ניתוח קינטי של Vasculogenesis מכמתת את הדינמיקה של Vasculogenesis ואנגיוגנזה במבחנה

המטרה הכוללת של שיטה ניסיונית זו היא לדמיין ולכמת את התהליך הדינמי של כלי דם לאורך זמן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי אנגיוגנזה וכלי דם לגבי שיעורי היווצרות כלי הדם וההבדלים בין דפוסים מבניים של רשת שנוצרו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לכמת מספר רב של נקודות זמן של כלי דם, ומספקת הזדמנות להעריך את הקינטיקה של התהליך הוסקולוגני.

ניתן ליישם שיטה זו על כל אוכלוסיית תאים או מצב פתולוגי המשפיע על תהליכי כלי דם או אנגיוגנזה לחקר אוכלוסיות תאים בודדות או מערכות תרבית משותפת. כשעה עד שעתיים לפני תחילת הניסוי, חממו מראש את החממה העליונה של מיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס, והגדירו את הפחמן הדו-חמצני ל-5% ואת הלחות ל-85%מלאו את מאגר הלחות של החממה אם הוא ריק. הנח את תא התא החי על המיקרוסקופ, ולאחר מכן, הנח שקופית עם תא ריק לתוך אחד משני המיקומים הפתוחים בתוך תא התא החי.

מלאו את המגלשה במים מזוקקים והגדירו מפוח משני ל-39 עד 42 מעלות צלזיוס כדי לחמם את המגלשות מלמטה וכדי למזער את העיבוי. שמירה על הטמפרטורה והלחות הנכונים בתוך תא ההדמיה של תאים חיים היא קריטית להצלחת הניסוי. הוסף שקופית שנייה כריק עד שניתן יהיה להוסיף את השקופית הניסיונית.

לאחר מכן, הוסיפו מים למאגרים המקיפים את הבארות בשקופית השנייה כדי לחקות את התנאים במהלך ניסוי ההדמיה. כדי לטעון את מגלשת תא הניסוי עם מטריצת קרום מרתף, טען תחילה פיפטה של 20 מיקרוליטר עם קצה פיפטה קר של 20 מיקרוליטר והשתמש במספריים כדי לחתוך כסנטימטר אחד מקצה הקצה. הגדר את נפח הפיפטה למעט יותר מ-10 מיקרוליטר ושאף לאט את המטריצה לקצה הפיפטה שהשתנה.

הנח מיד את קצה הפיפטה במרכז באר שקופית אחת, נגע בעדינות בקצה לתחתית הבאר, ולחץ לאט על הבוכנה כדי לדחוף את המטריצה החוצה. לאחר הוספת מטריצה לכל 15 הבארות, דחוף את המכסה עד הסוף אל המגלשה. פיפטינג מדויק ועקבי של נפחי המטריגל לכל באר הוא קריטי להשגת תמונות ניגודיות פאזה באיכות גבוהה.

לאחר מכן, הנח את השקופית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות ליד מכסה צינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא בשניים עד שלושה מיליליטר PBS כדי להפחית את התייבשות המטריצה. כאשר המטריצה התמצקה, הסר את הסופרנטנט מתרבית תאים היוצרת מושבת אנדותל בתרבית לילה, ושטוף את התאים עם שבעה מיליליטר PBS. שאפו את ה-PBS, שטפו ונתקו את התאים עם שניים עד שלושה מיליליטר טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שתיים עד חמש דקות.

לאחר מכן, השעו מחדש את התאים המנותקים בשלושה מיליליטר של מדיום גידול אנדותל-2 כדי לפרק את כל גושי התאים ולהעביר את תרחיף התאים שנוצר לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר שכל דגימות התאים היוצרות מושבת אנדותל הושעו מחדש, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה והשעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד עד שניים של מדיום גידול אנדותל טרי. ספרו את מספר התאים ברי הקיימא בכל דגימה והוסיפו מספיק תאים יוצרי מושבת אנדותל לצינור חדש של 1.5 מיליליטר כדי לאפשר דילול התאים ל-1.4 כפול 10 לתאים הרביעיים לכל 175 מיקרוליטר של ריכוז בינוני.

לאחר מכן, מערבבים כל תערובת מאסטר עם פיפטינג עדין. הסר את מכסה השקופית והורד 50 מיקרוליטר מכל תערובת מאסטר לבאר בשלוש עותקים על המגלשה. כדי לדמות את התאים, החלף את השקופית הריקה בשקופית ניסיונית אחת והוסף מים למאגרים המקיפים את התאים בשקופית.

עברו על כל שלב מיקום ואשרו שמרכז הבאר הראשונה נבחר. התמקדו בתאים המצופים בבאר וקבעו את מיקום Z של הבמה. כאשר ההגדרות מדויקות, כבה את האורות כדי להתחיל בניסוי ההדמיה.

לאחר השלמת ההדמיה, קנה מידה וייצא קובצי אוסף תמונות בתוך תוכנת Image Capture, ושמור את התמונות כקובצי TIFF לניתוח. כדי לנתח את התמונות, גרור את קובץ הניתוח הקינטי של כלי דם מהתיקייה שלו אל הסרגל האפור בתחתית חלון התוכנה כדי לפתוח את התוכנה, ולחץ על שמור כדי להוסיף את התוכנה לרשימה. לחץ על File and Open כדי לבחור את קובץ התמונה לפתיחה, או גרור את קובץ התמונה לסרגל האפור בתוך התוכנה.

לחץ על תמונה, כוונון ובהירות/חדות כדי לפתוח את החלון בהירות/ניגודיות. לחץ על Reset בחלון Brightness/Contrast כדי להציג את התמונה באופן חזותי. לאחר מכן, לחץ על תמונה, סוג ו-8 סיביות, כדי להמיר את התמונות ל-8 סיביות.

בחרו Tools ו-Region Of Interest Manager, והשתמשו בכלי בחירה בעל צורה מתאימה ליצירת אזור עניין חדש. לחץ על הוסף כדי להוסיף את צורת אזור העניין לחלון מנהל אזור העניין ולחץ על התווית אזור עניין במנהל אזור העניין כדי להציג את האזור בתמונה. התאם את אזור העניין לפי הצורך.

כאשר האזור נמצא במקומו, לחצו על 'תמונה' ולאחר מכן על 'חתוך' כדי לחתוך את התמונה. לאחר מכן, פתח את התפריט Edit ובחר Clear Outside כדי למחוק את נתוני התמונה מחוץ לאזור העניין של כל תמונה באוסף. לאחר מכן, פתח את תפריט התוספים ובחר את התוסף נתח רשת.

השתמש בחץ הנפתח בחלון המוקפץ כדי לשנות את שיטת הסף ולחץ על אישור כדי להתחיל את עיבוד התוכנה. בסוף הניתוח תיפתח טבלת נתונים וערימה של תמונות התמזגו המתארות עיבודי שלד ומסכה. לחץ על File and Save As כדי להעביר את הערכים המספריים לגיליון אלקטרוני, ושמור את הגיליון האלקטרוני המכיל את ערכי הנתונים הגולמיים.

לחץ על תמונת השלד והמסיכה הממוזגת ושמור את אוסף התמונות הממוזג Skeleton Mask ואת אוסף התמונות של ניגוד הפאזה שנחתך כקובצי TIFF. לאחר מכן, לחץ על החלון מנהל אזור העניין, בחר את אזור העניין המשמש לחיתוך התמונות ולחץ על עוד ושמור, כדי לשמור את אזור העניין לשימוש עתידי. רשתות תאים יוצרות מושבות אנדותל, שזוהו על ידי ניתוח קינטי של כלי דם, מיוצגות באופן ציורי כעיבודי שלד ומסכה כדי להמחיש את המבנים המשמשים את התוכנה לכימות.

כאשר איכות תמונות ניגודיות הפאזה גבוהה ומושגת ניגודיות מספקת, ניתוח קינטי של כלי דם יזהה במדויק רשתות תאים יוצרות מושבות אנדותל כפי שמצוין על ידי הדמיון שנצפה בין תמונת ניגודיות הפאזה לבין הניתוח הקינטי של עיבודי שלד ומסכה שנוצרו על ידי כלי דם. אם לתמונות ניגודיות פאזה אין ניגודיות גבוהה, או אם מתרחשים חפצי הדמיה כגון רשת, דיוק זיהוי הרשת מצטמצם והתוצאות הופכות למעורפלות. עם זאת, ניתן לבחור שיטות סף שונות, כגון Mean ו-Otsu, המוצגות כאן, לפני הניתוח בתפריט הנפתח של התוכנה כדי להתאים להבדלים באיכות התמונה.

שימוש בניתוח קינטי של כלי דם כדי לקבוע אם תאים יוצרי מושבת אנדותל שנחשפו לסוכרת הריונית מציגים קינטיקה שונה של היווצרות רשת חושף שינוי הטרוגני במבנה הרשת בתרביות סוכרת הריונית בהשוואה לתרביות תאים יוצרות מושבת אנדותל מהריון לא מסובך. ואכן, דגימות הריון לא מסובכות יוצרות בדרך כלל מספר גדול יותר של רשתות סגורות בהשוואה לדגימות סוכרת הריונית. עם זאת, כל דגימות התאים היוצרות מושבות אנדותל מציגות דפוס דו-פאזי של היווצרות רשת באופן כללי, אם כי שיעורי ההיווצרות והמספר המרבי של הרשתות שהושגו משתנים בין הדגימות.

בעקבות הליך זה, ניתן לשרטט ולנתח את ערכי הנתונים שנוצרו על ידי ניתוח קינטי של כלי דם כדי לקבוע אם מבני הרשת שנוצרו על ידי הדגימות השונות שונים מבחינה סטטיסטית, ואם כן, באילו נקודות זמן. ניתוח קינטי של כלי דם מאפשר עיבוד יעיל של ניסויי זמן-lapse הכוללים מספר רב של תמונות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את רכישת התמונה, העיבוד המאוחר והניתוח תוך יומיים אם כל המערכות פועלות כראוי.