Name: בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: חקור חיבורים מונוסינפטיים בנוירונים של דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמידים לטטרודוקסין. שיטת patch-clamp זו חושפת את הטבע הכימי של סינפסות ומאפשרת הבנה מעמיקה של תקשורת נוירונלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות יהושע זינגר, ג'ונתן שנק, כמו גם מתחשב בודקים עבור הערות על כתב היד. כן נרצה להודות לבן בן, הרולד אשות לדיונים על הטכניקה. ג'ונתן שנק סיפקה את הנתונים עבור איור 3A. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן וייטהול, R21 של NIH על QG.

1. מכינים זבובים וקווים יזם לזהות GAL4
<ol><li>בחר קו יזם GAL4 וחצו אותה עם זבובים נושאת את transgene UAS-NaChBac והן של transgene optogenetic עבור הפעלה. הערה: UAS-CsChrimson11 נבחרה בשל מוליכות גבוהה שלה ואת הקלות שבה היא מפעילה בתיווך NaChBac פוטנציאל פעולה. UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים מהמאגר מניות בבלומינגטון.</li>
	<li>להכין כל טרנס רשתית כפתרון מניות אתנול (35 מ מ) ולאחסן את הפתרון במקפיא ב-20 ° C.</li>
	<li>מיקס 28 µL של המניה הזו אל תוך כ- 5 מ של תפוחי אדמה ולמיומנות אגיע מזון ומוסיפים תערובת זו העליון של הבקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונלי.</li>
	<li>להעלות את הזבוב הבוגר לבטא csChrimson על מזון המכיל 0.2 מ מ כל-טרנס-רשתית 1 – 3 ימים11.</li>
</ol>2. מכינים TTX מניות
<ol><li>ליצור פתרון מניות של 1 מ מ TTX במים מזוקקים או יונים. לאחסן פתרון זה מקרר מעבדה במשך מספר חודשים. בדוק את מדיניות מוסדות לגבי האחסון של TTX כמו מוסדות רבים לסווג TTX בתור חומר מסוכן או מבוקר.</li>
</ol>3. מכינים את הזבובים עבור אלקטרופיזיולוגיה
<ol><li>לאסוף יום 1 – 3 זבובים מבוגר בן מגודלים על האוכל עם כל-טרנס-רשתית. הערה: עיין Murthy ואת טרנר בשנת 2013 לתיאור מפורט של תיקון מחבר חובק למעקה דרוזופילה נוירונים12,13.</li>
	<li>הכניסו את הזבובים בקבוקון זכוכית נצנוץ. מקם את המבחנה לתוך קרח 1 דקות לשתק את הזבובים.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים גס להוסיף לעוף לתוך חדר הקלטה בהזמנה אישית. התא מורכב 3 ½" מעגל לייזר לחתוך מ" 1/16" אקריליק. לחתוך חור ¾" היא המרכז שבו תשובה מכשילה מותאמת אישית מצורפת באפוקסי בשני חלקים. מסכל מכיל של משולש בצורת תקווה כי הזבוב מוכנס לתוך.</li>
	<li>החל שעווה או UV לריפוי אפוקסי סביב החיה לאבטח אותו בחוזקה בתוך תא הקלטה.</li>
	<li>יאיר ההכנה עם סיב אופטי מתכווננת ויזואליזציה תחת stereomicroscope. הגדר את הסיבים מתכווננת לתאורת עקיפה על ידי התאמת אותם כך מאירים לטוס ישירות מן הצד.</li>
	<li>להתאים את רמת האור הנמוך ביותר להגדרת אפשרי זה עדיין מאפשר הדמיה ברורה של הזבוב. עוצמת האור הזה ישתנו לאורך ניסויים בודדים. הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים באמצעות בתוך המוח באתרו explant השיטה14.</li>
	<li>אחזר הקלטה חיצוני תמיסת מלח. תמיסת המלח מכיל במ מ: 103 NaCl, 3 אשלגן כלורי, חומצה מתיל-2-aminoethane-sulfonic 5 N-טריס (hydroxymethyl), טרהלוז 8, גלוקוז 10, 26 NaHCO3,2פו ' NaH 1 '4, 1.5 CaCl2ו- 4 MgCl2 (מותאם mΩ 270-275). תמיסת המלח הוא מבעבע עם 95% או2/5% CO2 (carbogen), הסתגל pH 7.315.</li>
	<li>מקום 4-6 טיפות של תמיסת מלח הקלטה חוץ-תאית על הכנת לעוף. בשלב זה, להגביר את רמת האור-המיקרוסקופ לנתיחה עבור ניראות טובה יותר.</li>
	<li>בצעו חידוד חוט טונגסטן באמצעות אלקטרוליזה. כדי להפוך את החוט, להכין תמיסה רוויה של יודע3 ולהחיל כ 20 V של AC זרם בעודכם טובלים את קצה החוט בתוך תמיסת 20 פעמים למשך 100 אלפיות השניה עד קצהו הוא מחודד. להשתמש את החוט טונגסטן מחודדים כדי להסיר את הקוטיקולה על ראשו של הזבוב, ובכך חושף את המוח.</li>
	<li>בהמשך חושפים את המוח על-ידי הסרת קנה הנשימה וגופים שומן המקיפים אותו. אם ניגש האונות antennal, השתמש כפופות טונגסטן תילים או כלי דומה להכניס בעדינות אנטנות מתחת רדיד האלומיניום הקלטה קאמרית כדי להגדיל את הנראות. להשתמש מלקחיים חדה בעדינות תקרע מעליך את לנדן גליה המכסים את שטח עניין שבו יבוצעו הקלטות.</li>
	<li>העברה לחדר ההקלטה המתקן אלקטרופיזיולוגיה. מיד להתחיל זלוף בתמיסת הקלטה חיצוני מבעבע עם carbogen כדי לשמר את המוח. המאגר תמיסת ממוקמת מעל הבמה מיקרוסקופ, כוח המשיכה-מוזן ההכנה. השתמש קו ואקום, בקבוקון 2 ל' Erlenmeyer כדי לאסוף את תמיסת המלח פסולת.</li>
</ol>4. להשיג את הקלטת כולה-תא
<ol><li>משוך תיקון פיפטות פולר פיפטה מסחרי. עיין במדריך של הגדרות להגיע עם פיפטה המתאים עם התנגדות עצה ליד 7 mΩ.</li>
	<li>להוסיף 4 µL של פתרון הקלטה פנימית פיפטה תיקון. תמיסת המלח פנימי מורכב אספרטט אשלגן 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 נה3GTP, 1 EGTA ו- 1 אשלגן כלורי במ מ.</li>
	<li>להגדיר את תיקון מגבר המלחציים עבור הקלטת כל תא. אפס היסט של המגבר ולהגדיר המגבר להעביר מבחן פולסים. . הנה, משמש מגבר מלחציים תיקון מערכות 2,400 AM.</li>
	<li>החל בלחץ חיובי פיפטה, מתקרבים התא. השתמש micromanipulator כדי לכוון את פיפטה ולפנות אל התא. שחרור הלחץ. ערכת הפוטנציאל החזקה של הקרום ל-60 mV. פיפטה יוצרות גושפנקה ג'יגה אוהם עם הממברנה של התא כפי שמעידים נמוך sub-picoamp מחזיק הנוכחי. הערה: אם באמצעות ה-GFP מודרכת תא מיקוד, לנסות לצמצם השימוש אור פלורסנטי כדי למנוע הפעלת ChR2 ודיכאון סינפטית פוטנציאליים. בנוסף להמתין כמה דקות לפני יישום שלב 5.</li>
	<li>להגדיר את מגבר להעברת פולסים מבחן מ-50 mV ל-60 mV. הגדרה זו היא תקן על תיקון-קלאמפ מגברים. מבחן פולסים תחשוף גדול capacitative הציעה שתושב זמני המייצג את הצורך הנוכחי כדי לחייב את פיפטה תיקון. הסר שנחשולי capacitative על-ידי התאמת בידית פיצוי קיבולת על אני 2400 או מגבר דומה.</li>
	<li>החל פולסים קצרים של לחץ שלילי לקרע קרום התא ולקבל כל-תא תצורה. הערה: תצורה התא כולו הוא ציין כאשר יש עלייה גדולה תופעות מעבר capacitative מציג את קיבול של הנוירון. עלייה קטנה במעצר הנוכחי (בסיסית) גם סביר להניח יתקיימו. הגדרת המגבר למצב הנוכחי של קלאמפ ולהתאים את הפוטנציאל של התא-50 עד-60 mV.</li>
</ol>5. בדיקת קישוריות סינפטית
<ol><li>תצורת המערכת רכישה (DAQ) נתונים כדי להפעיל התקן LED כדי להפיק להבזקי האור. כאן, מערכת DAQ מכשירים הלאומית משמשת עם Matlab להעביר אות אנלוגי נהג LED. עוצמת LED מותאמת באמצעות האות האנלוגי לנהג. ה-LED הוא 620-630 ננומטר אורך גל LED.</li>
	<li>מקם את עוצמה אדום LED ישירות מתחת ההכנה. להתאים את עוצמת האור כך mW/מ מ 0.2382 מגיע הזבוב.</li>
	<li>להפעיל את הנוירונים presynaptic תוך כדי הקלטה מהתא postsynaptic עניין. להשיג תא הפעלה optogenetically, pharmacogentically, או באמצעות גירוי עצבי. כאן, csChrimson, פולסים קצרים של אור אדום מוחלים. הערה: קשרים סינפטיים ניתן לנטר קלאמפ הנוכחי כמו EPSPs או מתח קלאמפ כמו EPSCs. חיבור סינפטית צריכים להיות גלויים לפני החלת TTX בתגובה פולס אור של 40 אלפיות. אם אין קשר הוא ציין, אין זה סביר כי הנוירונים synaptically מחוברים או מונו - או polysynaptically. החזקת פוטנציאלי עשוי להיות מותאם כדי להדגיש את חיבורי סינאפסות או מעכבות בהתאם.</li>
	<li>אם חיבור נצפית בתמיסת מלח, להוסיף TTX למערכת זלוף להשגת ריכוז סופי של 1 מיקרומטר. השתמש משאבה recirculating ללכוד ולהשתמש את תמיסת המלח כדי לחסוך טטרודוטוקסין. משאבת סחרור לצייר את תמיסת מהאמבטיה ולהחזיר אותה למאגר המים מלוחים.</li>
	<li>להתאים את מהירות המשאבה לספק ואקום קבוע חזק שאינו מאפשר את רמת מלוחים באמבטיה עם תוכי. הערה: היישום של TTX צריך לגרום הפסקת spiking פעילות הנוירון המנוטר בתא-שלם. זה מאשר כי מספיק TTX נוספה מלוחים...</li>
	<li>החל פולסים קצרים של אור אדום (40 ms לכל פעימה) שוב. בשלב זה, כל קשר סינפטית הנשאר סביר monosynaptic. להוסיף היריבים תרופתי מלוחים recirculating לבחון את האופי הכימי של קשרים סינפטיים שנותרו ב טטרודוטוקסין. הערה: כאשר שילוב של optogenetics ומיקוד פלורסנט של נוירונים, זה עשוי להיות חשוב לא לבצע את הפעלת בהתמדה את האוכלוסייה presynaptic של הנוירונים ניסה להשיג הקלטה. זה יכול להוביל לדיכאון סינפטית והופכת אותו קשה לראות את החיבורים. מכיוון csChrimson יש להקה עירור ארוכות המרחיבה בהרחבה לתוך הטווח של חלבון פלואורסצנטי ירוק, fluorophore אדום יכול לשמש כדי להמחיש נוירונים ו- channel2rhodopsin (Ch2R) יכול לשמש כדי לרגש אוכלוסיות תאים. כך דורש גנטיקה מסוימת קוביה מסנן מותאם אישית. כדי ליצור זבובים מתאימים, להפוך זבובים המבטאים את fluorophore אדום (RFP או mCherry) תחת מערכת בינארית ביטוי מערכת לקסה או Q. אלה יצטרכו חצה עם זבובים לבטא מקדם Gal4 וגם הגנים אפקטור UAS-Ch2R ו- UAS-NaChBac. הקוביה מסנן אופטימלי עבור epifluorescence יהיה מגוון עירור צר כדי לרגש את fluorophore אדום, אבל לא לרגש את Ch2R. בנוסף, ערכת מסנן צריכה לכלול מסנן פליטה מסירה ארוכה כדי לאסוף כמה שיותר האור הנפלט. השתמשנו מסנן מותאם אישית של Chroma שכלל חלק מספרי et580/25 x ו- t600lpxr (מקבוצת 49306), אבל עם מסנן פליטה/מכשול et610lp.</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li>
<li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li>
<li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li>
<li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+olfactory+processing+in+Drosophila%3A+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
<li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li>
<li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+in+Drosophila%3A+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior%2C+neuronal+signaling%2C+and+physiology+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laserspritzer%3A+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li>
<li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li>
<li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתוח TERPS מחמאות הנוכחי טכניקות המשמשות עבור מעגל פיצוח על-ידי הפיכת זיהוי הסינפסות בין נוירונים שזוהה. באופן ספציפי, הגישה חושף קשרים monosynaptic על ידי בהרחבה להשתיק פוטנציאל פעולה עם TTX בעת שיחזור דעתנית אוכלוסיה בחירה של נוירונים עם תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac. שחרור סינפטית היא שהפיק optogenetic גירוי בזמן אירועים postsynaptic מנוטרים עם תאים כל הקלטות. TERPS מבדיל עצמו לבין גישות אחרות כגון תפיסתו על ידי רגיש בכמות גדולה או אמצעי שידור elicited למרחקים ארוכים, היכולת לבצע מניפולציות תרופתי. הטכניקה פשוטה יחסית...

יעד מרכזי של מדעי המוח הוא למפות את הקשרים בין הנוירונים כדי להבין כיצד מידע זורם דרך מעגלים. גישות ומשאבים רבים הפכו להיות זמין לבדוק את תפקודי קישוריות בין הנוירונים בטווח של דגם מערכות1,2. כדי להפיק את תרשימים בחיווט המדויקות ביותר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, חשוב לפתור אם חיבורים שנצפה בין שני תאים הם monosynaptic לעומת עקיף ו polysynaptic הישירים. תקן הזהב להכנת הבחנה זו בנוירונים יונקים זה מודדים ההשהיה בין יחיד action potentials בתאים presynaptic תחילתה של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) בתוך הנוירון השני. חיבורים monosynaptic צריך השהיות ארוכות יותר קצר של כמה אלפיות השניה, השתנות נמוכה3. גישה זו יכולה להיות מסובכת בנוירונים הגעה מכיוון הסינפסות עלולה להתרחש שלהם דנדריטים רחוק באתר הקלטה הסומטית, גרימת עיכובים בזיהוי בשל המרחקים זמן electrotonic בין postsynaptic conductances את ההקלטה אלקטרודה. עיכובים כאלה יכולים להציג את עמימות בנוגע פולי-לעומת תרומות monosynaptic. בנוסף, אירועים קטנים סינפטית ייתכן ריקבון לפני שמגיעים לאתר הקלטות הסומטית, נהיגה פעילות presynaptic חזק יותר, סביר להניח לגייס אירועים polysynaptic.
טכניקות שונות פותחו כדי לבדוק חיבורים monosynaptic חסרי חוליות. גישה אחת משתמשת הקטיון כלט גבוהה פתרונות (Hi-Di) המכילים עודף מ ג++ ו- Ca++. פתרון זה חוסמת חיבורים polysynaptic על-ידי הפחתת שחרור ההסתברות הסף הגדלת פוטנציאל הפעולה לטובת גילוי של קלט monosynaptic4,5. קביעת היחס המדויק של מ ג++ ל Ca++ הנדרשים, עם זאת, לא טריוויאלי, תרומות polysynaptic עלול להימשך אפילו צנוע גירוי6. גישה חלופית בשם GFP שיחזור על פני סינפטית שותפים (תפיסה) מנצל הקירבה בין ממברנות קדם ו postsynaptic ב הסינפסות להסיק חיבור monosynaptic 7. . הנה, רכיב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתבטאת נוירון אחד, הרסיס משלימים של המולקולה מתבטאת שותף postsynaptic בשם. הנוכחות של קרינה פלואורסצנטית מציין כי שני הנוירונים נמצאים מספיק קרוב מאוד להתיר הכינון של מולקולת ה-GFP, מרמז על קיום סינפסה. תפיסתו יכולים לדווח הסינפסות זכריה, אם שני תאים יש קשר הדוק אני בטוחה ממברנות, כמו עצב או fascicle. וריאציות של תפיסתו לחסל תוצאות חיוביות שגויות כאלה על ידי קשירה של שבר presynaptic של GFP ישירות אל synaptobrevin, ובכך מאפשר שיחזור רק ב הסינפסות פעיל8. בעוד תפיסתו והווריאנטים שלה היה תפקיד חשוב בקביעת פונקציונלי קישוריות דרוזופילה CNS, קשרים לא עשויים להיות גלויים לפי תפיסתו אם המרחקים בין שותפים קדם ו postsynaptic גדול יחסית. זה רלוונטי במיוחד על פי הערכות של העברת אמצעי האחסון המשויך neuromodulation9 או עיכוב GABAergic10.
כאן, טכניקה משלימה ואת הרומן הוא הפגין לבדיקה חיבורים ישירים monosynaptic דרוזופילה CNS. שיטה זו, הנקראת טטרודוטוקסין מהונדסים ההתנגדות על חיטוט Synapses (TERPS), פועלת על-ידי ביטוי משותף טטרודוקסין (TTX)-ערוץ נתרן עמידים NaChBac, של optogenetic activator בתא presynaptic תוך כדי הקלטה מ בשם שותפים postsynaptic9. בנוכחות TTX, מדוכא כל פעילות בתיווך פוטנציאל הפעולה בתאים שאינם לבטא NaChBac. ערוץ NaChBac משחזר באופן סלקטיבי דעתנית ב יישוב presynaptic תא (ים), המתיר הסינאפסית עורר-אור. שיטה זו מאפשרת הפעלה חזקה של הנוירונים presynaptic, כך חיבורים יכולים להיפתר postsynaptically על ידי הקלטה סומאטית תוך צמצום ההסתברות של גיוס מעגלים polysynaptic. חשוב, טכניקה זו מאפשרת לימוד אמצעי שידור, חושף את התפשטות המשדר שוחררו נוירון בודד לאורך כל מעגל. בנוסף, TERPS יכול לחשוף הטבע כימי של החיבור באמצעות פרמקולוגיה קונבנציונלי. TERPS מתאים לשימוש בכל מערכת מודל המאפשר את הביטוי הטרנסגניים של תעלות נתרן TTX-רגישות.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>משמש כמפעיל עצבי</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores ריגוש בתאים ב-TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>ייתכן שיהיה צורך באישור מיוחד לרכישת TTX מכיוון שמדובר בחומר מבוקר</td></tr><tr><td>שכולו טרנס-רשתית</td><td>Sigma-Aldrichall טרנס-רשתית</td><td>R2500</td><td>דורש קו-פקטור עבור channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 נירוסטה&nbsp; גיליון,&nbsp; 0.002"&nbsp; עבה,&nbsp; 10 אינץ'&nbsp; </td><td>מקמאסטר קאר</td><td>רחב 3254K7</td><td>משמש לייצור מחזיק זבובים בהתאמה אישית. ניתן לחתוך נייר כסף מותאם אישית בלייזר ב-pololu.com מקובץ ה-PDF המצורף</td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>משמש לדיסקציה של הכנה</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>משמש במהלך הדיסקציה כדי לאבטח את זבוב בנייר כסף</td></tr><tr><td>שעוות פרפין</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>בשימוש עם מלקחיים</td></tr><tr><td>מספר 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>משמש לדיסקציה והסרת</td></tr><tr><td>מספריים</td> דיסקציה <td>כלי מדע עדינים</td><td>15001-08</td><td>משמש להסרת חלקים מהציפורן במהלך דיסקציה</td></tr><tr><td>חוט טונגסטן</td><td>מערכות A-M</td><td>797500</td><td>השתמש עם אלקטרוליזה לייצור מחטים מחודדות לדיסקציה</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית מחזירה</td><td>פשוט משאבות (אמזון)</td> <td>PM200S</td><td>למחזור</td></tr><tr><td>בקר מהירות TTX עבור משאבה פריסטלטית</td><td>Zitrades (אמזון)</td> <td>N/A</td><td>PWM בקר עמעום לנורות LED או סרט, 12 וולט 8 אמפר, מתג אור בהירות מתכוונן בקר דימר DC12V 8A 96W לאור רצועת לד B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp; ווסת אוויר דחוס מדויק</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>להפעלת לחץ חיובי במהלך תיקון</td></tr><tr><td>מכלי זכוכית</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>TW150F-3</td><td>עבור פיפטות תיקון</td></tr><tr><td>מד רב תכליתי</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>מד לווסת לחץ</td></tr><tr><td>אלקטרופיזיולוגיה מצלמה</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>כל מצלמה שעובדת בטווח ה-IR (850 ננומטר) תעבוד. אינך רוצה להשתמש בתאורה אדומה מכיוון שהדבר יכול להפעיל csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>עבור סיב אופטי תאורה אלכסונית</td></tr><tr><td>עבור IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>זוגות לעדשת אובייקטיבית LED IR</td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>אולימפוס 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>זה יכול לשמש ברוב המיקרוסקיפים ועובד היטב להדמיית נוירונים של זבובים.</td></tr><tr><td>ענבר LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>להמחשת RFP ו-mCherry</td></tr><tr><td>כחול LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>להמחשת סט</td></tr><tr><td>מסנני</td> GFP <td>GFP Chroma</td><td>49011</td><td>להדמיה של GFP או גירוי ערוץ2rhodopsin</td></tr><tr><td>סט מסנן mCherry מותאם אישית</td><td>Chroma</td><td>&nbsp; et580/25x ו-t600LPXR (מהסט 49306) אך עם et610LP מחסום/אופטיקה פליטה</td><td>השתמש רק אם ברצונך לתקן נוירונים מזוהים עם channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic כדי לשלב תאורת LED ענבר וכחול</td><td></td><td>DMLP550R</td><td>השתמש רק בתיקון מתחת ל-mCherry ולעורר את channel2rhodopsin עם אור כחול.</td></tr><tr><td>LED</td><td>אדוםSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 ננומטר</td><td>משמש להנעת csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>משמש להנעת נוריות LED לגירוי אופטוגנטי</td></tr><tr><td>מניפולטור</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>משמש למיקום פיפטה במהלך הקלטות</td></tr><tr><td>מגבר Patchclamp</td><td>A-M Systems</td><td>דגם 2400</td><td>מגבר</td></tr> <tr>שווה ערך מתאים<td>בסל פילטר</td><td>וורנר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>מסנן עזר המשמש לסינון עקבות זרם לאוסילוסקופ במהלך התיקון.</td></tr><tr><td>מערכת איסוף מידע&nbsp;</td><td>נשיונל אינסטרומנטס</td><td>NI PCIe-6321&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 781044-01</td><td>משמש להקלטת נתונים ממגבר למחשב</td></tr><tr><td>בלוק מחברים - מסוף BNC BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>משמש לחיבור מגבר לכרטיס DAQ.</td></tr><tr><td>רדיד פלדה&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>רדיד פלדה לתא הקלטה מותאם אישית</td></tr><tr><td>מגנטים</td><td>K& J Magnetics</td><td>D42</td><td>כדי לאבטח את תא ההקלטה למעמד הטבעת</td></tr><tr><td>1/16 אינץ' תא יצוק אקריליק</td><td>שקוף פולולו</td><td></td><td>משמש לייצור תא הקלטה מותאם אישית. ניתן לחתוך אקריליק בלייזר pololu.com מקובץ ה-PDF המצורף</td></tr></tbody></table>

בחינת חיבורים monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

. הנה, טכניקה חדשה כינה Tetrotoxin (TTX) מהונדסים ההתנגדות של חיטוט Synapses (TERPS) מוחל לבדיקת monosynaptic קשרים בין נוירונים היעד. השיטה מסתמכת על ביטוי משותף activator הטרנסגניים עם הערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac, ב presynaptic נוירון מסוים. קשרים עם שותפים הפוסט-סינפטית בשם נקבעים לפי כל-תא הקלטות בנוכחות TTX, אשר חוסם פעילות חשמלית בנוירונים המבטאים לא NaChBac. גישה זו יכול להיות שונה כדי לעבוד עם activator או סידן הדמיה ככתב של חיבורים. TERPS מוסיף ערכת הכלים הזמינים עבור קביעת קישוריות בתוך רשתות הולך וגדל. עם זאת, TERPS הוא ייחודי בכך שהוא גם אמין ידווח בצובר או אמצעי שידור ושידור והתאמת.

TERPS משמש להבחנה בין מונו - polysynaptic סיועה של קשרים סינפטיים בין נוירונים. בזמן גירוי חלשים של תא עשוי לשמש כדי לבדוק חיבורים ישירים, נהיגה יותר פעילות presynaptic לעיתים קרובות מגייס חיבורים polysynaptic (איור 1 א'). TERPS עובד על-ידי שיתוף לבטא תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac ו- activator optogenetic ולאחר בדיקת חיבורי בנוכחות TTX לחסל את חיבורי polysynaptic (איור 1B). TTX חוסם ביעילות פוטנציאל פעולה במוח דרוזופילה ,...

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות קשרים חד-סינפטיים באופן אלקטרופיזיולוגי בדרוזופילה באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה ויכולה לחשוף את האופי הכימי של סינפסות. זה מתאים גם לחקר העברת נפח או בתפזורת.בדרך כלל, בסרטונים חדשים בשיטה זו, אנו נאבקים בגלל הקושי של הנתיחה. עם זאת, פשוט על ידי הבנת השיטה, ההיגיון ניתן להעברה בקלות למערכות מודל אחרות כגון עכברים. להקלטות, יש פיפטות תיקון להתנגדות ליד שבעה מגה-אוהם.כמו כן, יש מי מלח הקלטה חיצוניים עם pH של 7.3 או פחות מאווררים ברציפות עם קרבוגן המכיל 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. עבור הנבדקים, יש מלאי זבוב המבטא csChrimson, המתפשט על מזון המכיל 0.2 מילימולר של כל הטרנס-רשתית. להקלטות, בחר מבוגרים בני יום עד שלושה ימים.טען אותם לתוך בקבוקון נצנוץ מזכוכית ושתק אותו באמצעות חשיפה של דקה אחת לתנאי קור כקרח. לאחר מכן, הנמיכו את רמת האור על היקף החיתוך והמלקחיים הגסים כדי להעמיס זבוב מורדם לתא ההקלטה המותאם אישית. אבטח את הזבוב לתא על ידי הקפה בשעווה או אפוקסי הניתן לריפוי UV.מקם אותו בצד הגב כלפי מעלה עם נייר הכסף בערך באמצע הדרך במעלה בית החזה. המפתח להשגת הכנה נהדרת הוא לחתוך את החור בנייר הכסף כך שיהיה בדיוק בגודל הנכון, כך שהזבוב לא יילחץ ולא יוכל ליפול דרכו. האירו את התכשיר עם נורות סיבים או

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

פרוצדורה זו משתמשת ערוץ תכלת המופעל אצות תא ספציפי כלי הביטוי הגנטי לעורר פוטנציאלים סינפטיים עם להבזקי האור בצומת neuromuscular (NMJ)...

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

סרטון זה מדגים בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות זבוב מהונדס. לזבוב יש תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין ותעלות המופעלות באור אדום בנוירונים הפרה-סינפטיים שלו, אשר מעוררים אופטוגנטית להעביר אותות לנוירונים פוסט-סינפטיים.

בדיקת קשרים מונוסינפטיים באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין וטטרודוקסין

סרטון זה מדגים את הטכניקה להקלטת זרמים סינפטיים מבוטון סינפטי בצומת העצבית-שרירית של זחל דרוזופילה. טכניקה זו מאפשרת ניטור הפעילות של בוטון סינפטי יחיד, החשוב לחקר קווי זבובים מוטנטיים בעלי פעילות סינפטית ספונטנית או אסינכרונית מוגברת.

הקלטת זרמים סינפטיים בצומת הנוירומוסקולרית של זחל דרוזופילה

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.

אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

חקור חיבורים מונוסינפטיים בנוירונים של דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמידים לטטרודוקסין. שיטת patch-clamp זו חושפת את הטבע הכימי של סינפסות ומאפשרת הבנה מעמיקה של תקשורת נוירונלית.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

גלה סרטונים נוספים