טיפול קומבינטוריים Trichostatin A וויטמין C משפר את היעילות של שיבוט עכברים באמצעות העברה גרעיני תאים סומטיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לשפר את יעילות הייצור של עוברים משוחזרים ועכברים משובטים באמצעות העברת גרעין של תאים סומטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הבסיסית, הביולוגיה ההתפתחותית והצלת בעלי חיים בסכנת הכחדה. כגון התפתחות עוברית, תכנות גרעיני ושימור מחקר גנטי.

היתרון העיקרי של שיטה וטכניקה זו הוא שניתן ליצור עכברים משובטים ברמת יעילות מעשית בהליכים פשוטים. לאחר הכנת מדיום התרבות על פי פרוטוקול הטקסט, ממיסים 1.2 גרם BSA ב -10 מ"ל מים סטריליים בטמפרטורת החדר. הוסף כ-0.12 גרם חרוזי שרף להחלפת יונים מעורבים לתמיסת ה-BSA בטמפרטורת החדר תוך ערבוב עדין.

כאשר החרוזים משנים את צבעם מכחול ירוק לזהב, השתמש בפיפטה כדי לשחזר את תמיסת העל, ולאחר מכן החלף את החרוזים באצווה טרייה. לאחר אישור שהחרוזים הטריים אינם משנים צבע, שחזר את התמיסה. לאחר מכן מוסיפים 250 מיקרוליטר של 10.5% נתרן ביקרבונט.

בעזרת מסנן 0.45 מיקרון, עקרו את הסופרנטנט, ואז סמנו אותו כתמיסת מלאי DBSA ואחסנו אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר ביצוע המתת חסד בעכברים נקבות שעברו ביוץ על פי פרוטוקול הטקסט, השתמשו בטכניקות דיסקציה סטנדרטיות כדי לחתוך את הבטן כדי לגשת למערכת הרבייה. בעזרת מספריים ופינצטה ישרים קטנים, כבה את הביציות והעביר אותן לגיליון נייר סינון כדי לנגב את הדם מפני השטח.

לאחר מכן, הגדר את הביציות בשמן מינרלי, ולאחר מכן השתמש במחטי דיסקציה כדי לחתוך את האמפולה של צינור הביצית ולהעביר את קומפלקסי הביציות המגיעים מהאמפולה לטיפות של 200 מיקרוליטר של מדיום HCZB עם 0.1% היאלורונידאז. דגרו את הרקמה על צלחת מחממת למשך חמש דקות. תחת סטריאומיקרוסקופ, אשר שתאי הקומולוס משתחררים ממתחמי ביציות הקומולוס, ולאחר מכן העבירו ביציות בשלב מיוטי שני או M2 עם כמה תאי קומולוס שנותרו למדיום MKSOM המכיל 0.3% DBSA.

שטפו את הביציות של שלב M2 ארבע פעמים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במדיום כדי לנתק את תאי הקומולוס הנותרים. לאחר מכן דגרו את הביציות במדיום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עד להוצאה. כדי לבודד את הביציות המופשטות מקומפלקסי הביציות של קומולוס, תחת סטריאומיקרוסקופ תוך שימוש בפיפטה, העבירו מספר קטן של תאי הקומולוס הנותרים המפוזרים ממתחמי הביציות של הקומולוס למדיום HCZB עם 6% DBSA.

הנח את תאי הקומולוס על צלחת החימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בהעברת גרעין של תאים סומטיים או SCNT. לאחר הכנת תמיסות מדיום PVP ו-CB על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה מעוקרת עם 20 מיקרוליטר של מדיום HCZB המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר CB כדי לשטוף את הביציות בשלב M2. לאחר חזרה על הכביסה חמש פעמים, דגרו את הביציות בתמיסת הוצאה על צלחת החימום למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הכינו את תא ההוצאה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה כדי להעביר את ביציות ה-M2 לתוך החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של תמיסת הגרעין וכסה את החדר בשמן מינרלי. תחת מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר, זהה את הצירים והכרומוזומים של הביצית בשלב M2.

לאחר מכן בעזרת פיפטה אחיזה ומיקרופיפטה, כוונו את הביצית עם גוף קוטבי ראשון בולט כך שמיקום הציר והכרומוזום יהיה במצב 3:00 או 9:00. הגדר את עוצמת דופק הפאיזו לשלוש עד שש, ובעזרת פיפטה מיקרומניפולציה, קדח לזונה פלוסידה ופתח בה חור. לאחר מכן, עם כמות מינימלית של ציטופלזמה, הסר לחלוטין את הצירים והכרומוזומים.

באור נראה, אשר את היעדר הכרומוזומים בציטופלזמה, ואז עם מדיום MKSOM המכיל 0.3% DBSA חסר CB, שטוף היטב את הביציות המנוקזות. דוגרים את המנה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני עד לאיחוי התאים. להכנת HBJE, הוסף 260 מיקרוליטר של תמיסת תרחיף HBJE קרה כקרח ל-HVJ-E ליופיליזציה, ופיפטה למעלה ולמטה עד להשעיה מלאה.

הכינו חמש מנות מיקרוליטר של התמיסה ואחסנו אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לאיחוי התאים. כדי לבצע איחוי תאים, השתמש ב-20 מיקרוליטר של מאגר היתוך תאים כדי לדלל חמישה מיקרוליטר של תמיסת HVJ-E. מניחים את תמיסת HBJE המדוללת על קרח עד לשימוש.

לאחר הכנת תא איחוי התאים כפי שמוצג כאן, השתמש בפיפטה כדי להעביר את הביציות הגרעיניות למדיום HCZB בתא. הוסף ארבעה מיקרוליטר מכל תמיסה כפי שמוצג, והשתמש בכמיליליטר אחד של שמן מינרלי כדי לכסות את החדר. הנח את החדר עם הביציות הגרעיניות בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400.

לאחר מכן באמצעות פיפטת המיקרומניפולציה, העבירו את תאי התורם לתמיסת התרחיף HVJ-E. שאפו את תאי הקומולוס בזה אחר זה כדי להפריד אותם זה מזה באופן שווה, מה שמאפשר איחוי תאים סדרתי. לאחר מכן, בעזרת פיפטה אוחזת, שמור את הביציות הגרעיניות בתווך HCZB והשתמש בדופק הפאיזו עם פיפטת המיקרומניפולציה כדי לקדוח את ה-zona pellucida.

לאחר פתיחת החור ב-zona pellucida, פיפטה תא קומולוס בנפח של בערך פי חמישה מתמיסת HVJ-E והוציאו אותו בחוזקה לתוך קרום הביצית מבלי לעבור דרך הממברנה. לאחר מניפולציה של איחוי תאים, העבירו מיד את הביציות למדיום MKSOM המכיל 0.3% DBSA, והעבירו אותן לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה. יש להשלים את השלבים הללו תוך 10 דקות מהנחת הביציות הגרעיניות במדיום HCVB מתחת למיקרוסקופ ועד להחזרתן לחממה.

לאחר איחוי תאים, תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 400 בדוק עיבוי כרומוזום מוקדם בביציות המשוחזרות. העבירו את הביציות המשוחזרות למדיום הפעלה המכיל טריכוסטטין A, או TSA ודגרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באוויר למשך שש שעות. התבונן בהיווצרות פרו-גרעינים בעוברי ה-SENT, ולאחר מכן החל שעתיים נוספות של טיפול TSA במדיום MKSOM עם 0.3% TBSA.

בצע טיפול בוויטמין C על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שניתן לראות בטבלה זו, הטיפול ב-TSA ובויטמין C בביציות עכברים משובטים הראה שיעור גבוה מאוד של היווצרות פרו-גרעינית והתפתח לשלב שני התאים בכל התנאים. חלק מהעוברים המשובטים, שהופקו מתאי קומולוס והתפתחו לשלב שני התאים, הועברו לביציות של נקבות פסאודו-הרות.

תרשים זה מציג שישה צאצאים משובטים שהתפתחו מתוך 72 עוברים שהועברו שנוצרו משלוש נקבות הרות על ידי טיפול סדרתי ב-TSA וויטמין C.לבסוף, כפי שמודגם כאן, הטיפול ב-TSA ו-VC שיפר משמעותית את יעילות ההתפתחות העוברית במבחנה לשלב הבלסטוציסט. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שכל המדיה והריאגנטים הדרושים מוכנים מראש. ההליך עצמו, חומרים פשוטים לביצוע ומוכנים היטב, יבטיח השגת התוצאות הצפויות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לייצר ביציות משוחזרות.