Name: In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: למדו להעריך חדירות כלי דם במוח עכברים באמצעות סמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי וויזואלי של תפקוד מחסום הדם-מוח במחלות נוירולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר קונסורציום Sphingonet במימון קרן Leduq לתמיכה עבודה זו. עבודה זו גם נתמך על ידי המרכז לחקר שיתופי "בידול וסקולרית ובניה" (CRC / Transregio23, פרויקט C1) ועל -ידי 7. FP, COFUND, גתה הבינלאומי פוסטדוק תוכנית קדימה-פנימה, מס 291776 מימון. אנו עוד יותר להכיר קתלין זומר לסיוע טכני שלה עם עכברים טיפול ו genotyping.

כל החיות שטופלו עם ש"צריך מזעור כאב או אי נוחות במהלך ההליך. הליך זה עוקב אחר ההנחיות טיפול בבעלי חיים של מוסדנו, אושרה על ידי הוועדה המקומית (Regierungspraesidium דרמשטט, אישור מספר FK/1044).
תיאור סכמטי של השלבים בעבודה ויוו חדירות assay בעכברים מוצג באיור1. הפרטים של כל שלב שיפורטו להלן.
1. לטיפול בבעלי חיים
<ol><li>
הכנה וניהול של המשדרים, הרדמה
	<ol>
<li>להכין תבניות שפופרות שכותרתו רקמות הטבעה לפחות יום לפני וזמינותו חדירות. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוטוקול על ידי עובד תחת מכסה המנוע נקי fume באמצעות כלים לנקות עם 80% אתנול. השתמש זכר או נקבה פראי-סוג (WT) או angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה CD1 (GOF) עכברים בקבוצת הגיל מבוגר בוגר של 3-6 חודשים עבור פרוטוקול הנוכחי. לבצע genotyping של העכברים כפי שתואר לעיל 10. הערה: 80% אלכוהול לא יביא כלי סטרילי אך יצמצם זיהום של הדגימות מוכן.</li>
		<li>לדלל את כל המשדרים ב- PBS סטרילי לתוך 2 מ מ מניות ולאחסן את aliquots מוגן מפני אור ב-20 ° C.</li>
		<li>לבחור המשדרים כגון (Tetramethyl Rhodamine) TMR, (fluorescein isothiocyanate) FITC עם עירור ברורים/פליטת ספקטרום וכי הן ליזין שניתן לתקן וכתוצאה להפרעה מזערית בין צבעים הן על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (באמצעות את TMR או FITC לסנן בהתאמה) על ידי fluorometry ב קורא צלחת עבור וזמינותו חדירות. הערה: TMR לתוספי 3 kD, FITC לתוספי 3 kD השתמשו במחקר הם שני ליזין ניתן לתיקון, ומכאן יכול גם לשמש עבור קיבוע שאחרי ניתוח immunohistochemical עם aldehydes על מנת לחקור הבדלים אזוריים.</li>
		<li>להתמודד עם כל החיות עם ש"צריך לבצע את ההנחיות לטיפול מוסדי. מזריקים intraperitoneally העכבר כל 100 פתרון מעקב µL אשר ניתן להגדיל עד 200 µL כאשר מעקב נוספים משולב באמצעות µL 100 של מעקב כל10,1:1 לערבב13. מזריקים חיה אחת לפחות PBS לבד במקום המשדרים כדי לשמש המזויפים למזגן autofluorescence רקע חיסור.</li>
		<li>5 דקות לאחר ההזרקה tracer, עזים ומתנגד החיה עם זריקה מקומות של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (100 מ ג ו- 5-10 מ"ג ב- 0.9% תמיסת מלח לכל ק"ג גוף משקל בהתאמה, µL 150 של. הקוקטייל לכל 25 g העכבר). הערה: משחה הוטרינר לא הוחל על העיניים במהלך ההליך כמו בתקופה שבין בעלי חיים הרדמה והקרבה/זלוף היה קצר (10 דקות) שבו כל ייבוש העיניים לא נצפתה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דם הלב ואוסף זלוף
	<ol>
<li>להכין את החיות זלוף לב 10 דקות לאחר הרדמה. בדוק היעדר תגובה עווית כפה על מנת להבטיח כי החיה הגיע מטוס כירורגי של הרדמה.</li>
		<li>לשים את בעלי החיים שלהם בחזרה ולהחיל 80% אתנול על העור של אזור הבטן. בעזרת מספריים קטנות, לפתוח את קיר הבטן עם חתך קטן (2 ס מ) רק מתחת לצלעות. להפריד בין הכבד מהסרעפת ולאחר מכן לאט לחתוך דרך הסרעפת לחשוף את חלל הצדר 15.</li>
		<li>לחתוך את כלוב הצלעות בשני הצדדים ותקן עצם החזה שנגזרו על מנת לחשוף את החדר השמאלי. הכנס מחט 21-מד פרפר מחובר דרך מערכת סינון זלוף. הצד האחורי של החדר השמאלי.</li>
		<li>לנקב אטריום ימין במהירות (תוך 10 s) לאסוף 200-300 µL של דם שוחרר לתוך הפתח שבחזה באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל (עם סיום ניתוק) בסרום אוסף צינורות ולאחסן אותו בקרח. הערה: הליך זלוף זה ההישרדות.</li>
		<li>ברגע הדם נאסף, אדליק את המערכת זלוף (10-12 סל ד, 5 mL/min), perfuse החיה למשך 3 דקות עם חמים (RT) 1 x ל- PBS (חינם של Ca2 /מ"ג2 + יונים). הערה: PBS המכיל Ca2 +/Mg2 + יונים יכול להיות מנוצל עבור פעילות הלב טוב יותר במהלך זלוף. הסכום הכולל של PBS המשמש זלוף הוא בטווח של 15-20 מ.</li>
		<li>להעריך איכות זלוף מאת וציין את הצבע של הכבד, הכליות, אשר מופיעים לבן/חיוור לאחר זלוף. הערה: בכליות או בכבד זלוף אינן מצביעות בהכרח על המוח זלוף כמו עורקים (עורק הצוואר/בחוליות) מתוכניות המוח של אבי העורקים עלול לקבל נקרע במהלך הכנת בשלב 3 במיוחד במהלך הניקוב פרפור.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ברקמה
<ol><li>אורגן איסוף ואחסון
	<ol>
<li>בסוף זלוף, לאשר את מותו של החיה על ידי נקע בצוואר הרחם, המוח מסיק והכליות. ודא זלוף המוח לפי הצבע של המוח (גלוי דם בכלי של קרומי המוח), כדי לא לכלול את החיות מניתוח חדירות כאשר איכות זלוף אינה טובה. הפרד בין המוח לתוך 2 hemibrains באמצעות אזמל (איור 1).</li>
		<li>לנתח עם האזמל hemibrain אחד ללא הריח אונות, המח ולהעביר את hemicerebrum צינור 2-mL. לאחסן המי-המוח הקטן צינור נוסף אם נדרש להערכת אסטרוציטומה חדירות.</li>
		<li>העברה כליה בודדת עוד צינור 2-mL. לאחסן את הדגימות מיד קרח יבש.</li>
		<li>הטבע באופן מקורי את הכליה הנותרת ואת המי-מוח (הכוללת את המוח ואת הריח אונות) רקמה-tek חיתוך אופטימאליים טמפרטורה (O.C.T) המורכב על קרח יבש.</li>
		<li>בסופו של דבר, centrifuge את דגימות הדם המאוחסן על הקרח סרום אוסף צינורות-10, 000 גרם, 10 דקות ב 4 º c להעביר סרום supernatants 1.5 mL צינורות ומניחים בתוך המיכל קרח יבש.</li>
		<li>העברת כל הדגימות שנאספו על קרח יבש ל-80 מעלות צלזיוס למקפיא עד עיבוד נוסף. הערה: חשוב להקפיא את הדגימות לפני שממשיכים לשלבים המגון כמו המגון מגביר יעילות לאחר כמו הקפאת מפשיר.</li>
	</ol></li>
	<li>המגון, צנטריפוגה
	<ol>
<li>להפשיר על הקרח הדגימות המי-המוח לבין הכליות קפואים למטה ב-80 מעלות צלזיוס ולשקול הצינורות המכילים את האיברים. מכל אלה משקולות, להחסיר את הערך הממוצע של שפופרות ריק מספר (בערך 20) כדי לקבל את המשקל רקמות. להוסיף 300 µL ו- µL 200 קר 1 X PBS כדי הצינורות המכילים הכליה ואת המי-המוח הגדול, בהתאמה. הערה: עבור כמויות נמוכות של רקמות (כמו המי-המוח הקטן, להלן 100 מ"ג) במשקל של צינורות בודדים מומלץ.</li>
		<li>Homogenize כל מדגם בצינור גלאים המקורי עם כבעלי טפלון (PTFE) המצורפת של בחישה תקורה חשמלי (1, 000 סל ד) על-ידי ביצוע כ-15 קווים (קו 1 = 1 למעלה ולמטה 1). לשטוף את המרוסקים עם PBS בין דגימות, לנגב היבש לפני שתמשיך את הדוגמה הבאה. הערה: השימוש דטרגנטים במהלך המגון היה נמנע עקב הפרעה אפשרית עם fluorometry. עם זאת, מעקב תאיים מזוהה גם ב פרוטוקול זה כמו הרקמה ביסודיות הוא הומוגני, אשר יעיל יותר לאחר סיבוב אחד של הקפאת מפשיר.</li>
		<li>לאחסן את הדגימות homogenized על הקרח מוגן מפני האור ואת כולם ביחד בסופו של דבר ב 15,000 g, 20 דקות, 4 ° C ומפרידה שולחן צנטריפוגה. העברה supernatants צינורות 1.5 mL החדש על הקרח מיידית fluorometry או ב- 80 ° C כדי להיות מנותח מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>פלורסצנטיות מדידה ו כמת
	<ol>
<li>אם קפוא בסוף השלב הקודם, להפשיר על קרח את תגובת שיקוע, סרום דגימות רקמה המאוחסנים ב-80 הלעפה תרוטרפמט ולהגן עליהם מפני אור עם מסכל.</li>
		<li>פיפטה µL 50 של סרום מדולל (PBS 1 x µL 30 + סרום µL 20) או רקמה supernatants (כמו) לתוך צלחת שחורה 384-. טוב. כוללים מדגם אחד לפחות מן החי מזויפים עבור supernatants סרום ורקמות להבטיח רקע נכון חיסור, רקמת homogenate הוא בדרך כלל גבוה מזה של PBS משמש את diluent. הערה: ממוצע של 3 חיות דמה יכול לשמש autofluorescence למרות השתנות מעט מאוד בערכים autofluorescence דמה (נתונים לא מוצג) נצפתה. כמות הנסיוב בשימוש יכול להיות מופחת על ידי לדלל אותה עם PBS, אשר יכול גם להגביר את האות לרעש יחס עבור דגימות עם פלורסצנטיות נמוך כגון הדגימות המוח. סרום µL Upto 10 נבחנה לדלל אותה עם 40 µL PBS. ודא כי אין בועות נמצאים הבארות.</li>
		<li>תכניס את הצלחת שחור 384-ובכן לקורא צלחת ופתח תסריט חדש בחירת פלורסצנטיות מדידה.</li>
		<li>להגדיר הרווח של האופטימלית, לשימוש עירור/פליטה (ננומטר) הערכים של 550/580 או 490/520 TMR או FITC dyee בהתאמה ולהתחיל את המדידה כדי להשיג את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs).</li>
		<li>להשתמש את יחידות קרינה פלואורסצנטית raw (RFUs) מהקורא צלחת לחישוב מדד חדירות (PI) לאחר הפחתת את הערכים המזויפים.<ol>
<li>
* אינדקס חדירות (mL/g) = (משקל רקמות רקמות RFUs/g) / (סרום נסיוב RFUs/mL)
</li>
		</ol>
</li>
		<li>למשל חישוב עבור המוח חדירות אינדקס (PI) של החיה GOF1 (טבלה 1):<ol>
<li>GOF1 המוח RFUs - דמה המוח RFUs = 154-22.5 = 131.5</li>
			<li>GOF1 סרום RFUs - בשאם נסיוב RFUs = 38305-27 = 38278</li>
			<li>המוח משקל (g) = 0.195</li>
			<li>סרום נפח (ml) = 0.02</li>
			<li>המוח חדירות אינדקס (10-3 g/mL) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352 הערה: החישובים אינדקס חדירות תשואות ערכים מוחלטים, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. אלה עם זאת ניתן להציג כמו יחסי, כדי להקל על ההשוואה בין 2 קבוצות 12. זו יכולה להיות מושגת על ידי חלוקת החוקר של כל בעל חיים בשתי הקבוצות עם החוקר מתכוון בקבוצת הבקרה, נהיגה הממוצע קבוצת הבקרה באמצעות 1 עדיין שומר את הווריאציה בעלי חיים של אינטר בקבוצת הביקורת. השינוי הזה מספק את הערכים של הקבוצה הניסיונית (או קבוצות) ביחס קבוצת הביקורת מוגדר כ- 1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Immunofluorescence ויזואליזציה של מעקב
	<ol>
<li>חותכים את אבני כליה/חמי-מוח מוטבע באופן מקורי במתחם רקמות-tek (O.C.T) (שלב 2.1) 10 מיקרומטר מקטעים cryostat מוגדר כ-20 ° C ולהעביר הסעיפים על השקופיות ממוקמים בטמפרטורת החדר. ברגע הסעיפים הם יבשים (בערך 30 דקות), העברת שקופיות מקפיא-80 ° C עד השימוש.</li>
		<li>ביום של צביעת, להפשיר את השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לתקן את הסעיפים עם 4% paraformaladehyde (PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריה כביסה מהירה ב- PBS.</li>
		<li>דגירה בסעיפים permeabilization/חסימת מאגר של PBS סטרילי המכיל 1% BSA ו- 0.5% טריטון X-100 pH 7.5 לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה שקופיות עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר עם נוגדן ראשוני CD31 (0.5 מ"ג/מ"ל, כפיל MEC 13.3), מעורבבת עם בטחונות במאגר המכיל PBS סטרילי, BSA 0.5%, 0.25% טריטון X-100 (pH 7.2) ואחריו שלושה שוטף 5 דקות ב- PBS.</li>
		<li>לבצע נוגדנים משניים הדגירה במאגר לעיל לשעה בטמפרטורת החדר עם תלויי מין fluorescently שכותרתו שבערך מדולל נוגדנים (2 mg/mL). עבור CD31, ניתן להשתמש עז אנטי חולדה אלקסה 568 או אלקסה 488-לדילול שבערך. כוללים דאפי (300 מיקרומטר) בהנוגדן משני לערבב (1:1, 000 דילול מן המלאי) כתם על הגרעינים.</li>
		<li>הר הסעיפים ויטראז'ים עם polymount אקווה ולהשאיר אותה ללילה עבור הפילמור בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
		<li>לרכוש תמונות באמצעות לייזר קונפוקלי ספקטרלי הדמיה במיקרוסקופ מערכת סריקה. לנתח את התמונות על-ידי תוכנת אלמנטים ש"ח (גירסה 4.3). תוכנות כגון פוטושופ ניתן לדור של דמויות מונטאז.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16371949">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26590417">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT-1+glucose+transporters+in+the+blood-brain+barrier%3A+differential+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation.</a> Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).</li>
<li>Banks, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood-brain+barrier+to+blood-brain+interface%3A+new+opportunities+for+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery.</a> Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer%27s+disease+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).</li>
<li>Paganetti, P., Antoniello, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+efflux+of+amyloid-%CE%B2+peptides+through+the+blood-brain+barrier+by+muscarinic+acetylcholine+receptor+inhibition+reduces+pathological+phenotypes+in+mouse+models+of+brain+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis.</a> Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).</li>
<li>Devraj, K., Poznanovic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BACE-1+is+expressed+in+the+blood-brain+barrier+endothelium+and+is+upregulated+in+a+murine+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).</li>
<li>Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease.</a> Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).</li>
<li>Gurnik, S., Devraj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2-induced+blood-brain+barrier+compromise+and+increased+stroke+size+are+rescued+by+VE-PTP-dependent+restoration+of+Tie2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling.</a> Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).</li>
<li>Scholz, A., Harter, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-derived+angiopoietin-2+is+a+therapeutic+target+in+treatment-naive+and+bevacizumab-resistant+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma.</a> EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).</li>
<li>Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoside+diphosphate+kinase+B+regulates+angiogenic+responses+in+the+endothelium+via+caveolae+formation+and+c-Src-mediated+caveolin-1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cerebral+blood+flow+and+metabolism%3A+official+journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation.</a> Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).</li>
<li>Ziegler, N., Awwad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Catenin+Is+Required+for+Endothelial+Cyp1b1+Regulation+Influencing+Metabolic+Barrier+Function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).</li>
<li>Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+sphingolipid+metabolism+as+a+putative+mechanism+underlying+LPS-induced+BBB+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption.</a> Journal of Neurochemistry. , (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J Vis Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+Low+Molecular+Weight+Fluorescein+Isothiocyanate+%28FITC%29-Dextrans+to+Assess+Blood-Brain+Barrier+Disruption%3A+Technical+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+stroke+research%22%5BJournal%5D)">High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations.</a> Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+control+key+neurovascular+functions+and+neuronal+phenotype+in+the+adult+brain+and+during+brain+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.</a> Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).</li>
<li>Banks, W. A., Gray, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption%3A+roles+of+cyclooxygenase%2C+oxidative+stress%2C+neuroinflammation%2C+and+elements+of+the+neurovascular+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> Journal of Neuroinflammation. 12, 223(2015).</li>
<li>Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+claudins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Structure and function of claudins.</a> Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).</li>
<li>Johansson, B. B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-4-431-67899-1_5">Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx.</a> Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).</li>
<li>Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. <a target="_blank" href="http://www.fasebj.org/content/22/1_Supplement/734.1.short">Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules.</a> The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).</li>
<li>Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+mediates+internalization+of+Fc+in+transfected+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).</li>
<li>Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-pore+model+describes+transport+properties+of+bovine+retinal+endothelial+cells+in+normal+and+elevated+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).</li>
<li>Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+endothelial+cell+surface+marker+is+suppressed+during+differentiation+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מחסום הדם - מוח בתפקוד מזוהה עם מספר רב של הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולים במוח העיקרי והמשני או שבץ מוחי. התפלגות BBB קשורה לעיתים קרובות עם בצקת CNS סכנת חיים. הבהרה של המנגנון המולקולרי המפעילות את פתיחת או סגירת BBB ולכן חשיבות טיפולית בהפרעות נוירולוגיות, בדרך כלל נחקר על ידי חוקרים. עם זאת, שיטות לחקור BBB חדירות ויוו דיווחו בספרות, הקשורים לעתים קרובות עם קשיים טכניים תלויים כימות מייגע וסובייקטיביות של קרינה פלואורסצנטית תמונות17,18 ,...

מחסום הדם - מוח (BBB) מורכב microvascular אנדותל התאים (ECs) נתמך על ידי הדוק pericytes (אישיים), אשר ensheathed בתוך הנדן הבזליים, ו האסטרוציטים (ACs) זה לעטוף את קרום המרתף ברגליים הסוף-1 ,2. ECs אינטראקציה עם מספר סוגי תאים תומכים, לווסת את הפונקציה מכשול, בעיקר ACs ומחשבים, גם נוירונים ואת מיקרוגלייה, אשר כולם יחד יוצרים יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). NVU היא קריטית עבור הפונקציה של BBB, אשר מגביל את התעבורה של רעלים נישא בדם, פתוגנים מלהיכנס המוח. פונקציה זו היא תוצאה של מולקולות חזק-צומת claudin-5, occludin, zonula occludens-1, אשר נמצאים בין ה-ECs וגם עקב הפעולה של מובילי כגון p-גליקופרוטאין (P-gp) בזרימת את מולקולות מזין את אנדותל בחזרה כלי לומן1,2,3. BBB עם זאת מאפשר עבור הובלה של מולקולות חיוניים כגון חומרים מזינים (גלוקוז, ברזל, חומצות אמינו) על ידי מובילי ספציפיים הביע על2,31,ממברנות פלזמה EC. השכבה EC הוא מקוטב מאוד לגבי חלוקת למעליות שונים בין luminal (דם הפונה) לבין abluminal (המוח הפונה ממברנות) כדי לאפשר וקטורי וספציפית התחבורה פונקציה4,5 . בעוד BBB הוא מגן ביחס בחוזקה המסדיר את חצרו CNS, זה אתגר גדול עבור משלוח סמים CNS מחלות כגון פרקינסון עם BBB פונקציונלי. אפילו במחלות נוירולוגיות עם תפקוד לקוי של BBB, זה לא יכול להניח כי משלוח סמים המוח מוגברת במיוחד בזכות תפקוד המחסום יכול לכלול נזק על מטרות טרנספורטר ספציפי למשל כמו מחלת אלצהיימר (AD). לספירה, מספר שנאים עמילואיד ביתא כגון LRP1, זעם, P-gp ידועים להיות dysregulated, ומכאן מיקוד שנאים אלה עשוי להיות חסר תועלת6,7,8. BBB היא נפגעת מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ מוחי, לספירה, דלקת קרום המוח,-טרשת נפוצה, ואת המוח גידולים9,10,11. שחזור הפונקציה מכשול הוא חלק חיוני של האסטרטגיה הטיפולית, ובכך בהערכתו הוא קריטי.
בעבודה זאת, שתיארנו אובייקטיבית, הפרוטוקולים כמותית של חדירות assay בחולדות כי אנחנו הוחלו בהצלחה מספר קווים העכבר בשתי מחלות הטרנסגניים וניסויים מודלים10,12,13 ,14. השיטה מבוססת על זריקה בקרום הבטן פשוטה של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף של העכברים כדי להסיר את המשדרים תא כלי הדם. למוח ולאיברים נוספים הם פוסט שנאספו זלוף, חדירות לאומדן אובייקטיבית ואינדקס חדירות מוחלטת על סמך מדידות קרינה פלואורסצנטית של רקמת homogenates ב קורא צלחת. כל הערכים פלורסצנטיות raw מתוקנות על רקע באמצעות רקמות homogenates או סרום מחיות המזויפים שאינם מקבלים כל מעקב. Normalizations בשפע כלולים עבור נפח סרום נסיוב פלורסצנטיות, המשקל של הרקמות, ובכך מניב אינדקס חדירות מוחלטת, השוואה בין סוגי רקמות ניסויים. כדי להקל על ההשוואה בין הקבוצות, ערכי אינדקס חדירות מוחלט יכול בקלות להיהפך ל יחסי כפי שאנחנו ביצע בעבר12. במקביל, מאוחסנות המי-המוח וכליות יכול להיות מנוצל להמחשת נותב על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ10. מיקרוסקופיה זריחה קלאסי יכול להיות יקר בהשגת אזורי השוני חדירות אמנם מסורבלת עקב בחירה סובייקטיבית של מקטעי רקמת ותמונות עבור ניתוח כמותי למחצה. השלבים המפורטים מוצגים בפרוטוקול, הערות נוספות בהתאם לצורך. פעולה זו מספקת את המידע הדרוש לביצוע בהצלחה וזמינותו חדירות ב- vivo בעכברים כי ניתן לשנות אחרים חיות קטנות. הבדיקה ניתן להחיל על סוגים רבים של המשדרים ומאפשר את החיוב ואת הגודל המבוסס על חדירות הערכה ע י שילוב של המשדרים עם פלורסצנטיות ברורים ספקטרה.

<table><tbody><tr><td>טטרמתיל רודמין (TMR) דקסטרן 3kD</td><td>תרמוספישר</td><td>D3308</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) דקסטרן 3kD</td><td>תרמוספישר</td><td>D3306</td><td></td></tr><tr><td>קטמין (קטבט)</td> <td>זוטיס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסילזין (רומפון)</td><td>באייר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% מי מלח</td><td>Fresenius Kabi Deutschland GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek O.C.T תרכובת</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td><td>סיגמא</td><td>252549-1L</td><td>מכינים תמיסה של 4%</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין, שבר V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי CD31 עכברוש, שיבוט MEC 13.3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי חולדה אלקסה 568</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A-11077</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי חולדה אלקסה 488</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A-11006</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>אקווה פולימאונט פוליסיינס</td><td>בע"מ</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>מחט פרפר 21-מד</td><td>BD</td><td>387455</td><td></td></tr><tr><td>סרום צינור איסוף</td><td>Sarstedt</td><td>41.1500.005</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף 2 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>מגבונים מדויקים של Kimtech מגבי רקמות</td><td>Kimberley-Clark Professional</td><td>05511</td><td></td></tr><tr><td>384-well צלחת שחורה</td><td>גריינר</td><td>781086</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות סופרפרוסט בתוספת</td><td></td> עלי PTFE J1800AMNZ <td></td><td>Thermoscientific</td></tr><tr><td></td><td>Wheaton</td><td>358029</td><td></td></tr><tr><td>חשמלי תקורה בוחש</td><td>VWR VWR</td><td>VOS 14</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 550</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C1 הדמיה ספקטרלית קונפוקלית לייזר סריקת מיקרוסקופ מערכת ניקון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרפוזיה פריסטלטית</td><td>BVK Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>5415R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo מחסום הדם - מוח חדירות assay בעכברים באמצעות fluorescently עם התווית המשדרים

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

מחסום הדם - מוח (BBB) היא מכשול מיוחדים מגן microenvironment למוח את הרעלים ואת פתוגנים במחזור ושומר על הומאוסטזיס המוח. האתרים העיקריים של המכשול הם תאי אנדותל של הנימים במוח שתפקידם המכשול נובעת צמתי המערכת צר, מסועי בזרימת הביע על קרום פלזמה. פונקציה זו מוסדר על ידי pericytes, האסטרוציטים היוצרים יחד את יחידת נוירו-וסקולריים (NVU). מספר מחלות נוירולוגיות כגון שבץ, מחלת אלצהיימר (AD), גידולים במוח קשורים עם תפקוד לקוי BBB. הערכה של החדירות BBB לכן חשוב בהערכת חומרת המחלה הנוירולוגית וההצלחה של אסטרטגיות טיפול המועסקים.
אנו מציגים כאן פשוטה אך assay חדירות חזקות זה הוחלו בהצלחה על העכבר מספר מודלים שניהם, גנטית ו ניסיוני. השיטה היא מאוד כמותי ואובייקטיבי לעומת הניתוח פלורסצנטיות מעקב על ידי מיקרוסקופ שמוחל כלל. בשיטה זו, עכברים מוזרקים intraperitoneally עם שילוב של מימית המשדרים פלורסנט אינרטי ואחריו מאלחש העכברים. זלוף הלב של בעלי החיים מבוצע לפני הקטיף במוח, בכליות או איברים אחרים. האיברים הומוגני, centrifuged ואחריה פלורסצנטיות מדידה תגובת שיקוע. דם מן הלב הניקוב רק לפני זלוף משמש לצורך נורמליזציה כדי תא כלי הדם. קרינה פלואורסצנטית הרקמה הוא מנורמל כדי פלורסצנטיות משקל, סרום רטוב להשיג כמותיים מעקב חדירות אינדקס. לאישור נוסף, contralateral המי-המוח יחסית אימונוהיסטוכימיה יכול להיות מנוצל למטרות הדמיה פלורסצנטיות מעקב.

אנחנו הראו לאחרונה כי angiopoietin-2 (אנג-2) רווח-של-פונקציה (GOF) עכברים יש גבוה יותר חדירות כלי דם במוח מאשר עכברים שליטה תנאים בריאים10. בעכברים שבץ הנגרמת, היה זה גם מראה כי העכברים GOF היו חדירות גדולה יותר מאשר הארנבונים מאותה שליטה וגדלים לאוטם גדול יותר. תוצאות אלו מראות תפקיד קריטי של אנג-2 בחדירות-BBB. הפרוטוקול ולכן מנוצל העכברים GOF והשוו אותם כדי לשלוט הארנבונים מאותה לתיאור וזמינותו חדירות ויוו . עם זאת, שיטה זו ניתן להחיל על כל דגם דגם, הטרנ...

כאן נציג של assay חדירות כלי דם במוח העכבר באמצעות הזרקה בקרום הבטן של המשדרים פלורסנט ואחריו זלוף הרלוונטיים מודלים חייתיים של תפקוד לקוי של מחסום הדם - מוח. חמי-המוח משמש עבור הערכת חדירות באופן כמותי, והשני עבור מעקב חזותי/immunostaining. התהליך לוקח ב' 5-6-10 עכברים.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את החדירות של כלי הדם במוח בעכברים באמצעות עוקבים עם תווית פלואורסצנטית כדי להעריך תפקוד לקוי של מחסום דם-מוח במודלים של בעלי חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחסום הדם-מוח הנוגעות לחדירות נוירו-וסקולרית במחלות והחלמתה לאחר הטיפול. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא פשוטה וכמותית.זה נותן אפשרות להערכה מקבילה של חדירות על ידי פלואורומטריה, שהיא כמותית, וגם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להגנות אזוריות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון וטיפול במספר הפרעות נוירולוגיות, כולל גידולי מוח, שבץ מוחי ומחלת אלצהיימר מכיוון שמחלות אלו קשורות לבצקת מוחית מסכנת חיים ולשיפור תפקוד BBD כמטרה טיפולית מרכזית. מי שתדגים חלק מההליך תהיה גברת ג'דרנקה מקאס, קצינת טכנולוגיה מדעית במכון.הזרקה תוך-צפקית לעכברים עם 100 מיקרוליטר של תמיסת מעקב של שני מילי-מולרים. בחר עוקבים הניתנים לתיקון ליזין, כגון דקסטרנים המסומנים ב-FITC ו-TMR עם ספקטרום פליטת עירור מובהק להפרעה מינימלית בין הצבעים. אם משלבים עוקבים, יש להזריק 200 מיקרוליטר של תמיסת מעקב משולבת תוך צפקית.כלול זריקות לרכב בלבד כדי לשמש כפקדי דמה להפחתת רקע אוטופלואורסצנטית. לאחר כל הזרקה יש להמתין חמש דקות לפני הרדמה עמוקה של העכברים בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים המאושרים. הכינו את בעלי החיים לזלוף לב 10 דקות לאחר מתן הרדמה.בדוק את היעדר תגובת עווית הכפות כדי לוודא שהעכבר הגיע למישור הרדמה כירורגי. הניחו את העכבר לעירוי על גבו ומרחו 80% אתנול על עור אזור הבטן. לאחר שימוש במספריים קטנים ליצירת חתך של שני סנטימטרים בדופן הבטן, יש להפריד את הכבד מהסרעפת, ולאחר מכן לחתוך לאט את הסרעפת, תוך חשיפת חלל הרבים.חותכים את כלוב הצלעות דו צדדי ומקבעים את עצם החזה החתוכה כדי לחשוף את החדר השמאלי. הכנס מחט פרפר בגודל 21 המחוברת למערכת זלוף פריסטלטית בחלק האחורי של החדר השמאלי. נקבו את הפרוזדור הימני ולאחר מכן השתמשו בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כשהקצה חתוך כדי לאסוף במהירות את 200 עד 300 המיקרוליטרים של הדם המשוחרר ולהעביר לצינור איסוף סרום.אחסן את הדם שנאסף על קרח. ברגע שהדם נאסף, הפעל את מערכת הזלוף והחדיר את החיה למשך שלוש דקות עם PBS ללא יונים סידן ומגנזיום בטמפרטורת החדר. העריכו את איכות הזלוף על ידי ציון צבע הכבד והכליות, שנראים חיוורים לאחר הזלוף.לאחר קצירת המוח, ודא שאין דם גלוי בכלי קרומי המוח. יש להוציא את הדגימה מניתוח החדירות אם איכות הזלוף ירודה. השתמשו באזמל כדי להפריד את המוח לשני מוחות חצי-מוחיים.לאחר מכן נתח את המוח הקטן ואונה הריח מחצי מוח אחד, והעביר את חצי המוח לצינור של שני מיליליטר. הנח כליה אחת שנקטפה בצינור אחר של שני מיליליטר. הניחו מיד את הדגימות על קרח יבש.הטמיעו באופן טבעי את הכליות והמוח הנותרים עם המוח הקטן ואונות הריח שלמות בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית של TissueTech, והניחו אותה על קרח יבש. לבסוף, לאחר צנטריפוגה של דגימות הדם ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, העבירו את הסופרנטנטים בסרום לצינורות של 1.5 מיליליטר והניחו אותם במיכל הקרח היבש. העבירו את הדגימות למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ככל שיעילות ההומוגניזציה עולה לאחר ההפשרה.הניחו את דגימות המוח והכליות על קרח להפשרה, ולאחר מכן שקלו את הצינורות המכילים את האיברים. ממשקולות אלה, הפחיתו את הערך הממוצע של כ-20 צינורות ריקים כדי לקבל את משקל הרקמה. הוסף 300 מיקרוליטר PBS קר לצינור המכיל כליה ו-200 מיקרוליטר לצינורות המכילים חצי מוח.הומוגניזציה של כל דגימה בצינור המיקרופוגה המקורי עם עלי PTFE המחובר למערבל עילי חשמלי, באמצעות כ-15 פעימות. אחסן את הדגימות ההומוגניות על קרח, מוגן מפני אור. שטפו את העלי עם PBS בין הדגימות ונגבו יבש לפני שתמשיכו לדגימה הבאה.כאשר כל הדגימות הומוגניות, צנטריפוגה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 15, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר על קרח לפני שתמשיכו למדידה וכימות פלואורסצנטיים. העבירו את הסופרנטנט לצלחת של 384 בארות והכניסו את הצלחת לקורא הקרינה.ודא שאורכי גל העירור והפליטה הנכונים כלולים עבור העוקב והגדר את הרווח לאופטימלי. התחל את המדידה וייצא את הנתונים כגיליון אלקטרוני לביצוע החישובים כמתואר בפרוטוקול. ביום הצביעה, הפשירו קטעי קריוסטט של 10 מיקרון המותקנים על שקופיות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר מכן, תקן את החלקים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפה מהירה ב-PBS. לחדור ולחסום קשירה לא ספציפית בחלקים על ידי דגירה ב-PBS סטרילי המכיל 1% PSA ו-0.5% טריטון X-100 למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר החסימה, דגרו את השקופיות עם דילול של 1 עד 100 של נוגדן ראשוני CD31 למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפה עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחת, בצע דגירה משנית של נוגדנים למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי ספציפי למין. הרכיבו את החלקים המוכתמים עם Aqua-Poly/Mount והשאירו למשך הלילה לפילמור בטמפרטורת החדר בחושך. לבסוף, רכוש תמונות באמצעות מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית להדמיה ספקטרלית.על מנת לקבוע את זמן זרימת העוקב לבדיקת החדירות, זמן זרימה ארוך של שעתיים מושווה לזמן זרימה קצר של 15 דקות לאחר הזרקת המעקב. זמן המחזור הארוך יותר של שעתיים מוביל לכמויות נמוכות של הצטברות עוקבים בכליות בהשוואה לזמן מחזור קצר של 15 דקות, פוטנציאלית בגלל דקסטרן FITC מרווח גבוה המוצג בירוק מתא כלי הדם. ההשפעה הזו דרמטית עוד יותר במוח בגלל מחסום הדם-מוח ההדוק.צביעת CD31 שנראית בתעלה האדומה אישרה את נוכחותם של כלי דם בכליה הן בנקודות הזמן שנבדקו והן במוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך חמש עד שש שעות עבור 10 עכברים עם שני מדענים העובדים במקביל. בעת ניסיון טכניקה זו, חשוב לזכור להשתמש בעוקבים של משקל מולקולרי נכון, תרשים ומאפייני פלואורסצנטיות על מנת לענות על השאלות הנוגעות לחדירות מחסום הדם-מוח.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונו-היסטוכימיה ל-BBD ומילוי גורמים למחלה כדי לענות על שאלות נוספות, כמו חומרה ולוקליזציה של אתר המחלה.

an-vivo-blood-brain-barrier-permeability-assay-mice-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מתאר בדיקת חדירות להערכת החדירות של מחסום דם-מוח במבחנה באמצעות מולקולות נתרן פלואורסצאין.

מחסום דם-מוח מחקה בדיקת חדירות: בדיקת מבחנה להערכת החדירות של חיקוי BBB למולקולות עוקבות

סרטון זה מדגים הליך להערכת הפרעה במחסום דם-מוח במודל עכבר EAE. צבעים פלואורסצנטיים בגדלים שונים מוזרקים רטרו-מסלולית וזורמים דרך כלי הדם במוח. הצבע הקטן יותר דולף דרך רווחים לתוך רקמת המוח, ואילו הצבע הגדול יותר נכנס רק אם ההפרעה חמורה, בקורלציה עם מידת הנזק למחסום.

קביעת הפרעה במחסום הדם-מוח באמצעות צבעים פלואורסצנטיים במודל עכבר EAE

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לאמת את שחזור של מודל במבחנה BBB מעורב syngeneic חולדה שיתוף תרבות של תאים והאסטרוציטים אנדותל. Monolayer תא אנדותל הציג Teer גבוה וחדירות LY נמוכות. ביטוי של חלבונים ספציפיים TJ, תגובות פונקציונליות לדלקת ופונקציונליות של מובילים וקולטנים הוערכו.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

מתוארת ומאומתת שיטה להקמת מודל מבחנה של מחסום דם-מוח המבוסס על תרבית משותפת של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח חולדות ואסטרוציטים. מערכת זו הוכיחה את עצמה ככלי תקף לחקר השפעת הננו-פורמולה על חדירת מחסום הטרנס-מחסום של מולקולות פלואורסצנטיות.

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

במחקר זה, אנו מציגים הליך קל ויעיל להערכת שיבוש מחסום הדם - מוח ניווניות בתנאים. כדי להשיג את המטרה שלנו, אנחנו חדורים משקל מולקולרי גבוה fluorescein isothiocyanate מתויג (FITC)-אלבומין לתוך וריד הצוואר העכבר הווריד וההערכה שלה דליפה לתוך parenchyma המוח על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

הערכה של חדירות מחסום הדם - מוח על ידי עירוי תוך ורידי של התווית על-ידי FITC אלבומין במודל של עכברים של מחלות ניווניות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

סמים המיקוד גידולים במערכת העצבים המרכזית היא אתגר גדול. כאן נתאר פרוטוקול לייצר לחקות במבחנה של דם-מוח הגידול-המכשול באמצעות תאים מאתר ו/או האדם, לדון את הרלוונטיות שלהם עבור מהמכונית של מערכת העצבים המרכזית הגידול מיקוד ויוו.

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

בפרוטוקול הנוכחי, פונקציית מחסום האנדותל של הבלוטה התת-מנדיבולרית (SMG) הוערכה על ידי הזרקת עוקבים פלואורסצנטיים משוקללים מולקולריים שונים לוורידים הזוויתיים של מודלים של חיות ניסוי in vivo תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים.

אין ויוו זיהוי חדירות כלי דם בבלוטה תת-מנדיבולרית של עכבר

במחקר הנוכחי, דקסטרן פלואורסצאין-איזותיוציאנט-מסומן (FITC) מנוהל לעכברים דרך הפה כדי להעריך את חדירות המעי הן in vivo והן בדגימות פלזמה וצואה. מכיוון שתפקוד מחסום המעי מושפע בתהליכי מחלה רבים, ניתן להשתמש בבדיקה ישירה וכמותית זו בתחומי מחקר מגוונים.

הערכה של שלמות מחסום המעי בעכברים באמצעות דקסטרן עם תווית פלואורסצאין-איזותיוציאנט

פותחה שיטה להמחשת אקסטרוואזציה של צבע עקב פירוק מחסום דם-מוח (BBB) על ידי מתן שני צבעים פלואורסצנטיים לעכברים בנקודות זמן שונות. השימוש בגליצרול כחומר קריאופרוטקטנט הקל על אימונוהיסטוכימיה באותה דגימה.

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה להערכת תקינות מחסום הדם-מוח (BBB) במודל דג זברה בוגר (Danio rerio) באמצעות הערכה מבוססת צבע כחול של אוון, המאפשרת ניתוח איכותי וכמותי של הפרעה נוירו-וסקולרית.

הדמיה של שומר הסף: ההערכה מבוססת הצבע הכחול של אוון על חדירות מחסום דם-מוח בדג זברה בוגר

למדו להעריך חדירות כלי דם במוח עכברים באמצעות סמנים פלואורסצנטיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי וויזואלי של תפקוד מחסום הדם-מוח במחלות נוירולוגיות שונות.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

גלה סרטונים נוספים