שלב בצילום מואץ, ללא תווית, כמותיים הדמיה המחקר של תאים סרטניים אנושיים רדום ופעיל

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין כמותית פנוטיפים אנגיוגניים ולא אנגיוגניים של תאי אוסטאוסרקומה אנושיים באופן שיטתי המשלב ניתוחים של מורפולוגיה של תאים, שגשוג ותנועתיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח ביחס להתבססות והתקדמות סרטן אנושי. בפרט, הבריחה מתרדמת הגידול והמתג האנדוגני.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח פרמטרים רב-תאיים בו זמנית בשיטה משולבת ומתפשטת זו. זה כולל שטח תא, עובי תא, נפח תא, קצב התפשטות, זמן הכפלה, מהירות תנועתיות, נדידה ותנועתיות. כדי להתחיל, יש לחמם את מדיום התרבות ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.

לאחר מכן הסר בקבוקונים קריוגניים של תאי אוסטאוסרקומה אנושיים אנגיוגניים ולא אנגיוגניים ממיכל החנקן הנוזלי. טבלו את תחתית הבקבוקונים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ונערו בעדינות את הבקבוקונים הקריוגניים כדי להאיץ את תהליך ההפשרה. ברגע שהתאים מופשרים, יש לרסס את הבקבוקון באתנול 70% ולנגב את הבקבוקון כדי לעקר אותו.

לאחר מכן שאפו מיד את תרחיף התאים מהבקבוקון ותלו אותם בעדינות ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית מחומם. לאחר מכן צנטריפוגה התא מתלה למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים. בחזרה למכסה המנוע, הסר את הסופרנטנט ותלה מחדש את כדור התא עם 10 מיליליטר של מדיום תרבית מחומם.

לאחר מכן העבירו את מתלה התא לבקבוק T75. פיפטה בעדינות את תרחיף התא מספר פעמים כדי לפזר את התאים באופן שווה. הכניסו את הבקבוק לאינקובטור ואפשרו לתאים להיצמד למשך 12 שעות לפחות.

שנה את מדיום התרבות כל יומיים-שלושה. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80 עד 100 אחוז, הסר את אמצעי התרבות מהבקבוק ושטוף את התאים בחמישה מיליליטר PBS סטרילי ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תמיסת EDTA של 0.25% טריפסון לתוך הבקבוק וסובב את הבקבוק בקצרה.

דגרו את הבקבוק למשך שתיים-שלוש דקות ולאחר מכן בדקו את התאים במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מעוגלים ומנותקים. לאחר ניתוק התאים, השתמש בפיפטה כדי להוסיף מדיום תרבית של 10 מיליליטר ופיפטה בעדינות את המדיום למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק את כל אגרגטי התאים שנותרו. לאחר ספירת התאים, זרעו שני מיליון מהם בבקבוק T75 חדש.

הניחו את הבקבוק באינקובטור וגדלו את התאים בין 80 ל-100 אחוז מפגש לפני שתזרעו את התאים לניסוי הדמיית הפאזה הכמותית. קצירת תאים על ידי עיכול טריפסון ותאי אוסטאוסרקומה אנושיים אנגיוגניים ולא אנגיוגניים בשש צלחות באר בצפיפות של 50,000 עד 300,000 תאים לבאר. מכסים את התאים בסך הכל בחמישה מיליליטר מדיום תרבית.

לאחר מכן דגרו על הצלחות למשך 12 שעות לפחות כדי לאפשר זמן לתאים להתחבר. החלף את המדיום במדיה טרייה לפני ההדמיה. נקה את החלקת הכיסוי על ידי שטיפתה מספר פעמים במים זורמים נטולי יונים.

לאחר מכן טבלו אותו בתמיסת אתנול של 75% למשך 15 דקות. הנח את החלקת הכיסוי המעוקר לתוך מכסה זרימה למינרי לייבוש. לאחר מכן הנח בזהירות את החלקת הכיסוי לצלחת שש בארות, הימנע מבועות ברורות.

הכניסו את הצלחת לחממה כדי לאזן למשך 15 דקות לפחות. אם נוצר ערפל על מכסה הצלחת, השתמש במקלון צמר גפן סטרילי כדי לנגב אותו לפני ההדמיה. פתח את תוכנת הדמיית השלב הכמותי ואתחל את המערכת.

ודא שהערכים מקובלים בכיול עצמי של זמן החשיפה, ניגודיות הדפוס ורעש הולוגרמה. לאחר מכן, הנח את צלחת שש הבארות על הבמה של מיקרוסקופ תמונת הפאזה הכמותית. בחזרה לתוכנה, לחץ על לכידה חיה.

לאחר מכן עבור לתפריט המיקוד של התוכנה ובחר ידני. לאחר מכן, עבור לתפריט הגדרות המיקרוסקופ ומקד גס את תמונות הפאזה של התאים על ידי התאמת מרחק העבודה כדי לקבל קווי מתאר לתאים בתמונות פאזה. בסיום, חזור לתפריט המיקוד של התוכנה ושנה את הגדרת המיקוד לאוטומטית.

עכשיו לחץ על ניסוי חדש. התחילו לבחור מיקומים לרכישת תמונות באמצעות העכבר או מקשי החצים בלוח המספרים. לחץ על זכור לאחר כל בחירה.

לאחר בחירת כל המיקומים, עבור לקטע הזמן והגדר את מרווחי ההדמיה כך שהם יהיו קצרים מחמש דקות ופרק הזמן הכולל הוא 48 שעות. התחל את הניסוי על ידי לחיצה על לכידה. זה יתמקד וירכוש תמונות באופן אוטומטי במיקומים שנבחרו בכל נקודות זמן במרווח.

לאחר רכישת התמונה, נתח את המורפולוגיה של התאים על ידי לחיצה ראשונה על זיהוי תאים. התאם את ההגדרה המספרית עבור סף הרקע כך שאזורי התא יופרדו היטב מרעשי הרקע. לאחר מכן, התאם את מספר ההגדרה עבור גודל האובייקט כדי לוודא שלכל תא יש גרעין אחד בלבד.

שנה באופן ידני את מקטעי התא שאינם תואמים לדרישה זו באמצעות שינויים ידניים. לאחר מכן השתמש בפונקציית ניתוח הנתונים בתוכנה כדי לנתח תאים. התחל ניתוח נתונים חדש על-ידי לחיצה על ניתוח חדש.

גררו תמונות שנבחרו לכרטיסיית מסגרות המקור ורשמו פרמטרים של מורפולוגיה של תאים, כולל שטח התא, העובי האופטי והנפח של כל תא בנפרד. בסיום, בחרו בתרשים הפיזור או במצב ההיסטוגרמה וייצאו את הנתונים כטבלאות או כאיורים. בחר לפחות חמש תמונות במרווח של 12 שעות זו מזו ורשום מספרי תאים המסופקים על ידי התוכנה.

הערך את קצב התפשטות התאים על ידי נורמליזציה עם מספרי התאים הראשוניים ולאחר מכן התוויית מספרי התאים. לבסוף, העריכו את זמן ההכפלה על ידי התאמת נקודות הנתונים באמצעות עקומת גידול אקספוננציאלית. כדי לנתח תנועת תאים השתמש בפונקציית תאי המסלול בתוכנה.

התחל בלחיצה על ניתוח חדש כדי להתחיל ניתוח נתונים חדש. לאחר מכן גרור סדרת תמונות מפרק הזמן המעניין לכרטיסיית מסגרות המקור. לאחר מכן, תחת מצב בחירת הוספת תאים, בחר באופן אקראי 10 עד 30 תאים על ידי לחיצה עליהם.

הקפד לסקור את המעקב בסדרת התמונות. במקרה שהמערכת מאבדת מעקב אחר תא או עוקבת אחר התא הלא נכון, התאם ידנית את תא המעקב על ידי לחיצה על זיהוי כדי לזהות תאים או על ידי מעבר למצב בחירה ולחיצה על שינוי מיקום כדי לשנות את מיקום התא. בסיום, עבור אל תנועת התוויה ובחר שורות תרשים של מסלולי תאים או עבור אל תכונות התוויה והתווה עבור הפרמטרים האחרים הקשורים לתנועה, כגון מהירות תנועתיות, תנועתיות, הגירה וישירות הנדידה.

ייצא את הנתונים כטבלאות או כאיורים. בפרוטוקול זה, תמונות פאזה כמותיות מוצגות כהולוגרפיות. התאים המוצגים כאן מתארים את המורפולוגיה האופיינית של התאים לתאי אוסטאוסרקומה אנושיים אנגיוגניים ולא אנגיוגניים.

עובי התא מחושב על ידי מקדם השבירה ואורך הנתיב האופטי ומוצג כאן כתרשים פיזור. שני סוגי הפנו של תאי ההבדל הציגו דפוסי התפלגות שונים ומצביעים על כך שלתאים האנגיוגניים יש שטחי תאים קטנים יותר ועובי תאים גדול יותר מאשר התאים הלא אנגיוגניים. ניתן לחשב את קצב התפשטות התאים של שני סוגי התאים מתמונות דו-ממדיות כמו אלה, שחולקו והשתרעו על פני יומיים.

עבור סוגי תאים ספציפיים אלה, לא נמצאו הבדלים משמעותיים. כדי לקבוע את מאפייני תנועת התאים עבור התאים, יש לבחור תאים בודדים ולעקוב אחריהם לאורך זמן. כאן התאים הנמצאים במעקב מתוארים בצבעים שונים.

כל תא בודד היה במעקב במשך ארבע שעות עם מסלול הנתיב הכולל שלו המתואר כאן, כאשר נקודת האפס, האפס היא מיקום ההתחלה שלהם והמיקום הסופי שלהם מסומן על ידי הנקודה הצבעונית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בהדמיית פאזה כמותית כדי להשוות כמותית מחבת של פרמטרים מורפולוגיים והתנהגותיים של תאים. במקרה זה, בין פנוטיפים של תאים אנגיוגניים ולא אנגיוגניים.

לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חקר הסרטן לחקור את הבריחה מתרדמת הגידול ואת תפקידה של אנגיוגניות בתהליך זה. בפלטפורמה רציפה וללא תיוג. אל תשכח שעבודה עם קווי תאים אנושיים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.