של נדידת תאים בודדים ומסייעת במתן מענה לשאלות מפתח בתהליכי התפתחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דימות פלואורסצנטי
רקע
- טכניקות של המרה פוטונית (Photoconversion) הן חיוניות לחקר דינמיקה של תאים.
- חלבונים פלואורסצנטיים כגון Eos מאפשרים סימון ספציפי של תאים.
- שיטה זו היא פולשנית באופן מינימלי, ובכך היא משמרת את שלמותן של רקמות חיות.
- דגי זברה טרנסגניים משמשים כמינוריגון למחקרים אלו.
מטרת המחקר
- להבחנה בין תאים בודדים לאוכלוסיות פלואורסצנטיות אחרות.
- לוויזואליזציה ומעקב אחר נדידה של תאים בודדים לאורך זמן.
- לספק תובנות לגבי תהליכי התפתחות באורגניזמים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש במיקרוסקופ סטריאוסקופי עם מקור אור של 488 nm.
- סריקה של עוברים בגיל 24 hpf המבטאים חלבונים בעלי יכולת המרה פוטוכימית (photoconvertible).
- הסרה ידנית של הדפנית (dechorionation) מהעוברים לצורך המרה פוטוכימית.
- בחירת אזורי עניין ספציפיים להמרה פוטוכימית ממוקדת.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של תאים בודדים בדגי zebrafish חיים.
- יכולת להדמיות של נדידת תאים והתנהגותם לאורך זמן.
- הדגמת יעילות הטכניקה בביולוגיה התפתחותית.
- גישה פולשנית באופן מינימלי המאפשרת תצפית ממושכת.
מסקנות
- טכניקת הפוטו-המרה (photoconversion) היא כלי בעל ערך עבור חוקרים.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקת תאים in vivo.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון עיצובים ניסיוניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פוטוקונברסיה של תא בודד בזבובי זברה חיים מאפשרת מעקב מדויק אחר התנהגויות של תאים בודדים בתוך רקמה שלמה, ותומכת בניתוח ברזולוציה גבוהה של גורל תאים, נדידה ואינטראקציה. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בהיפותזות של גילוי מוקדם ולדיוק של תיקוף מטרות במערכות ביולוגיות מורכבות. אופיה הפולשני המינימלי של השיטה והסלקטיביות המרחבית שלה ממצבים אותה ככלי בעל ערך למחקר תרגומי ולפיתוח מודלים חזויים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של דינמיקה של תאים בודדים בתוך רקמות הטרוגניות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מועמדות באמצעות מעקב אחר גורל תאים ונדידה.
- מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי בידוד וניטור של אוכלוסיות תאים ספציפיות.
- משפר את הביטחון החזוי בהיפותזות ביולוגיות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור תהליכי דימוי וניתוח המשכיים.
- מאפשר הערכה כמותית וניתנת לשחזור של התנהגות תאים בתגובה להפרעות.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מתן אפשרות לסימון סלקטיבי של תאי מטרה או אזורים ספציפיים.
- מסייע בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על נדידה ודיפרנציאציה של תאים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למעקב in vivo אחר אוכלוסיות תאים.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במחקרים לרוחביים (longitudinal).
- משפר את קבלת ההחלטות לגבי קידום הפיתוח בהתאם לסיכונים, הודות לנתונים עתירי תוכן ברמת התא הבודד.
- תומך בזיהוי של ביומרקרים תרגומיים המבוססים על גורל התאים ודפוסי נדידה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
טכניקה זו של פוטוקונברסיה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אפשור בדיקת השערות, תיקוף מטרות ומחקרים מכניסטיים במערכות חיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בחקירה מונחית-השערות של התנהגות תאים ומערכות יחסים של שושלות תאים.
- סריקה: מספקת מוכנות של בדיקות ויכולת שחזור עבור תהליכי עבודה מבוססי דימוי.
- אנליטיקה: מספקת קריאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי אפשור מעקב אחר תאים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר עבור יישומים מגוונים של סימון ומעקב אחר תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מנגנונית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה של דימוי סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים בעלי תוכן גבוה בשלב מוקדם.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של תוכניות גילוי מותאמות לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית ובמערכות של חלבונים העוברים פוטו-המרה.
- נדרשת גישה למכשור דימוי מתקדם ולתוכנות ניתוח.
- נדרשת סטנדרטיזציה של פרמטרי הדימוי והפרוטוקולים בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור אורגניזמי מודל או סוגי רקמות שונים.
- נקיטת אמצעי בטיחות מפני קרינת UV ותיקוף לאחר ההמרה חיוניים לקבלת תוצאות מהימנות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Preparation of Zebrafish Specimen
2:12
Microscope Mounting and Pre-conversion Imaging
3:35
Single-cell Photoconversion
6:18
Post-photoconversion Imaging
7:38
Results: Photoconverted Eos Protein in Single and a Population of Ganglion Cells in Transgenic Zebrafish
8:53
Conclusion
