In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את החדירות של כלי הדם במוח בעכברים באמצעות עוקבים עם תווית פלואורסצנטית כדי להעריך תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח במודלים של בעלי חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחסום הדם-מוח הנוגעות לחדירות נוירו-וסקולרית במחלות והחלמתה לאחר הטיפול. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא פשוטה וכמותית.

זה נותן אפשרות להערכה מקבילה של חדירות על ידי פלואורומטריה, שהיא כמותית, וגם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להגנות אזוריות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול במספר הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולי מוח, שבץ מוחי ומחלת אלצהיימר מכיוון שמחלות אלו קשורות לבצקת מוחית מסכנת חיים ולשיפור תפקוד BBD כמטרה טיפולית מרכזית. מי שתדגים חלק מההליך תהיה גברת ג'דרנקה מקאס, קצינת טכנולוגיה מדעית במכון.

הזרקה תוך-צפקית לעכברים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת מעקב של שני מילי-מולרים. בחר עוקבים הניתנים לתיקון ליזין, כגון דקסטרנים המסומנים ב-FITC ו-TMR עם ספקטרום פליטת עירור מובהק להפרעה מינימלית בין הצבעים. אם משלבים עוקבים, יש להזריק 200 מיקרוליטר של תמיסת מעקב משולבת תוך צפקית.

כלול זריקות לרכב בלבד כדי לשמש כפקדי דמה להפחתת רקע אוטופלואורסצנטית. לאחר כל הזרקה יש להמתין חמש דקות לפני הרדמה עמוקה של העכברים בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים המאושרים. הכינו את בעלי החיים לזלוף לב 10 דקות לאחר מתן הרדמה.

בדוק את היעדר תגובת עווית הכפות כדי לוודא שהעכבר הגיע למישור הרדמה כירורגי. הניחו את העכבר לעירוי על גבו ומרחו 80% אתנול על עור אזור הבטן. לאחר שימוש במספריים קטנים ליצירת חתך של שני סנטימטרים בדופן הבטן, יש להפריד את הכבד מהסרעפת, ולאחר מכן לחתוך לאט את הסרעפת, תוך חשיפת חלל הרבים.

חותכים את כלוב הצלעות דו צדדי ומקבעים את עצם החזה החתוכה כדי לחשוף את החדר השמאלי. הכנס מחט פרפר בגודל 21 המחוברת למערכת זלוף פריסטלטית בחלק האחורי של החדר השמאלי. נקבו את הפרוזדור הימני ולאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כשהקצה חתוך כדי לאסוף במהירות את 200 עד 300 המיקרוליטרים של הדם המשוחרר ולהעביר לצינור איסוף סרום.

אחסן את הדם שנאסף על קרח. ברגע שהדם נאסף, הפעל את מערכת הזלוף והחדיר את החיה למשך שלוש דקות עם PBS ללא יונים סידן ומגנזיום בטמפרטורת החדר. העריכו את איכות הזלוף על ידי ציון צבע הכבד והכליות, שנראים חיוורים לאחר הזלוף.

לאחר קצירת המוח, ודא שאין דם גלוי בכלי קרומי המוח. יש להוציא את הדגימה מניתוח החדירות אם איכות הזלוף ירודה. השתמשו באזמל כדי להפריד את המוח לשני מוחות חצי-מוחיים.

לאחר מכן נתח את המוח הקטן ואונה הריח מחצי מוח אחד, והעביר את חצי המוח לצינור של שני מיליליטר. הנח כליה אחת שנקטפה בצינור אחר של שני מיליליטר. הניחו מיד את הדגימות על קרח יבש.

הטמיעו באופן טבעי את הכליות והמוח הנותרים עם המוח הקטן ואונות הריח שלמות בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית של TissueTech, והניחו אותה על קרח יבש. לבסוף, לאחר צנטריפוגה של דגימות הדם ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנטים בסרום לצינורות של 1.5 מיליליטר והניחו אותם במיכל הקרח היבש. העבירו את הדגימות למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ככל שיעילות ההומוגניזציה עולה לאחר ההפשרה.

הניחו את דגימות המוח והכליות על קרח להפשרה, ולאחר מכן שקלו את הצינורות המכילים את האיברים. ממשקולות אלה, הפחיתו את הערך הממוצע של כ-20 צינורות ריקים כדי לקבל את משקל הרקמה. הוסף 300 מיקרוליטר PBS קר לצינור המכיל כליה ו-200 מיקרוליטר לצינורות המכילים חצי מוח.

הומוגניזציה של כל דגימה בצינור המיקרופוגה המקורי עם עלי PTFE המחובר למערבל עילי חשמלי, באמצעות כ-15 פעימות. אחסן את הדגימות ההומוגניות על קרח, מוגן מפני אור. שטפו את העלי עם PBS בין הדגימות ונגבו יבש לפני שתמשיכו לדגימה הבאה.

כאשר כל הדגימות הומוגניות, צנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר על קרח לפני שתמשיכו למדידה וכימות פלואורסצנטיים. העבירו את הסופרנטנט לצלחת של 384 בארות והכניסו את הצלחת לקורא הקרינה.

ודא שאורכי גל העירור והפליטה הנכונים כלולים עבור העוקב והגדר את הרווח לאופטימלי. התחל את המדידה וייצא את הנתונים כגיליון אלקטרוני לביצוע החישובים כמתואר בפרוטוקול. ביום הצביעה, הפשירו קטעי קריוסטט של 10 מיקרון המותקנים על שקופיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר מכן, תקן את החלקים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפה מהירה ב-PBS. לחדור ולחסום קשירה לא ספציפית בחלקים על ידי דגירה ב-PBS סטרילי המכיל 1% PSA ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, דגרו את השקופיות עם דילול של 1 עד 100 של נוגדן ראשוני CD31 למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר שטיפה עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת, בצע דגירה משנית של נוגדנים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי ספציפי למין. הרכיבו את החלקים המוכתמים עם Aqua-Poly/Mount והשאירו למשך הלילה לפילמור בטמפרטורת החדר בחושך. לבסוף, רכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית להדמיה ספקטרלית.

על מנת לקבוע את זמן זרימת העוקב לבדיקת החדירות, זמן זרימה ארוך של שעתיים מושווה לזמן זרימה קצר של 15 דקות לאחר הזרקת המעקב. זמן המחזור הארוך יותר של שעתיים מוביל לכמויות נמוכות של הצטברות עוקבים בכליות בהשוואה לזמן מחזור קצר של 15 דקות, פוטנציאלית בגלל דקסטרן FITC מרווח גבוה המוצג בירוק מתא כלי הדם. ההשפעה הזו דרמטית עוד יותר במוח בגלל מחסום הדם-מוח ההדוק.

צביעת CD31 שנראית בתעלה האדומה אישרה את נוכחותם של כלי דם בכליה הן בנקודות הזמן שנבדקו והן במוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות עבור 10 עכברים עם שני מדענים העובדים במקביל. בעת ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור להשתמש בעוקבים של משקל מולקולרי נכון, תרשים ומאפייני פלואורסצנטיות על מנת לענות על השאלות הנוגעות לחדירות מחסום הדם-מוח.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונו-היסטוכימיה ל-BBD ומילוי גורמים למחלה כדי לענות על שאלות נוספות, כמו חומרה ולוקליזציה של אתר המחלה.