הערכת ציטוטוקסיות ואפקטים Immunomodulatory של חומרים אמבריולוגיה דיוק-לחתוך פרוסות

המטרה הכוללת של מודל תלת מימדי זה של פרוסות ריאה אנושיות בחיתוך מדויק היא להעריך ציטוטוקסיות והשפעות אימונומודולטוריות במודל ex vivo באמצעות רקמה אנושית. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפרמקולוגיה והטוקסיקולוגיה על מנת להעריך את הבטיחות ולעזור להעריך את התגובה הפיזיולוגית לחומרים בסביבה האנושית הילידית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שאנו מסוגלים לחקות מחלות נשימה אנושיות לגבי ציטוטוקסיות או השפעות חיסוניות, הודות לשימוש ברקמות אנושיות טריות וקיימות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות תא-תא אנושיות, פיזיולוגיה ומנגנון פתולוגי, במחלות נשימה, היא יכולה לשמש גם ליישומים אחרים כמו גם למינים אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בארגון הערכת רקמות אנושיות והקמת תשתית אמינה. יתרה מכך, תהליך המילוי דורש הכשרה וניסיון רב, בשל ההטרוגניות של הריאות.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לקנול את קנה הנשימה על ידי החדרת צינור הסיליקון וקיבועו עם מהדק מקביל לצינור כך שהמהדק לוחץ את הרקמה יחד לצד צינור הסיליקון מבלי לצבוט אותו. סגור את כל שאר הסמפונות, כלי הדם והפציעות בעזרת מלחציים כך ששום אגרוז לא יוכל לדלוף החוצה במהלך הליך המילוי. יש צורך במיומנות אנטומית טובה כדי לקנול את הסימפונות העיקריים.

אין להרחיב את הריאות יותר מדי, אחרת הרקמה תסיח את דעתה, ואם הרקמה לא תתמלא מספיק, אי אפשר יהיה ליצור PCLS מכיוון שהרקמה רכה מדי. לאחר מכן, מערבבים נפח שווה ערך של 3% אגרוז דל ג'ל עם מדיום תרבית בכוס. יש להחדיר את התערובת לריאה באמצעות מזרק של 15 מיליליטר.

לפני מילוי המזרק במדיום, clamp סגור את הקטטר באצבעות או clamp כדי למנוע בועות אוויר וריפלוקס אגרוז. חותכים את רקמת הריאה ללוחות של שלושה עד חמישה סנטימטרים. מלאו את פורס הטישו ב-400 מיליליטר EBSS קר כקרח.

חותכים מיד את ליבות הרקמה הגליליות מלוחות הריאה, באמצעות מברג חצי אוטומטי עם כלי ליבה. לאחר מכן, העבר את ליבות הרקמה למחזיק הרקמות של פורס הרקמות. הניחו את המשקל על גבי ליבת הרקמה והתחילו לחתוך את ליבת הרקמה ל-PCLS.

יש לנקז את המדיום מתוך פורס הרקמות לכוס, על ידי פתיחת המהדק של גליל הזכוכית. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות מכוס לצלחת פטרי עם מדיום תרבותי. לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לאינקובטור ואפשרו למדיום להתחמם לפני שלבי הכביסה.

לאחר מכן, העבירו את פרוסות הריאה בזהירות לצלחת תרבית של 24 בארות עם מינימום של 500 מיקרוליטר מדיום תרבית לשתי פרוסות לבאר. להכנת תערובת מאסטר של תמיסת העבודה, יש לדלל 25 מיקרוליטר של מגיב WST-1 ו -225 מיקרוליטר בינוני לכל באר. לאחר מכן, פיפטה 250 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של תערובת המאסטר של WST-1 לכל באר ודגירה על הצלחת ב -37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

ודא שה-PCLS מכוסה במלואו על ידי מגיב WST-1 במהלך הדגירה. לאחר מכן, הנח את הצלחת על שייקר מסלולי ב-200 סל"ד, ונער בזהירות במשך 30 שניות כדי להבטיח ערבוב יסודי של המגיב WST-1. לאחר מכן, פיפטה 100 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר של צלחת 24 הבארות לצלחת חדשה, בעלת תחתית שטוחה, של 96 בארות בכפולות.

מדוד את הספיגה של כל באר ב-450 ננומטר, באמצעות קורא מיקרו-פלטות והפחית את הספיגה בהתייחסות של 630 ננומטר מזו של 450 ננומטר. לאחר הדגירה של ה-PCLS עם או בלי חומרי בדיקה, העבירו 50 מיקרוליטר של סופרנטנט בשכפולים לצלחת חדשה של 96 בארות. זה מייצר כפילויות מכל באר מטופלת של צלחת של 24 בארות.

מיד לפני הבדיקה, הכינו תערובת מאסטר של תמיסת העבודה של חומר נטול LDH, על ידי ערבוב יסודי של 125 מיקרוליטר של תמיסת זרז עם 6.25 מיליליטר תמיסת צבע לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת העבודה של תערובת המאסטר לכל באר שכבר מכילה 50 מיקרוליטר של סופרנטנט. דגרו את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

לאחר מכן, מדוד את הספיגה של כל באר ב-492 ננומטר, באמצעות קורא מיקרו-פלטות, והפחית את הספיגה ב-630 ננומטר מזה של 492 ננומטר. להערכה מיקרוסקופית, בצע לפחות שתי ערימות Z מפוזרות באופן אקראי, עם ה-cLSM. לחץ על הכרטיסייה Ocular כדי לבחור מטרה של פי 10.

לחץ על מקוון כדי להשתמש ב-cLSM כמיקרוסקופ אור סטנדרטי כדי למצוא את פני השטח של PCLS. לאחר מכן, לחץ על לא מקוון כדי לצאת מהגדרת העיניים. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה רכישה והפעל את הלייזרים המתאימים לפלואורופורים.

לחץ על נתיב האור תחת הכרטיסייה רכישה, והגדר את המסננים והמראות הדרושים לניסוי. לחץ על כפתור השידור החי כדי לראות תצוגה חיה של השכבה המתאימה על המסך. הזז את המיקוד למעלה או למטה כדי למצוא את פני השטח של ה-PCLS עם אות חד.

לאחר מכן, הגדר את חור הסיכה עבור תעלת האתידיום האדום הומודימר-1 ליחידת אוויר אחת להחלפה הטובה ביותר בין יעילות איסוף האור לחתך אופטי, והתאם את תעלת הקלצין בהתאם. הגדל את האות שזוהה של הרווח. הגדל או הקטן את ההיסט הדיגיטלי כדי להתאים את הרקע כך שיופיע בכחול בתמונה החיה עם טבלת נעילת צבע ערוץ מופעלת.

סמן את התיבה Z-stacks כדי להגדיר את הגבולות העליונים והתחתונים עבור הנפח המיקרוסקופי. העבר את המיקוד באיטיות למעלה או למטה עד שתגיע לטווח של 30 מיקרומטר ולחץ על קבע אחרון כדי לשמור. לאחר מכן, לחץ על Live פעם נוספת כדי להשבית את התמונה החיה, ולחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל את ההדמיה.

מוצגות כאן תמונות הכדאיות המיקרוסקופיות של PCLS, המדגימות את ההיענות של הרקמה האנושית לחומר ניקוי כחומר רעיל יעיל. השפעות רעילות מוערכות חזותית על ידי הערכת רקמה חיובית לקלצין בהשוואה לגרעיני תאים חיוביים לאתדיום הומודימר-1. למרות שהכדאיות של רקמת ריאה אנושית משתנה בין תורמים, מספר גרעיני התאים המתים בהשוואה לרקמה בת קיימא לא יעלה על 15% מבקרת הרקמות.

איור זה מציג את הנתונים המייצגים את ההשפעה האימונומודולטורית של אמוניום הקסכלורופלטינט, SLS על רקמת ריאה אנושית. IL-1 אלפא ו-TNF-alpha חוץ-תאיים ותוך-תאיים נקבעו על ידי ELISA ונורמלו לתכולת החלבון הכוללת. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי הפרמקולוגיה והמדע הבסיסי לחקור תגובות פיזיולוגיות בתוך רקמת ריאה אנושית בת קיימא.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע נקודות קצה אחרות כמו התכווצות דרכי הנשימה על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון יעילות תרופות מרחיבות סימפונות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה כללית טובה כיצד ליצור ולעבד פרוסות ריאה אנושיות בחיתוך מדויק. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות כאשר התוצאות הראשונות זמינות בתוך 24 השעות הראשונות, אם מבוצעות כראוי.

עם זאת, אל תשכח שעבודה עם חומר אנושי שאינו מקובע עלולה להיות מדבקת, ותמיד יש ללבוש אמצעי זהירות, כגון ביגוד מגן, בעת ביצוע הליך זה. בנוסף, חשוב לזכור לעבוד בתנאים סטריליים ככל האפשר.