הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השימוש בפלטפורמת אבחון נקודתית מרובת שאינה דורשת הכנת דגימות נרחבת ומכשור יקר והיא משמשת במגוון דגימות ביולוגיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האבחון הנקודתי כגון זיהוי מטרות שונות בצינור תגובה יחיד. על ידי שימוש בהגברה איזותרמית בתיווך לולאה יחד עם בדיקות תזוזה ספציפיות לגדיל המטרה, ניתן לזהות ביעילות שלושה וירוסים שונים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בהגברה איזותרמית במקום PCR והיא דורשת הכנת דגימה מינימלית וניתן ליישם אותה על מגוון דגימות קליניות. התחל בחיתוך גיליונות נייר Q למלבנים קטנים של שלושה מילימטרים על ארבעה מילימטרים באמצעות ניקוב נייר. לאחר מכן השתמש במיקרו עלי כדי לרסק יתושים נקבות Aedes aegypti שעלולות להיות נגועות בזיקה על כל נייר.

פיפטה 20 מיקרוליטר של תמיסת אמוניה מימית טוחנת אחת על כל פיסת נייר. לאחר חמש דקות, שטפו כל נייר עם 20 מיקרוליטר של 50% אתנול, ואחריו 20 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. יבש את הנייר באוויר בארון בטיחות ביולוגית BSL-2 למשך כשעה.

לאחר הייבוש, השתמש בפינצטה כדי לטבול כל נייר במלואו ב-100 מיקרוליטר של תערובת תגובת RT-LAMP ולדגור בטמפרטורה של 65 עד 68 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. קרא ותעד את הקרינה הנובעת מנגיף הזיקה באמצעות תיבת תצפית מודפסת בתלת מימד עם מקור אור LED ומסנן כתום או צהוב. התחל בהוספת 90 מיקרוליטר של מאגר התייבשות פי 1.1 לכל צינור תגובה המכיל ריאגנטים RT-LAMP ליופיליזציה והתמוסס על ידי ניעור.

ואז להסתובב לזמן קצר בכוח הכבידה פי 1,000. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 10 מיקרוליטר של דגימת שתן עם ה-RNA הנגיפי לצינורות התגובה וערבב על ידי פיפטינג. אם בודקים יתושים, הוסף מלבן של נייר Q המכיל פגרי יתושים יחד עם 10 מיקרוליטר מים מטוהרים במקום שתן.

מניחים את הצינורות הסגורים בגוש חום מוגדר מראש בטמפרטורה של 65 עד 68 מעלות צלזיוס ומדגרים למשך 30 עד 45 דקות. לאחר הדגירה, שמור את הצינורות סגורים כדי למנוע זיהום של בדיקות עתידיות והנח בתיבת התצפית. הפעל את המתג בגב תיבת התצפית.

התבונן בדגימה דרך המסנן הכתום וצלם את התמונה על ידי מצלמת טלפון סלולרי המוחזקת במרחק שבו התמונה ממלאת 80% משדה הראייה. לאחר השלמת ההדמיה, כבה את המתג. אחסן את הצינורות האטומים בחושך, רצוי בקירור אם יש צורך בהדמיה מאוחרת יותר.

הן במקרים של סינגלפלקס והן במקרים של מולטיפלקס, מוצרי RT-LAMP מופיעים כאות של קונקטמרים כאשר הם מופעלים על ג'ל אגרוז. דגימות בקרה שליליות שהכילו מים כדגימה נתנו רק את הרצועות לפריימרים עצמם, כולל בקרת המטרה הלא ספציפית שבה חומצת הגרעין הכוללת שהופקה מנקבת יתוש לא נגועה שימשה כתבנית. פלואורסצנטיות ירוקה נצפתה עבור זיקה באמצעות בדיקות כחמישה NT ראשוניים המסומנים ב-FAM.

פלואורסצנציה צהובה בצבע ירוק בהיר מוקצית לצ'יקונגוניה כאשר הגשושית היא חמישה NT ראשוניים המסומנים ב-HEX. פלואורסצנציה אדומה כתומה משמשת עבור דנגי-1 כאשר הגשושית שלה היא חמישה NT ראשוניים המסומנים ב-TAMRA. שני ניירות המכילים יתושים הושקעו ישירות בתערובת RT-LAMP ולאחר דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, נצפתה פלואורסצנטיות ירוקה בהירה בנוכחות נגיף הזיקה.

באמצעות תשעה נפחים של מאגר התייבשות ונפח אחד של דגימת שתן, ניתן ליצור פלואורסצנטיות ירוקה גלויה תוך 30 דקות וניתן לצלם את התמונה על ידי כל מצלמת טלפון סלולרי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האבחון הקליני לחקור פלטפורמות נקודתיות לאיתור נגיפים הנישאים על ידי יתושים בשתן, בדם, ברוק או בפגרי יתושים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במערכת הגברה איזותרמית, במקרה זה מדובר במנורה, כדי לזהות זיקה וארבו-וירוסים אחרים בצורה מרובה במגוון דגימות ביולוגיות.