בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לזהות קשרים חד-סינפטיים באופן אלקטרופיזיולוגי בדרוזופילה באמצעות תעלות נתרן עמידות לטטרודוטוקסין. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה ויכולה לחשוף את האופי הכימי של סינפסות. זה מתאים גם לחקר העברת נפח או בתפזורת.

בדרך כלל, בסרטונים חדשים בשיטה זו, אנו נאבקים בגלל הקושי של הנתיחה. עם זאת, פשוט על ידי הבנת השיטה, ההיגיון ניתן להעברה בקלות למערכות מודל אחרות כגון עכברים. להקלטות, יש פיפטות תיקון להתנגדות ליד שבעה מגה-אוהם.

כמו כן, יש מי מלח הקלטה חיצוניים עם pH של 7.3 או פחות מאווררים ברציפות עם קרבוגן המכיל 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. עבור הנבדקים, יש מלאי זבוב המבטא csChrimson, המתפשט על מזון המכיל 0.2 מילימולר של כל הטרנס-רשתית. להקלטות, בחר מבוגרים בני יום עד שלושה ימים.

טען אותם לתוך בקבוקון נצנוץ מזכוכית ושתק אותו באמצעות חשיפה של דקה אחת לתנאי קור כקרח. לאחר מכן, הנמיכו את רמת האור על היקף החיתוך והמלקחיים הגסים כדי להעמיס זבוב מורדם לתא ההקלטה המותאם אישית. אבטח את הזבוב לתא על ידי הקפה בשעווה או אפוקסי הניתן לריפוי UV.

מקם אותו בצד הגב כלפי מעלה עם נייר הכסף בערך באמצע הדרך במעלה בית החזה. המפתח להשגת הכנה נהדרת הוא לחתוך את החור בנייר הכסף כך שיהיה בדיוק בגודל הנכון, כך שהזבוב לא יילחץ ולא יוכל ליפול דרכו. האירו את התכשיר עם נורות סיבים אופטיים משני הצדדים ושמרו עליהם עמומים ככל האפשר.

לאחר מכן, כסו את התכשיר בארבע עד שש טיפות של מי מלח להקלטה. לאחר מכן, חדדו את חוט הטונגסטן או החוט לצורך הדיסקציה. החל כ -20 וולט זרם AC על תמיסה רוויה באשלגן חנקתי וטבל שוב ושוב את קצה החוט במהירות רבה בתמיסה.

לאחר 20 מטבלים, הקצה יהיה חד. כעת, כוונו את האורות כך שיספקו נראות מספקת כדי להשתמש בחוט המושחז כדי לחשוף את המוח על ידי הסרת הקוטיקולה, ואחריה קנה הנשימה וגופי השומן. כדי לגשת לאונות האנטנה, השתמש בחוט טונגסטן כפוף כדי לתחוב בעדינות את האנטנה מתחת למגן נייר הכסף.

לאחר מכן השתמש במלקחיים חדים כדי לקרוע בעדינות את מעטפת הגליה המכסה את אזור העניין. כעת העבירו את התכשיר למתקן האלקטרופיזיולוגיה כדי לבצע הקלטות. באסדה, התחל מיד להחדיר את התכשיר במי מלח הקלטה, מבעבע בקרבוגן.

השתמש במאגר תמיסת מלח המוזן בכוח הכבידה הממוקם מעל שלב המיקרוסקופ. כדי לאסוף את מי המלח של הפסולת, השתמש בקו ואקום ובבקבוק 2 ליטר. לאחר מכן, טען את פיפטת התיקון עם 4 מיקרוליטר של תמיסת הקלטה פנימית והצמד את הפיפטה למיקרומניפולטור.

לאחר מכן, אפס את ההיסט של המגבר והגדר את המגבר לספק פולסים לבדיקה. לאחר מכן, כוונן את התאורה האלכסונית של IR על מנת לקבל תצוגה ברורה של המוח. כעת, תוך הפעלת לחץ חיובי על הפיפטה, התקרב לתא עם הפיפטה.

כאשר נוצר מגע עם התא, שחרר את הלחץ החיובי כדי לאטום את הפיפטה לקרום. לאחר מכן, הגדר את פוטנציאל ההחזקה של הממברנה למינוס 60 מילי-וולט. והפיפטה צריכה ליצור חותם ג'יגה-אוהם עם קרום התא.

זרם ההחזקה אמור לרדת לרמת תת-פיקואמפ נמוכה. כדי להשיג אטמי ג'יגה-אום קבועים, הקפד לשמור על הפיפטה שלך נקייה על ידי שמירה על לחץ חיובי והימנע מפגיעה ברקמות או התקרבות לתאים שלך. כדי להמשיך, הגדר את המגבר לספק פולסי בדיקה ממינוס 50 למינוס 60 מילי-וולט.

פולסי הבדיקה יחשפו חולף קיבולי גדול המייצג את הזרם הדרוש לטעינת פיפטת התיקון. כדי להסיר ארעיות קיבולית, כוונן את כפתורי פיצוי הקיבולת במגבר. כעת, הפעל פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי לקרוע את קרום התא ולקבל את כל תצורת התא.

עלייה גדולה בארעיות הקיבולית מעידה על הצלחה. יש להבחין גם בעלייה קטנה בזרם ההחזקה. לאחר מכן, הגדר את המגבר לזרם clamp מצב.

ולהתאים את פוטנציאל התא למינוס 50 למינוס 60 מילי-וולט. כהכנה, הגדר את מערכת רכישת הנתונים כפי שמצוין בפרוטוקול הטכנולוגי. המערכת דורשת נורית LED אדומה בעלת עוצמה גבוהה הממוקמת מתחת לתכשיר, הממוקמת כדי להאיר את הזבוב ב-0.238 מילי-וואט למילימטר רבוע.

כעת, הפעל את הנוירונים הפרה-סינפטיים באופן אופטוגנטי, באמצעות אור אדום פועם בביטוי csChrimson. ניתן להשתמש גם בשיטות אחרות. לפני מריחת טטרודוטוקסין, חיבור סינפטי אמור להיות גלוי בתגובה לפולס אור של 40 אלפיות השנייה.

אין תגובה פירושה שחיבור אינו סביר. ניתן להתאים את פוטנציאל ההחזקה כדי להדגיש את הקשרים המעוררים או המעכבים, בהתאם. לאחר אימות החיבור, הגדר את שפע המלח למחזור במי המלח.

הגדר את המשאבה כך שרמת המלח באמבטיה תישאר יציבה. לאחר מכן, הוסף מספיק טטרודוטוקסין למערכת לריכוז סופי של מיקרו-טוחנת אחת. זה אמור לעצור את פעילות הזינוק של תא העצב המתוקן.

אם לא, הוסף עוד טטרודוטוקסין למערכת. כעת, הפעילו פולסים קצרים של אור אדום כדי להפעיל את מה שסביר להניח שיהיה קשר חד-סינפטי. לאחר מכן, המשך בהוספת אנטגוניסטים פרמקולוגיים לתמיסת המלח המחזורית כדי לבדוק את האופי הכימי של הקשרים הסינפטיים.

ביטוי טרנסגני של הטטרודוטוקסין בחריץ תעלות נתרן רגיש מציל את הריגוש בתאי עצב ומביא לפוטנציאל מישור גדול. אינטרנוירונים באונה האנטנה מגיבים לריחות. עם זאת, זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים אינם נפתרים בקלות בסומה.

אם כן, האם התגובות נובעות ישירות מקלט נוירונים של קולטני ריח? שימוש ב-tERPs מגלה כי נוירוני קולטני הריח יוצרים קשרים ישירים עם האינטרנוירונים המקומיים. גירוי של הנוירונים הסרוטונרגיים באונה האנטנה מביא לתערובת של עירור ועיכוב באינטרנוירונים מקומיים.

יישום של methysergide, אנטגוניסט רחב לקולטן 5HT, חסם היפרפולריזציה איטית, אך לא הייתה לו השפעה על הדפולריזציה, בעוד שמקמילמין חוסם את הדפולריזציה המהירה. זה מצביע על כך שהגירוי הוא כולינרגי. tERPs שימשו כדי לפתור העברת נפח חוץ-סינפטית המתרחשת עם GABA או נוירומודולטורים.

בדוגמה אחת, יישום של טטרודוטוקסין לא דיכא אות מעכב באינטרנוירון המקומי. עיכוב זה נחסם באמצעות אנטגוניסט הסרוטונין, מתיסרגיד, המרמז על אות ישיר מנוירון סרוטונרגי ספציפי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשיג הקלטות של תאים שלמים מתאי עצב של דרוזופילה ולהעריך את המוליכות שלהם באמצעות tERPs.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות סבלני ולתרגל את הדיסקציה הקשה שוב ושוב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרמקולוגיה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אופי הסינפסה הכימית.

אל תשכח שעבודה עם טטרודוטוקסין עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות ועבודה עם נפחים קטנים, בעת ביצוע הליכים אלה.