Name: אוונס ממוטבת כחול פרוטוקול כדי להעריך את דליפת דם העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: למדו שיטת צבע אוונס מותאמת להערכת דליפת פלזמה באיברי עכברים FVBN. פרוטוקול זה מאפשר מדידה אמינה של חדירות כלי דם במחקר וסקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות אנדי Poczobutt, ד ר Jori Leszczynski עזרה יקר, עריכות כתב היד הזה.  הנתמכים על ידי מענקים שהתקבלו מתוך הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 ו- RO3 HL095439), המחלקה לענייני חיילים משוחררים של (Merit ביקורת).

כל ההנחיות הבינלאומי, הלאומי, ו/או מוסדיים החלים על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים (עכברים) הובילו ב הניסויים המתוארים בכתב היד.
שיטה זו משתמשת עכברים בוגרים FVBN, בגילאי 16-20 שבועות, יימצא אופטימלית לצורך מחקר זה. יום 1 כולל שלבים 1-5 וכוללת יום 2 שלבים 6-7 (איור 1).
1. ציוד הכנה
<ol><li>מאובטח על אספקה נאותה של סטריליות, חד פעמיות מזרקים ומחטים, אם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים משמש ההרדמה (כפי שמומלץ). אם איזופלוריין משמש ההרדמה, בדוק את מיכל החמצן ואת רמת נוזלים של איזופלוריין כדי לוודא שלא יהיו אספקה נאותה לניסוי לפני שמתחילים. בנוסף, להרכיב את nosecone נושם מעגלים ולצרף אותם אל תיבת אינדוקציה; לצרף המיכלים פחם חדשים המעגלים נשימה. הכן תיבת אינדוקציה על ידי הפעלת את החמצן, ברור כי השלב השני קורא כ 50 psi.</li>
	<li>הפעל את כרית החימום כדי 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין את החללית טמפרטורה רקטלית לניתוח.</li>
</ol>2. העכבר הכנה
שלב זה כולל הרדמה, הסרת שיער, מיצוב (למבוגרים FVBN עכברים-גיל 16-20 שבועות).
<ol><li>שוקל העכברים ולהקליט את המשקולות.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברים.<ol>
<li>לנהל את ה-IP קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (80-100 מ"ג/ק"ג ו- 7.5-16 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). עם זאת, מומלץ להתחיל עם מינונים נמוכים יותר של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג ועל 6 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).</li>
		<li>לשמור על ההרדמה עם 0.1 - 0.25 פעמים הראשוני מינונים של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים במהלך הניתוח. קטמין חריגות השירותים הווטרינריים היו agent(s) הרדמה להתמקד במחקר מסוים זה, כפי יותר הפארמצבטית, שרידות נצפו. ניתן למצוא את agent(s) הרדמה להתמקד במחקרים אחרים יהיו שונים.  אם איזופלוריין, להכניס את העכבר תא אינדוקציה והפעל איזופלוריין ל 5% עד העכבר מאבד הכרה מלאה. לאחר מכן השתמש nosecone האף שוכן בגובה 1.5-2.5% איזופלוריין תוצרי הלמידה ההליך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לפקח על העכברים כל 2-3 דקות על ידי צביטה הבוהן כדי לבדוק לעומק המתאים של הרדמה.</li>
	<li>לגלח את האזור הצוואר הגחון של העכבר.</li>
	<li>הנח את העכבר במצב פרקדן על משטח preheated. אבטח את כפות הידיים וכפות הרגליים של העכבר על פני השטח כירורגית עם קלטת.</li>
	<li>במקום דמעות מלאכותיות משחה על גבי העיניים כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח.</li>
</ol>3. ניתוח פרטי
<ol><li>עושים חתך 1 ס מ בצוואר הגחון ממש מעל ומוחלף.</li>
	<li>החל טיפות אחת או שתיים של לידוקאין (1-2%) אל אזור החתך לניהול כאב וכדי לקדם את התרחבות. המתן 2 דק. עבור לידוקאין שהשינויים ייכנסו לתוקף.</li>
	<li>לחשוף ולבודד נכון הפנימי, ווריד הצוואר באמצעות עמום. . תקשור את הווריד 4-0 בתפר ומשכו בעדינות את הסוף rostral של כלי השיט עם עוצר דימום. לחתוך חור, באמצעות מספריים בסדר, בערך 3 מ מ מתחת או סימטרית לעניבה, בערך באמצע הקוטר של הווריד.</li>
	<li>מארק קטטר פוליויניל PV-1 1.5 ס מ מהקצה להכניס אותו לתוך ומוחלף על דרך החור באמצעות מרחיב כלי השיט ו לשרשר את הצנתר לקראת הסוף סימטרית של כלי השיט, כ- 1.5 ס מ.</li>
	<li>לקשור את הצנתר באופן מאובטח בתוך החלק סימטרית של כלי השיט (להלן גזירה), עם 4-0 משי. לקשור את החלק rostral של כלי השיט החיצוני של הקטטר עם הקצוות של התפר ששימש לקשור rostral ומוחלף, בשלב 3.3.</li>
	<li>נעץ העור באופן רופף חזרה יחד הקטטר עם 4-0 משי כדי למנוע איבוד חום הגוף והתייבשות רקמות.</li>
	<li>להתחבר הקטטר המזרק המכיל heparinized מלוחים (10 U/mL) ומורידים את הקטטר.</li>
</ol>4. זריקות
<ol><li>להזריק את הפתרון אוונס כחול (50 μL של פתרון 30 מ"ג/מ"ל תמיסת מלח, נורמלי, unheparinized, 0.9% או כ 50 מ"ג/ק"ג) לתוך הצנתר ומוחלף, ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו.</li>
	<li>2 דקות אחר כך, להזריק חומר P (100 μL של פתרון 0.3 μM saline 0.9% נורמלי, unheparinized, או 1 nmol/ק ג), ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו. חומר P מגבירה את extravasation של פלזמה חלבונים דרך השכבה אנדותל; ב פרוטוקול זה, הוא יוצר באופן שגרתי של הגדלת פלזמה הערכים extravasation של 1.5-fold, המקל פלזמה extravasation ערכים למדוד.</li>
	<li>לחכות 18 דקות לאחר מוזרק חומר P. במהלך תקופה זו, הצבע הכחול אוונס equilibrate, לזרום.</li>
	<li>לסיים את הניסוי 18 דקות לאחר ההזרקה של חומר P (20 דקות לאחר ההזרקה אוונס כחול) ע י הקרבת את העכבר עם נקע בצוואר הרחם. סביר להניח כי העכבר ניתן ישירות cervically נקע, בלי הראשון לתת מנת יתר של סם הרדמה, כמו העכבר הוא כנראה עדיין היטב anesthetized מהניתוח. עם זאת, אם זה הכרחי, ממנת יתר של חומרי הרדמה קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים, איזופלוריין או פנטוברביטל יכול להינתן, ואחריו נקע בצוואר הרחם.</li>
</ol>5. בידוד איברים
<ol><li>לפתוח את החזה של העכבר, כוח המשיכה-perfuse (מגובה של-51 ס מ או 20") של הלב וכלי הדם עם 50 מ של 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 3.5. pH 3.5 משמר ככל הנראה מחייב אוונס כחול אלבומין.</li>
	<li>בלו 1-5 האיברים הרלוונטיים (רקמות) עם איזמל ויבתר (למשל שלפוחית השתן, הכליה, הקיבה, הכבד, הלבלב, צינתור או דיסטלי קולון, מעי, תריסריון, האגף העור, האוזניים, הזנב, הלב, ו/או הריאות) ולהסיר כל תוכן שיורית, אם נוכח.</li>
	<li>יש לשטוף את האיברים בתוך בטמפרטורת החדר (RT) באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 1.44 g של נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4, 8.0 גר' של NaCl ו- g 0.20 של אשלגן כלורי ב- 1 ליטר, pH 7.4).</li>
	<li>כתם האברים ברקמות לחצי כל איבר ואיבר, שוקלים כל חצי (רטוב משקולות, ב- g).</li>
	<li>יבש אחד חצי של הרקמה בתנור ייבוש ב 150 ° C, על רדיד, במשך 48 שעות.</li>
	<li>מקם את רקמות אחרות חצי נפח עקבית (עד 200 µL) של formamide ב microfuge הצינור עבור 48 שעות (ועד 72 h) כדי לחלץ את אוונס כחול.</li>
</ol>6. מדידה של רקמות OD
<ol><li>הסר µL 50 של אוונס חלוטים כחול formamide (לאחר 48-72 h RT הדגירה) צינור microfuge והמקום לבאר אחת של צלחת פוליסטירן 96-ובכן. יש להיזהר לא העברת רקמות חתיכות יחד עם formamide.</li>
	<li>במקום 50 µL של formamide חדש, טהור לתוך כל אחד שתי בארות ריק של צלחת 96-ובכן עבור החסר.</li>
	<li>למדוד ולהקליט את יתר620 של כל טוב של הלוחית 96-ובכן בקורא צלחת ספיגת. 620 ננומטר הוא ספיגת מקסימום של אוונס כחול.</li>
</ol>7. חישוב של פלזמה Extravasation
<ol><li>שוקל הרקמה יבש חצי אשר כבר בתנור במשך 48 שעות.</li>
	<li>לחשב את יחס משקל משקל רטוב/יבש ספציפי האיבר ריבית כל לעכבר הבודד, החל המשקל הרטוב של רקמה זו חצי (שלב שהושג ב- 5.4), מחולק לפי משקל יבש של זו רקמת אותו חצי (שלב שהושג ב- 7.1).</li>
	<li>לחשב משקל יבש (ב- g) של הרקמה חצי formamide על ידי חלוקת המשקל הרטוב של הרקמה חצי לפני זה בוצעה ב- formamide (שהושג בשלב 5.4) על-ידי רטובה: יחס משקל יבש של איבר מסוים ריבית (שחושבו בצעד 7.2).</li>
	<li>לחשב את הערכים620 OD מתוקן . החל יתר620 ערך מכל קידוח ניסיוני של צלחת 96-ובכן (מכיל אוונס חלוטים כחול formamide מרקמות כל, שהושג בשלב 6.3), לחסר ריק טוב OD620 הערך (את יתר620 הערך הממוצע של שתי הבארות המכיל formamide טהור, מוכן בשלב 6.2, כמנת620 הערכים שהתקבלו בשלב 6.3) מכל ערך ניסיוני.</li>
	<li>לחשב את הערך extravasation פלזמה על-ידי חלוקת את המתוקן OD620 (שלב מחושבים ב- 7.4) לפי המשקל היבש של הרקמה חצי formamide (שלב מחושבים ב- 7.3). היחידות של פלזמה extravasation יהיה OD620/g משקל יבש.</li>
	<li>ניתוח נתונים, אקספרס כמו הממוצע ± ב- SEM סטטיסטית להשוות בין קבוצות על ידי מבחן t או בכיוון אחד השונות מבחן מרובה-השוואה של Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), לפי הצורך.</li>
</ol>

<ol><li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li>
<li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li>
<li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062(2013).</li>
<li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li>
<li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).</li>
<li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li>
<li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li>
<li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+fluorescence%3A+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li>
<li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li>
<li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760(2012).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+dysbalance+in+pathology%3A+the+neprilysin+%28NEP%29+and+angiotensin-converting+enzyme+%28ACE%29+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li>
<li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).</li>
<li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li>
<li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li>
<li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li>
<li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Int%22%5BJournal%5D)">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li>
<li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li>
<li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li>
<li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).</li>
<li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כפי שצוין לעיל, המחקר של פלזמה extravasation יוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. באמצעות צבע כחול אוונס, שימוש מוצלח של פרוטוקול extravasation פלזמה (לעיל), הוכח בכתב היד הנוכחי. למרות שהנתונים המוצגים בחזרה ההשערה כי NEP עשויה להגן על להערכת נגד extravasation פלזמה, זו מטרה משנית תוך זמן קצר, עם המטרה העיקרית היא להציג את פרוטוקול אופטימיזציה אשר עשוי לשמש בקלות במעבדה הממוצע עבור מחקר עתידי של פלזמה extravasation. פרוטוקול דיווח בזאת מתמקדת הסתגלות מחקרים עתידי...

דליפת דם באברים מתייחס extravasation, או דליפה של פלזמה דם דרך פערים מיוצר על אנדותל של פוסט venules נימי באיברים. Extravasation פלזמה או חדירות כלי דם מוגבר, אשר עשויה לנבוע סוג מתגובה דלקתית, זו עשויות להיות השלכות חמורות. לכן חשוב כי תופעה זו, את הסיבות, מאפננים, וההשלכות, הם למדו והבינו, באופן דומה, כי החוקרים יש יופי כלים, פרוטוקולים שבה ללמוד אותן. הפערים אנדותל עשויים להיווצר באמצעות שורה של גירויים, אך בדרך כלל מיוצרים על ידי הפעולה של נוירוטרנסמיטורים פפטיד ו/או tachykinins על endothelia. אחד המתווכים המתרחשים באופן טבעי העיקריים של תהליך זה, דבר המתבטא פלזמה מוגברת extravasation, הוא undecapeptide tachykinin neuropeptide, חומר P1.
שיטות כדי לחקור ולמדוד את חדירות כלי דם או פלסמה extravasation, אשר להשתמש במאפיין אלבומין-איגוד של צבע כחול אוונס, פותחו, ידועים בדרך כלל עבור דיוק, פשטות, הכלכלה, ביטחונם, היכולת לאפשר קביעת extravasation פלזמה רקמות כמה בבת אחת, אם כן רצוי2,3,4,5,6,7,8,9 . פרוטוקול זה אוונס כחול להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN משתמשת כל אלה, אך מוסיף כמה שינויים חשובים, זה עושה את זה בדרך כלל שימושי וישימה עבור מחקרים עתידיים, מעורבים הממוצע המעבדה מבצעת או יהיה לנהל מחקרים חשובים של גורמים הקשורים extravasation פלזמה או חדירות כלי דם. ב פרוטוקול זה, חומר P הוא הציג העכברים-1 nmol/ק ג, אשר מרחיב את extravasation של פלזמה על-ידי 1.5-fold. זה מגביר את הרגישות של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך תוצאות הנצפה, השגה בקלות רבה יותר. גורמים נוספים שמשפיעים על חדירות, כמו פפטידים שונים אחרים, כימיקלים או כמה צורות של פגיעה רעילים, עשוי להשתמש בו או נחקר על ידי מעבדות אחרות, כרצונכם. זריקות ומוחלף נמצאים בשימוש פרוטוקול זה להציג את אוונס כחול, חומר P מערכתית, אשר דורש ניתוח מסוף. עם זאת, ומוחלף זריקות5,7,10, גם לאחר התחשבות הטכניקות הנדרשות מסוף כירורגי, קלים יותר לשלוט ולהוביל הייצור של תוצאות עקביות יותר מהאחרים זריקות ורידים, כולל הזנב הווריד זריקות4,9. למרות שזה עשוי להיות אפשרי אוונס כחול מועברת על ידי זריקות סינוסים ורידים רטרו-מסלולית, אין הפניות בספרות נמצאו זה להשתמש בשיטה זו של מסירת אוונס כחול. אולם, לגבי זריקות וריד הזנב, רמה גבוהה של מומחיות ותרגול לשלוט בטכניקה זו reproducibly באופן משמעותי מגביל את השימוש זריקות אוונס כחול מוצלחת. לעומת זאת, בשיטת הזרקת אלטרנטיביות. ווריד הצוואר כפי שמתואר הפרוטוקול שלנו מציע פתרון טכנית השגה. שגרה מכריע עבור זלוף של הוורידים של העכבר, לבצע רק לאחר ההקרבה של אוונס perfused כחול העכבר, מסיר עודפי צבע כחול אוונס, בוצע שעבר סטנדרטיזציה של פרוטוקול זה. שיטות שתואר לעיל זלוף כבר בזהירות בדק, שונה כדי לקבל את ההליך הנוכחי. שינויים אחרים המתוארים כאן הם כל ממוטבת, פשוטה וזולה.
ישנן כמה מגבלות חשובות של השיטה צבע כחול אוונס. לדוגמה, רגישות נמוכה המשויכות לעתים שיטה זו עלולה למנוע כמה נוספים ברוטו פתולוגיים ומאפיינים היסטולוגית בדיקה של רקמות מחיות המוזרק כחול אוונס. עם זאת, אלה ומגבלות אחרות הובילו לפיתוח שיטות אלטרנטיביות ומודלים זה, בכל זאת, עדיין להשתמש אוונס כחול. המדד של אוונס כחול על-ידי קרינה פלואורסצנטית (במקום visual-טווח) ספקטרוסקופיה עשוי להגביר את הרגישות של השיטה. בנוסף, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של אוונס מוכתם כחול רקמות פותחה כדי לאפשר התבוננות דליפת דם מיקומים ברורים יותר11. בנוסף, לכל הגוף הדמיה וסריקה של-חיים בעבר הזריקו אוונס כחול12 מאפשר חקירה של ריכוזים אוונס כחול באופן רציף, במקום ספציפי אחד נבחר הזמן בנקודה של הניסוי. עם זאת, שיטה זו דורש את הזמינות של מתקני הדמיה המתאימה, וזה עשוי להיות יקר מאוד. השינויים הכרוכים אוונס כחול והושמעה בסוג במבחנה של מודל, כגון בתא תרבות או דגם chorioallantoic13 (CAM) גם תוארו. מודלים אלה מפוקח על-ידי קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופ intravital14 , לאפשר כימות של חדירות כלי דם שינויים לאורך זמן, אבל עלול להעלות שאלות הנוגעות דוגמנות מדויק של תנאים ויוו ו אולי גם יקר.
היו שיטות אחרות שפותחו כדי לקבוע ולכמת דליפת דם או חדירות, שאינן כוללות את הניהול של אוונס כחול. שיטות אלה עשויה להשתמש של מולקולה פלורסנט המתאים (כגון אלבומין או fluorescein), או isotopically עם תוויות או אחרת מתויג מולקולה, לחיות חיות (או לתא תרבות או chorioallantoic (CAM) מודלים13, ואחריו לא פולשנית הדמיה (PET סריקה, MRI, מיקרוסקופ intravital, כל הגוף סריקה) או על-ידי פולשני הדמיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)3,12,15. למרות הטכניקות הללו עשויים להציע מספר יתרונות על פני אחרים אוונס שיטות כחול, יש להם גם חסרונות, אשר עשויים לכלול שלהם ניכר המורכבות הנדרשות מומחיות, משאבים, עלויות כספיות גבוהות.
Neprilysin16 (peptidase האנזים NEP, הידוע גם בשם CD10, גברת או Enkephalinase) הוצע להיות מעורב עיכוב פלזמה extravasation, לפחות בחלקו, דרך מטבוליזם אנזימטי איון אנדוגני פ חומר לפיכך, ברקמות שבו מתרחשת תא השטח peptidase NEP, ייתכנו הנחתה השפעת חומר P, ככל הנראה על ידי פעילות peptidase NEP.
בתחילה, בדקנו עבור חומר P-induced פלזמה extravasation ניצול פרוטוקול זה אוונס כחולה ששונו, עם FVBN פראי סוג (WT) ועכבר נוקאאוט (KO) NEP. NEP מעורבות פלזמה בתוספת חומר P extravasation נחשד ממחקרים אלה הראשונית, אנו מתארים אלה, בהמשך הניסויים תפקיד של NEP מעורבים פלזמה extravasation. עם זאת, המוקד של כתב יד זה אינה NEP או תפקידה פלזמה extravasation, אלא מעדיף extravasation פלזמה הניסויים עצמם. התוצאות NEP הן נציג של סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות שימוש של פרוטוקול זה שונה. השיטה אוונס כחול כדי למדוד פלזמה extravasation יש כבר אופטימיזציה, שינוי, כפי שיתואר בפירוט להלן עבור עכברים FVBN.

<table><tbody><tr><td>איזופלורן</td><td>וטרינר אחד</td><td>200-070</td> קטמין <td>הרדמה בשאיפה</td></tr><tr><td></td><td>וטרינר אחד</td><td>200-055</td><td>הזרקה הרדמה</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td>מעבדות לויד</td><td>139-236</td> מזרקי <td>הרדמה להזרקה</td></tr><tr><td>(10,3 ו-1 סמ"ק)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>מחטים (20G1,23G1 & 26G1/2)</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>תא אינדוקציה איזופלורן</td><td>VetEquip</td><td>941443</td> מעגלי נשימה אף <td>1 ליטר</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>בקר מעגל מכרסמים 2</td></tr><tr><td>מיכל חמצן</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100%</td></tr><tr><td>כרית חימום</td> רפואית <td>CWE Inc.</td><td>בקר טמפרטורה</td> <td>TC-1000</td></tr><tr><td>בדיקת טמפרטורת פי הטבעת</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td> איזון <td>עכבר</td></tr><tr><td>(למכרסמים)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מספריים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15000-00</td><td>Vannas מספריים קפיצים להב ישר 3 מ"מ (כלי חיתוך)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11151-10</td><td>מלקחיים עדינים במיוחד (בידוד כלי עכבר)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-המוסטטים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>13009-12</td><td>המוסטטים של הלסטד-יתושים (ניתוח קהה, החזקת רקמה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים -נהגי תפרים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>12502-12</td><td>נהגי תפרים אולסן-הגר (תפירה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>בסדר כלים מדעיים</td><td>11627-12</td><td>מלקחיים תנין אדסון-בראון (אחיזת רקמות תפירה, חולדה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מספריים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>14110-15</td><td>מספריים בחיתוך קשיח מאיו 15 ס"מ (ניתוח, דיסקציה, עצמות, חולדה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>18025-10</td><td>מלקחיים לקשירת תפרים (משמשים ל-Millar cath)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מספריים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14078-10</td><td>Lexer מספריים לתינוקות ישר (ניתוח, עכבר)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 מלקחיים עדינים (כלי חולדה, דיסקציה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מספריים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>14082-09</td><td>מספריים דיסקטור 12 מ"מ (ניתוח, עכבר חולדה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11051-10</td><td>10 ס"מ מלקחיים של Graefe (אחיזת רקמות, עכבר חולדה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11251-35</td><td>דומונט 5/45 מלקחיים (מבוא לכלים)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מחזירים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>17012-11</td><td>מחזירי וייטלנר 2/3 שן (כירורגית חולדות)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11294-00</td><td>דומונט #4 מלקחיים (בידוד כלי דם חולדות, עכברים)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>פיין כלים מדעיים</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 מלקחיים (אחיזת רקמות, דיסקציה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מספריים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>14058-11</td><td>מספריים קשתית חתוכה קשה (דיסקציה של עכבר, עצמות)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11009-13</td><td>מלקחיים משוננים ומעוקלים של סמקן (אחיזת רקמות, חולדת עכבר)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-המוסטטים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>13003-10</td><td>המוסטטים מעוקלים של הרטמן (ניתוח קהה, החזקת רקמה)</td></tr><tr><td>כלים כירורגיים-מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11006-12</td><td>מלקחיים משוננים של אדסון (אחיזת רקמות)</td></tr><tr><td>קוצץ</td><td>קלטת אוסטר</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישרברנד</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>משחת דמעות מלאכותית</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>לידוקאין</td><td>הוספירה</td><td>0409-4277-01</td> צנתרי פוליוויניל <td>2% הניתנים להזרקה</td></tr><tr><td></td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>אוונס כחול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>חומר P</td><td>Bachem&nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>תמיסת מלח 1000 U/ml</td></tr><tr><td></td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% נתרן כלורי</td></tr><tr><td>פנוברביטל&nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4417-50TAB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes לספיגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-איזון</td><td>דנבר מכשיר</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן 96 צלחת באר</td><td>בקטון דיקנסון</td><td></td> צלחת ספיגה 351172 <td></td></tr><tr><td> קורא</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל פוליאקרילאמיד</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>חלבון משקל מולקולרי סטנדרטי</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran נתמך ניטרוצלולוז</td><td>אמרשם (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>קופסת ג'ל</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר מדעי</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן פוליקלונלי ראשוני NEP&nbsp;</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין צ'או</td><td>טקלד (HARLAN)</td><td>TD.130750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>עכברים מסוג פרא FVB/NJ</td><td>ג'קסון</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני (אנטי ארנב עז)</td> <td>ZyMed</td><td>81-6120</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ECL-Western Lightening Plus</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td>פירס</td><td>34091</td><td></td></tr></tbody></table>

אוונס ממוטבת כחול פרוטוקול כדי להעריך את דליפת דם העכבר

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

דליפת דם, או פלזמה extravasation, יש מספר סיבות, עשוי להיות עם תוצאה חמורה או סימפטום מתגובה דלקתית. מחקר זה עשוי להוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. חשוב כי החוקרים יש כלים מתאימים, כולל את השיטות הטובות ביותר הזמינות, לימוד פלזמה extravasation. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול, שימוש בשיטת הצבע הכחול אוונס, להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN. פרוטוקול זה היא פשוטה במכוון, כדי גדול תואר ככל האפשר, אבל מספק נתונים באיכות גבוהה. אוונס כחול צבע נבחר בעיקר כי זה קל עבור המעבדה הממוצע להשתמש. השתמשנו פרוטוקול זה לספק ראיות ותמיכה עבור ההשערה כי neprilysin האנזים עשויה להגן את להערכת כנגד פלזמה extravasation. עם זאת, פרוטוקול זה ייתכן השפעול בשימוש ויש להתאים בקלות לשימוש זנים אחרים של עכברים או מינים אחרים, רבים איברים שונים או רקמות, עבור מחקרים אשר עשוי לכלול גורמים אחרים, חשובים להבנת, מניעת או לטיפול extravasation פלזמה. פרוטוקול זה הותאם בהרחבה, שונה מן הפרוטוקולים הקיימים, המשלב אמינות, להקל על השימוש, הכלכלה, ואת הזמינות הכללית של חומרים וציוד, הפיכת פרוטוקול זה מעולה עבור המעבדה הממוצע להשתמש ב לכימות פלזמה extravasation של איברים.

איור 1, תיאור סכמטי של התהליך מוצג, אשר נמצא את התוצאה הערכים extravasation עקבי ואמין ביותר של חומר P-induced פלזמה, מן האיברים של עכברים FVBN. הליך זה בדרך כלל לוקח שני ימי עבודה, מופרדים על-ידי לפחות 48 שעות של זמן המתנה. זה אפשרי להפיץ את זה אפילו יותר, אם זה נעשה באופן עקבי עבור כל ניסויים לצורך השוואה. לדוגמה, לאחר האברים מבודדות על יום 1, האיברים ניתן פלאש קפוא חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס; על בקפידה מפשיר את האיברים (תוך כמה ימים עד שבוע 1),...

במאמר זה מתואר פרוטוקול חסכוני, אופטימיזציה, ופשוט אשר משתמשת בשיטת צבע כחול אוונס להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN אשר ניתן להתאים לשימוש זנים אחרים, מינים, ואת שאר איברים או רקמות.

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להעריך ולכמת באופן יחסי אקסטרוואזציה או דליפה של פלזמה באיברים של עכברים או מינים אחרים של בעלי חיים קטנים באמצעות שיטת Evans Blue Dye שונה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום כלי הדם כגון, אילו גורמים אנדוגניים או אקסוגניים משנים את אקסטרוואזציה של פלזמה במין או איבר ספציפי מעניין? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שלמרות שצנתור דורש מידה צנועה של יכולת כירורגית, השיטה מספקת גישה ורידית עמידה וניתנת לשחזור מעכבר לעכבר.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל הקושי הניתוחי הצנוע של מיקום הצנתר. לאחר שקילת עכבר FVB NJ בוגר בן 16 עד 20 שבועות, אשר חוסר תגובה לצביטה בבוהן וגלח את אזור הצוואר הגחוני של החיה. הנח את העכבר במצב שכיבה על כרית שחוממה מראש והדביק את כל ארבע הכפות למשטח הניתוח.מרחו משחה על עיני החיה כדי למנוע התייבשות. בצע חתך של סנטימטר אחד בצוואר הגחון הימני מעל וריד הצוואר. יש למרוח טיפה אחת או שתיים של 1-2% לידוקאין על אזור החתך לטיפול בכאב ולקידום הרחבת כלי הדם.בודד את וריד הצוואר הפנימי הימני באמצעות דיסקציה קהה. קושרים את הווריד בתפר 4-0 ומשתמשים בהמוסטט כדי למשוך בעדינות את הקצה הרוסטרלי של הכלי. בעזרת מספריים עדינים חותכים חור כשלושה מילימטרים זנב לתפר ובערך באמצע קוטר הווריד.לאחר מכן, הכנס קטטר פוליוויניל PV1 לווריד הצוואר דרך החור והשחיל את הקטטר כ-1.5 סנטימטרים לכיוון הקצה הזנבי של הכלי. השתמש בתפר 4-0 חדש כדי לקשור את הקטטר בצורה מאובטחת בתוך החלק הזנבי של הכלי ולקשור את החלק הרוסטרלי של הכלי לחלק החיצוני של הצנתר עם הקצוות הרופפים של התפר ששימש במקור לקשירת וריד הצוואר הרוסטרלי. הדביקו את העור בחזרה בצורה רופפת סביב הצנתר עם חתיכה נוספת של תפר 4-0 כדי למנוע התייבשות, אובדן חום גוף והתייבשות רקמות.לאחר מכן, חבר את הקטטר למזרק המכיל תמיסת מלח הפרינית ושטוף את הקטטר בתמיסת המלח. כדי להעריך את האקסטרוואזציה והדליפה מהאיבר המבוקש, יש להזריק תחילה 50 מיקרוליטר של תמיסת אוונס בלו לתוך קטטר וריד הצוואר, ולאחר מכן נפח קטן של מי מלח שעברו הפרין כדי לשטוף את הקו. שתי דקות לאחר מכן, הזריק 100 מיקרוליטר חומר P לתוך הצנתר, ולאחר מכן שטיפה שנייה של מי מלח שעברו הפרין.שמונה עשרה דקות לאחר הזרקת חומר P, פתח את חלל החזה של החיה וכוח הכבידה החדיר את הלב וכלי הדם עם 50 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט 50 מילי-מולרית כדי להסיר את עודפי אוונס בלו מתוך כלי הדם. קצור את האיברים והרקמות המעניינים והסר את כל התוכן הנותר לכל רקמה לפי הצורך. שוטפים את האיברים ב- PBS בטמפרטורת החדר, מכתים את האיברים במגבון מעבדה וחותכים כל איבר לשניים.השג את המשקולות הרטובות של כל חצי איבר על איזון וייבש 1/2 מכל איבר על חתיכת נייר כסף בתנור ייבוש בחום של 150 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, הניחו את החצי השני של כל איבר בעד 200 מיקרוליטר פורממיד בצינור מיקרופוגה למשך 48 עד 72 שעות למיצוי צבע כחול של אוונס. עכברי נוקאאוט של נפריליזין מדגימים אקסטרוואזציה מוגברת של פלזמה המושרה על ידי חומר P משלפוחית השתן בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר, מה שמרמז על תפקיד של נפריליזין בוויסות השלילי של אקסטרוואזציה של פלזמה המושרה על ידי חומר P משלפוחית השתן.טיפול בדוקסיציקלין בעכברים טרנסגניים לביטוי יתר של נפריליזין במשך שבוע להפעלת ביטוי יתר של נפריליזין מצביע על תפקיד נוסף לאנזים זה באקסטרוואזציה של התריסריון מכיוון שבעלי חיים טרנסגניים שטופלו בדוקסיציקלין מציגים אקסטרוואזציה מופחתת משמעותית של פלזמה המושרה על ידי חומר P מהתריסריון בהשוואה לכל שלוש קבוצות בעלי החיים שאינה נצפית לאחר טיפול בדוקסיציקלין בחיות בר או נוק-אאוט. לאחר השליטה, ניתן להשלים את שלבי הצנתור, ההזרקה ובידוד האיברים תוך 45 עד 55 דקות אם הם מבוצעים כראוי. אפשר יומיים-שלושה נוספים לשארית הפרוטוקול.כאשר לומדים לראשונה את הטכניקה הזו, חשוב לחזור על ההליך לפחות ב-10-20 חיות תרגול לפני ביצוע ניסוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך ולכמת באופן יחסי אקסטרוואזציה או דליפה של פלזמה באיברים של עכברים או מינים אחרים של בעלי חיים קטנים באמצעות שיטת Evans Blue Dye מותאמת זו.

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים הזרקה תוך-מוחית בתיווך אומאיה במודל עכבר. השיטה מאפשרת אספקה מקומית של תרופות מועמדות פוטנציאליות וחומקת ממחסום הדם-מוח.

הזרקה תוך-מוחית בעכבר: שיטת ניהול תרופות ישירה בתיווך אומאיה להעברת תרופות לחדרי המוח במוח עכבר

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

תגובות אלרגיות, המתאפיינות בהפעלת תאי מאסט ובזופילים, מונעות על ידי הקישור הצולב של IgE והשחרור של מתווכים מעודדי דלקת. הערכה כמותית של תגובות אלרגיות יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בצבע כחול אוונס לעקוב אחר שינויים בחדירות כלי דם לאחר אתגר אלרגן.

מדידת אנפילקסיס המקומי בעכברים

כדי לחקור את חדירות מחסום הדם-רשתית ואת שלמות הממברנה המגבילה הפנימית במודלים של מחלות רשתית בבעלי חיים, השתמשנו במספר גרסאות של נגיף הקשור לאדנו-(AAV) ככלים לתיוג נוירונים ברשתית וגליה. ביטוי גן מדווח בתיווך וירוס משמש לאחר מכן כאינדיקטור לחדירות מחסום הרשתית.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

המטרה הכוללת של נוהל זה היא לספק טכניקה מאוד לשחזור להערכת ויוו של ערעור מחסום הדם - מוח במודלים עכברוש של שבץ איסכמי.

הערכה In Vivo של מחסום הדם - מוח שיבוש במודל של עכברים של שבץ איסכמי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדוד לדליפת דם הנגרם על ידי המינהל intradermal מהסוכנים קידום חדירות לתוך העור מאתר. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את היכולת של מולקולות מקדמים או מעכבים זליגת וסקולרית או לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים חדירות כלי דם.

הערכת סוכנים בתדר Hyperpermeability כלי דם בעור עם וזמינותו Miles

פרוטוקול זה מתאר טכניקה חדשנית של מדידת שלושת הפרמטרים החשובים ביותר של פגיעה מוחית איסכמית על אותה קבוצה של דגימות מוח מכרסמים. שימוש במדגם מוח אחד בלבד הוא יתרון גדול במונחים של עלויות אתיות וכלכליות.

מדידת בצקת מוחית לאחר שבץ מוחי, אזור אוטם ופירוק מחסום דם- מוח בערכה אחת של דגימות מוח מכרסמים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לחסימת ורידים ברשתית באמצעות ורד בנגלי ומערכת מיקרוסקופ הדמיית רשתית מונחה לייזר עם המלצות למקסם את יכולת השחזור שלה בזנים מהונדסים גנטית.

אופטימיזציה של מודל העכבר לחסימת ורידים ברשתית כדי להגביל את השונות

כאן אנו מציגים שלושה פרוטוקולי ניתוח נתונים עבור אנגיוגרפיה פלואורסצנטית (FA) וטומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית (OCT) במחקר של חסימת ורידים ברשתית (RVO).

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית

פותחה שיטה להמחשת אקסטרוואזציה של צבע עקב פירוק מחסום דם-מוח (BBB) על ידי מתן שני צבעים פלואורסצנטיים לעכברים בנקודות זמן שונות. השימוש בגליצרול כחומר קריאופרוטקטנט הקל על אימונוהיסטוכימיה באותה דגימה.

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

למדו שיטת צבע אוונס מותאמת להערכת דליפת פלזמה באיברי עכברים FVBN. פרוטוקול זה מאפשר מדידה אמינה של חדירות כלי דם במחקר וסקולרי.

אוונס ממוטבת כחול פרוטוקול כדי להעריך את דליפת דם העכבר

גלה סרטונים נוספים