הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש
10 במאי 2019
אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.
בגלל אורגנואידים recapitulate הארגון המבני המקומי, כמו גם תכונות מולקולריות רבות של אפיתל מעיים ב vivo, טכניקה זו מאפשרת לנו ללמוד ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת להנדס גנטית אורגנואידים באמצעות גישת טרנסדוקציה יעילה מאוד עם ציטוקסיקיות נמוכה, ובכך לאפשר מחקרים פונקציונליים של אורגנואידים אלה מניפולציה גנטית. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון טיפול למחלות מעיים כי אנחנו יכולים לחשוף אורגנואידים מעיים לתרופות וסוכנים אחרים או התערבויות.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ופתולוגיים במערכות אחרות נוח לתרבויות אורגנואידיות, כגון רקמות השד או לתאים הגדלים בתנאים דו-מימדיים סטנדרטיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יצליחו עם התברות באורגנואידים קשים להנדסה או בתאים אחרים. היה לנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר נתקלנו בקשיים מתמר האורגנואידים שלנו ותאי גזע.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו אובדן מבני של האורגנואידים יכול להתרחש אם דגימות אינם מטופלים כראוי במהלך תהליך ההטבעה לתוך מטריצת המרתף עבור cryosectioning. כדי לגדל אורגנואידים עבור התמרה ויראלית, תרבויות תאים אורגנואידים זרעים עם 200 מיקרוליטרים של מדיום שכפול ל הבאר בצלחת 48 באר, ודגירה באינקובטור תרבות רקמה סטנדרטית. להפשיר בקבוקונים של וירוס עבור התמרה, המאפשר כ 50 microliters של וירוס מרוכז לתרגום של כל באר צלחות 48 באר.
בצינור של 1.5 מיליליטר, מערבבים את הנגיף עם 12 מיקרוליטרים של תותב ננו-חלקיקים מגנטי, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, מוסיפים את פתרון הננו-חלקיקים המגנטיים ואת תערובת הווירוסים לתאים כדי להתמר. מניחים את צלחת 48 באר על צלחת מגנטית, ודגירה באינקובטור תרבות רקמות סטנדרטי לפחות שעתיים.
כאשר ההטרנספיה הנגיפית הושלמה, מעבירים את אשכולות התאים האורגנואידיים הנגועים ואת מדיום ההעתקה מכל באר לצינור של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500 פעמים g במשך חמש דקות. השליכו את העל-טבעי עם יניקה עדינה, וקררו את הצינורות המכילים את גלולת הקרח למשך חמש דקות.
הוסף 120 microliters של מטריצת קרום מרתף לכל צינור, ו resuspend את גלולה על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה. זרעים 30 מיקרוליטר טיפות של תערובת תא מטריצה לתוך צלחת חדשה 48 היטב. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 15 דקות עד המטריצה מתגבשת.
מוסיפים מדיום טרנסדוקציה לכל באר, וקטורת ב חממה סטנדרטית לתרבות רקמות למשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, לבדוק את התרבויות תחת מיקרוסקופ אור ב 10x הגדלה כדי להבטיח ארגון של אשכולות תאים לתוך מבנים אורגנואידים. החלף בעדינות את מדיום ההעתקה בכל באר ב-250 מיקרוליטרים של מדיום ENR של תרבות האורגנואידית.
תחזיר את הצלחת לאנקובטור. התחל הליך זה על ידי הסרת מדיום ENR על ידי יניקה עדינה, נזהר לא לטרטר את מטריצת קרום המרתף. יש לשטוף בעדינות עם 500 מיקרוליטרים של PBS.
תקן את האורגנואידים על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של 4% פתרון paraformaldehyde לגם, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, להסיר את פתרון paraformaldehyde על ידי יניקה. מוסיפים בעדינות מיקרוליטר אחד של PBS ל באר, ולאחר מכן להסיר את PBS על ידי יניקה עדינה.
בדרך זו, לשטוף פעמיים עם PBS. הסר את ה- PBS מהכביסה השנייה והוסף מיקרוליטר אחד של מאגר סוכרוז של 30% לכל דגימה. דגירה אורגנואידים קבועים סוכרוז במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי לייבש את הדגימות.
הסר את מאגר סוכרוז על ידי יניקה, ולהוסיף רק מספיק תרכובת הטבעה כדי לכסות את שכבת מטריצה בכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או עד שתרכובת ההטבעה הופכת מוצקה ולבנים.
מניחים את הצלחת עם תרכובת הטבעה קפואה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר התכה מינימלית של המתחם לאורך הקצוות. השתמש אזמל או מרית כדי להפריד את הבלוק מקירות הבאר. עבוד במהירות כדי למנוע התכה, באמצעות ממטרות כדי להסיר את המטריצה הטבעה בלוק מורכב, ולמקום אותו בבלוק דגימה.
ממלאים את התבנית לחלוטין עם תרכובת הטבעה. להקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש בבלוק לחיתוך. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה על ידי אורגנואידים מעיים מתמר הראשון עם וקטורים lentiviral מקושר GFP.
ה- GFP הודמיין בכל שלב בהתפתחות האורגנואידית, כולל בשלב מוקדם כאשר תאי קריפטה מתארגנים במבנים דמויי ציסטה או בנקודות זמן מאוחרות יותר כאשר אורגנואידים יוצרים ניצנים. אורגנואידים מעיים שהתמר בהצלחה היו אז פורמלין קבוע, cryosectioned, ונותחו על ידי הדמיה immunofluorescence. בתמונה זו, הגרעינים מוכתמים בכחול, והירוק מציין מולקולות הידבקות בתא האפיתל, אשר מתמתן גבולות התא.
האדום מציין כתמי ליסום לזיהוי תאי Paneth. לאחר השליטה, אורגנואידים מתמר יכול להתבצע בערך שלוש שעות, אורגנואידים crysection הטבעה יכול להיעשות בערך 2 1/2 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד על קרח בעת טיפול רייגנטים מטריצת מרתף.
לאחר השלמת הליך זה, ניתוח immunofluorescent ושיטות אחרות כדי לזהות חלבונים או organelles יכול להתבצע כדי להעריך לוקליזציה או שפע יחסי. טכניקה זו סוללת את הדרכים עבור חוקרים לחקור ביולוגיה נורמלית מצבי מחלות במבחנה וגם עבור מחקרים vivo אם אורגנואידים מתומרים או תאים ניתן להשתיל לתוך עכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש וירוסים המסומנים מגנטית כדי להנדס גנטית אורגנואידים עבור cryosectioning.
אנא אל תשכח כי עבודה עם וירוסים יכול להיות מסוכן מאוד, ואמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן מתאים תמיד צריך להתבצע בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה להנדסת אורגנואידים של המעי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים להעברה יעילה של גנים. כמו כן, הוא מפרט את תהליך הפקתם של חתכים קפואים מאותם אורגנואידים מהונדסים, המאפשרים את חקר ביטוי הגנים והשפעותיהם העקיפות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- טכנולוגיית אורגנואידים
רקע
- אורגנואידים מחקים את המאפיינים המבניים והמולקולריים של אפיתל המעי in vivo.
- טכניקה זו מאפשרת לחקור ביולוגיה תקינה ומצבי מחלה.
- ניתן לבצע הנדסה גנטית של אורגנואידים ברמת ציטוטוקסיות נמוכה.
- היישומים כוללים חשיפה לתרופות והתערבויות למחלות מעי.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מהימנה להעברה גנטית (transduction) לאורגנואידים.
- לאפשר מחקרים פונקציונליים של אורגנואידים שעברו מניפולציה גנטית.
- להקל על חקר תהליכים התפתחותיים ופתולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הנדסת אורגנואידים של המעי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים.
- טרנסדוקציה לנטיוויראלית או רטרוויראלית לשינוי ביטוי גנים.
- הפקת חתכים קפואים מאורגנואידים מהונדסים.
- מחקרים פונקציונליים באמצעות אורגנואידים שעברו שינוי גנטי.
תוצאות עיקריות
- הדגימה יעילות גבוהה בהחדרה גנטית (transduction) של אורגנואידים שקשה להנדס.
- הראתה רעילות תאית נמוכה הקשורה לשיטת ההחדרה.
- סיפקה תובנות לגבי השפעותיהם של שינויים גנטיים על תפקוד האורגנואידים.
- הדגישה יישומים טיפוליים פוטנציאליים למחלות מעיים.
מסקנות
- השיטה מציעה כלי רב עוצמה למחקרי ביטוי גנים באורגנואידים.
- ניתן ליישמה על תרביות אורגנואידים מגוונות מעבר לרקמות מעי.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו עבור התערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הנדסה גנטית יעילה של אורגנואידים של המעי מאפשרת הערכה תפקודית מהירה של מטרות גנטיות במערכת רלוונטית פיזיולוגית, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על תהליכי עבודה של CRISPR היקרים והגוזלים זמן. גישה זו תומכת בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי קישור של מודולציה גנטית לקריאות פנוטיפיות במבנים אפיתליאליים הרלוונטיים למחלה. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית, תוך שהיא מאפשרת טרנסדוקציה ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב למחקרים של תגובה לתרופות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה מהירה של היפותזות טיפוליות באמצעות טרנסדוקציה ויראלית יעילה של אורגנואידים של המעי עם ציטוטוקסיות מינימלית.
- ערך תפעולי: מקצר את הזמן והעלויות הכרוכים במיון ובסינון של CRISPR/Cas9, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של תיקוף המטרות.
- ערך אסטרטגי: תומך בהערכה פונקציונלית של ביטוי גנים או השתקה שלהם במדורי תאי גזע וקריפטות, ובכך משפר את רמת הוודאות לגבי המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר אורגנואידים בעלי יכולת טרנסדוקציה המתאימים לאנליזה אימונוהיסטוכימית או אימונופלואורסצנטית של שינויים בביטוי גנים.
- ערך תפעולי: מספק זרימת עבודה סטנדרטית לחיתוך נתחים קפואים השומרת על מורפולוגיית הרקמה למחקרים של לוקליזציית חלבונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות על ידי ביצוע מחקרי חשיפה לתרופות באורגנואידים מהונדסים גנטית המדמים ארגון אפיתליאלי in vivo.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על הערכה של תפקוד תאי גזע של המעי ותפקוד הקריפטה לאחר מניפולציה גנטית, ובכך תומך בקבלת מדדים תפקודיים הרלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר השתלה של אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה לעכברים לצורך אנליזה תפקודית in vivo, ובכך מגשר בין ממצאים in vitro לתיקוף פיזיולוגי.
- ערך אסטרטגי: תומך בניבוי תגובות טיפוליות על ידי מידול השפעות של תרופות על ביטוי גנים או על תפקוד חלבונים, במקום על שינוי גנומי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי מתן אפשרות למודולציה גנטית מהירה באורגנואידים, ובכך היא תומכת במעבר מהנחת היעד לוולידציה תפקודית לפני זיהוי המולקולה המובילה (lead).
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות טרנסדוקציה יעילה של אורגנואידים של המעי למחקרי ביטוי או השתקה של גנים.
- סריקה: מספקת אורגנואידים מהונדסים גנטית המוכנים לבדיקה, תוך שמירה על המורפולוגיה עבור דימות כמותי ומדדים תפקודיים.
- אנליזה: מאפשרת כימות מבוסס אימונופלואורסצנציה של מולקולות הדבקה אפיתליאליות, סממנים ליסוזומליים וצביעה גרעינית להערכת יעילות הטרנסדוקציה ופנוטיפים תאיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת הנדסת אורגנואידים in vitro למחקרי in vivo באמצעות השתלה של אורגנואידים שעברו טרנסדוקציה לעכברים לצורך אנליזה תפקודית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למניפולציה גנטית של אורגנואידים של המעי ואורגנואידים אפיתליאליים אחרים עבור מטרות מרובות ומסעות סריקה של תרופות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזואי על ידי קישור שינויים גנטיים לתוצאות תפקודיות במערכת אפיתלית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור וההסקלביליות באמצעות טרנסדוקציה בעזרת ננו-חלקיקים מגנטיים וחתכים קריוסטטיים סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתיקוף מטרות באמצעות הערכה פנוטיפית מהירה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על תגובות תפקודיות של אורגנואידים להפרעות גנטיות ופארמקולוגיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות אורגנואידים, טיפול בנגיפים והכנת ננו-חלקיקים מגנטיים.
- נדרשת גישה לפלטות מגנטיות, ציוד קריוסטט ותשתית לדימות אימונופלואורסצנציה.
- נדרש אימון סטנדרטי למניעת אובדן מבני במהלך שלבי הטמיעה והחיתוך.
- נדרש אופטימיזציה עבור סוגי אורגנואידים וסרוטיפים נגיפיים שונים כדי להבטיח יעילות טרנסדוקציה עקבית.
- כולל אמצעי בטיחות ביולוגית בשל שימוש בוקטורים נגיפיים, לרבות ציוד מגן אישי (PPE) ופרוטוקולי בידוד.
