Name: חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: חקור שיטה לסינתזת RNA באמצעות תיוג 5-Bromouridine ו-Immunoprecipitation בתרביות תאים. טכניקה זו מאפשרת למדוד שינויים בשיעורי סינתזת RNA ולהבין דינמיקה של מטבוליזם RNA במחקר תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

קרן לונדבק, אוניברסיטת ארהוס, Dandrite, לונדבק יצוק תמיכה עבודה זו.

הערה: בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צויין אחרת ולשמור על מאגרי על קרח או במקרר (למעט מ • תנאי מאגר המכיל מרחביות). הפרוטוקול מחולק למקטעים 5: הכנה של RNA דגימות; הכנה של חרוזים IP; איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים; • תנאי וטיהור של RNA מתויג ברו המאוגד על-ידי מיצוי פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים; ניתוח של RNA (בדוגמה זו באמצעות RT-qPCR)
1. הכנת דוגמאות RNA
<ol><li>HEK293T ספירת תאים באמצעות תא אוטומטיות מונה, זרע 3,500,000 תאים בצלוחית 10 ס מ בתקשורת הצמיחה 10 מ"ל (בינוני ששינה הנשר של Dulbecco בתוספת 10% עגל עוברית סרום ו פניצילין µg/mL 50/סטרפטומיצין...) כדי לקבל סכום כולל של > 40 µg RNA על החילוץ 48 שעות מאוחר יותר לשמור על תאים-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>48 שעות לאחר זריעה, תשאף 8 mL צמיחה מדיה ולהשאיר את 2 מ"ל מאחור כדי למנוע ייבוש התאים. להוסיף 2 מ מ ברו, כל טיפול 8 מ ל aspirated צמיחה מדיה, ולהסיר את השארית 2 מ"ל מתאי לפני החלת mL 8 ברו המכיל צמיחה מדיה. הימנע משימוש מדיה טריים על היישום של ברו התאים, מאז זה יכול לגרום שינויים בביטוי הגנים.</li>
	<li>דגירה את התאים עבור h 1 עם ברו וטיפול. לשטוף את התאים במאגר של 5 מ"ל האנק, trypsinize את התאים באמצעות טריפסין 0.05% 2 מ"ל. הוסף 8 מ ל מדיה הצמיחה כדי לעצור את התגובה, להעביר את התאים צינור 15 מ"ל ו ספין למטה התאים למשך 2 דקות ב g 1,000 x.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולחלץ RNA הכולל מ בגדר התא באמצעות בידוד RNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה ולאחר elute נטולת RNase H2O. החנות את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכנים להמשיך.</li>
</ol>2. הכנה של חרוזים IP
<ol><li>להכין חרוזים בקבוצות במספר הדגימות להיחקר פלוס אחד נוסף בחשבון הפסד במהלך pipetting, להסתחרר ערבוב. Resuspend העכבר אנטי איג beads מגנטי ביסודיות על ידי סיבוב ערבוב, להוציא 20 µL חרוזי לדגימה צינור 1.5 mL RNase-חופשית. המקום הצינור 1.5 mL מעמד מגנטי ו להשאיר כ 20 s עבור החרוזים לאסוף בצד.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, להוציא את הצינור מדוכן מגנטי, resuspend במאגר ברו-IP 1 x µL 400 על-ידי pipetting. לסובב את הצינור קצר עבור 2 s ומפרידה שולחני, מניחים אותה בחזרה דוכן העדים מגנטי, ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב כביסה פעם אחת.</li>
	<li>בלוק לא ספציפי מחייב החרוזים קרישת דם. Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x BrU-IP + 1 מ"ג/מ"ל מאגר הפארין, ולהשאיר סיבוב במשך 30 דקות לשטוף את החרוזים פעם אחת, כמו שלב 2.2. הערה: הפרין הוא פולימר טעונים שלילית, אשר יתחרו עם RNAs לכריכה. tRNA או RNAs לא רלוונטיים אחרים ניתן להשתמש גם אם היישום במורד הזרם לא והרצף.</li>
	<li>Resuspend את החרוזים של 1 מ"ל 1 x ברו-IP מאגר ולהוסיף 1.25 נוגדן anti-α-Bromodeoxyuridine µg/המדגם, אשר גם מזהה ברו. דגירה של חרוזי 1 h תוך כדי סיבוב, או למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2. Resuspend את החרוזים במאגר 50 x 1 µL/מדגם ברו-IP בתוספת 1 מ"מ ברו ולהשאיר סיבוב למשך 30 דקות להוריד את הרגישות של הנוגדן מאוגד החרוזים, בזאת את הסיכון של איגוד לא ספציפי במהלך ה-IP.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים שלוש פעמים כמו שלב 2.2, resuspend במאגר µL/מדגם 1xBrU-IP 50.</li>
</ol>3. איגוד של RNA מתויג ברו כדי חרוזים
<ol><li>למדוד ריכוזים RNA ב RNA תמציות מהשלב 1.3 באמצעות ספקטרופוטומטר אולטרה סגול-גלוי, למהול 40 µg RNA של כל דגימה ללא RNase H2O את הנפח הכולל של 200 µL.</li>
	<li>מחממים את דגימות ה-RNA למשך 2 דקות ב- 80 ° C עד denature RNA ו ספין בקצרה ב צנטריפוגה שולחן. להוסיף 200 µL 2 x ברו-IP + BSA/RNAse מעכב.</li>
	<li>הוסף 50 µL resuspended, להכין חרוזים מהשלב 2.6 כל מדגם ולהשאיר סיבוב ח' 1 לשטוף את החרוזים ארבע פעמים כמו שלב 2.2.</li>
</ol>4. • תנאי וטיהור של RNA הפקת פנול-פנול/כלורופורם-כלורופורם 3 שלבים
<ol><li>
Elute RNA ולבצע פנול החילוץ
	<ol>
<li>Resuspend את החרוזים במאגר • תנאי µL 200 כדי elute RNA, במהירות לאחר מכן להוסיף 200 µL פנול, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה להלן צעד 4.1.2) כדי להסיר כל מולקולות RNA שאינן מן המדגם.</li>
		<li>סיבוב תמהיל המדגם, ספין 3 דקות ב g x 25,000 ומפרידה שולחן. הערה: פנול הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. ה-pH חומצי מעט מבטיח כי רק RNA, ו לא ה-DNA, מופק. הרנ א יישאר בשלב מימית העליון בשל אופיו הידרופילית של חיובים. ליבת הידרופובי חלבונים לאגד פנול ולעבור לשלב התחתון אורגנים פנול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבצע החילוץ פנול-כלורופורם
	<ol>
<li>האחות העליונה-שלב רב ככל האפשר (190 כ µL של µL 200, תלוי ניסיון בטיפול) והעבר אותו לרכבת התחתית עם 200 µL פנול/כלורופורם, pH 6.6 (זהירות: רעיל, ראה הערה). ודא לרוקן את אותה כמות מדגמים.</li>
		<li>ניסיון לערבב את הדגימה ספין למשך 3 דקות ב 25,000 x g. הערה: כלורופורם הוא רעיל ויש לטפל בשכונה fume לובש עור הגנה. כלורופורם נוסף כדי להסיר פנול, אשר יכולים להשפיע על ידי עיכוב שעתוק במהופך14 ופולימראז תגובות שרשרת15ניתוח במורד הזרם של RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע כלורופורם חילוץ על ידי כ רפה בעברית השלב העליון מימית כמו לפני (µL כעת כ- 180), ולהעביר שפופרת המכילה כלורופורם µL 200. ניסיון לערבב את הדגימה, ספין 3 דקות ב g 25,000 x.</li>
	<li>האחות השלב העליון מימית כמו בעבר (עכשיו כ 170 µL), להעביר אותו צינור המכיל 17 µL (כרך 1/10) 3 מ' CH3COONa, pH 6.0. כדי לנטרל לזרז RNA מהפתרון מימית, להוסיף 2 הגליקוגן µL (20 מ"ג/מ"ל), אשר ארגונייט שוקע יחד עם ה-RNA והופכת בגדר RNA גלוי יותר.</li>
	<li>להוסיף 500 אתנול 96% µL להגדיל מחייב בין יונים מלח ו RNA מיקס על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. להשאיר את צינור לילה ב-20 ° C או 15 דקות קרח יבש.</li>
	<li>ספין המדגם ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להשליך תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר ולשטוף בגדר 185 µL 75% אתנול כדי להסיר את כל משקעי מלח. ספין ב 25,000 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע לחלוטין מבלי להפריע בגדר, בגדר להתייבש 5-10 דקות עם מכסה פתוח להשאיר. Resuspend ב 10 µL ללא RNase H2O חלה בצד הצינור כדי להימנע מהפרעה בגדר.</li>
</ol>5. ניתוח של RNA
<ol><li>להכין cDNA באמצעות תיעוד הפוכה cDNA קיט (ראה טבלה של חומרים) או אחרים העדיפו שיטה באמצעות 2 מדגם ה-RNA µL, 1 µg שמרים RNA הכולל כנשא RNA עבור התגובה סינתזה cDNA (לא משמש אם cDNA משמש עבור רצף הדור הבא). השתמש µg 1 RNA ללא שמרים RNA להכנה cDNA של קלט המתאימים.</li>
	<li>CDNA שתדללו 1:25 ו- cDNA של µL 9 מדולל לערבב עם 10 µL qPCR מאסטר מיקס, בדיקה 1 µL fluorogenic, שניהם המצוין בטבלה של חומרים. הערה: דילול cDNA תלוי cDNA הכנה ואת שיטת qPCR.</li>
	<li>הפעל את התוכנית qPCR הבאים (למשל, על מערכת מהר בזמן אמת PCR 7500 או שווה ערך): 2 דקות ב 50 מעלות צלזיוס, 20 s ב 95 ° C, 40 מחזורי 3 s ב 95 ° C ו- 30 s-60 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-like+kinase+2+modulates+%CE%B1-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li>
<li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRIC-seq%3A+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li>
<li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+%CE%B1-synuclein+genomic+multiplications%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li>
<li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra%3A+Positive+and+negative+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li>
<li>Cooper, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+exosomal+siRNA+delivery+reduced+alpha-synuclein+aggregates+in+brains+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mov.+Disord%22%5BJournal%5D)">Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice.</a> Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li>
<li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem.+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li>
<li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li>
<li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose%3F+How+to+evaluate+its+activity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li>
<li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-2253-6_19">Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology</a>. 1262, 305-320 (2015).</li>
<li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Alkynyl-2%27-deoxyuridines%3A+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li>
<li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li>
<li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li>
<li>Dölken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li>
<li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li>
<li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li>
<li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ברו-IP עבור נחישות של RNA הייצור על ידי תוויות של לאחרונה לייצור RNA 1 h עם ברו, ואחריו פינוי מיידי של RNA ו- immunoprecipitation של RNA מתויג ברו. שיטה זו שתיארנו קודם לכן ההפניה16, מאמר זה מכיל שלבים נוספים להגברת IP ירידה לפרטים וטוהר RNA, על ידי חרוזים מראש לטיפול עם ריכוזים נמוכים של ברו, כמו גם צעד פנול-כלורופורם טיהור להגדיל את טוהר RNA בעקבות ה-IP. בנוסף, אנו מציגים גם נתונים כאן הפגנת יחודיות של ברו-IP על-ידי השוואת את הרנ א שנלקחו ברו וברו מטופלים תאים. טיהור פ...

5-Bromouridine (אחי) immunoprecipitation (IP) מאפשר חקר ייצור RNA בתאים ללא או השפעות מוגבלת מאוד על תא פיזיולוגיה במהלך התקציר labelling תקופה1,2. השיטה מבוססת על התאגדות של הנגזרת uridine סינתטי ברו לתוך RNA מסונתז לאחרונה עקב על ידי ה-IP של RNA שכותרתה באמצעות נוגדנים anti-ברו (איור 1).
זה כבר ידוע כי עשרות שנים את סינתזת החלבון להיות מוסדרות transcriptionally, קיום גורמי שעתוק היה שיערו לפני יותר מ 50 שנה3. כיום, ידוע כי כמה מחלות נגרמות על ידי dysregulation של שעתוק ויציבות RNA (משלים איור S1 הפניה4), ואת היכולת למדוד שינויים בייצור ה-RNA הוא בעל חשיבות רבה הבנה במחלה פיתוח.
מצד שני, כלי כדי לווסת את ייצור RNA מספקים אפשרויות חדשות לטיפול במחלות שנגרמו על ידי ביטוי חלבון קטן מדי או גדול מדי, או הצטברות חלבונים כגון מחלת פרקינסון (PD). החלבון השולט צבירת אגרגטים מסיסים כמו ב- PD α-synuclein, הרמה של α-synuclein מקושר ישירות המחלה, כמו ג'ין הכפלה של הגן α-synuclein גורמת PD משפחתית5. יתר על כן, α-synuclein אגרגטים באופן תלוי ריכוז. Downregulation של רמות ה-mRNA α-synuclein לכן אסטרטגיה טיפולית מעניינת, אשר בהצלחה הושגה באמצעות התערבות RNA כדי להקטין את איבוד תאים עצביים ב- PD מודלים מכרסמים6,7.
חשוב שניתן יהיה למדוד את השינויים בתחום ייצור RNA נגרם על-ידי מחלה או התערבויות טיפוליות. המדינה של אמנות שיטות מדידת רמות מצב יציב של RNA, כגון שעתוק במהופך ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (RT-qPCR), אינם מסוגלים להבחין בין השינויים שנגרמו על ידי רגולציה תעתיק או משתנה יציבות הרנ א. שיטה בשימוש נרחב לחקירה של RNA הניוון חוסם של מכונות תעתיק באמצעות תרכובות כגון אמניטין α או ואקטינומיצין D ואחריו מדידות RNAs רקובה. עם זאת, ישנם כמה בעיות הקשורות של חסימה הכוללת של שעתוק בתאים, כגון אינדוקציה של אפופטוזיס8,9. לצד ההשפעות ציטוטוקסיות, מעכבי תעתיק גם להציג מספר בעיות טכניות, כגון ספיגת הסלולר איטי של α אמניטין וחוסר יחודיות של ואקטינומיצין D (נבדקה תוך התייחסות10).
כדי למנוע את החסימה הכללי של שעתוק, נוקלאוטיד מקבילים היו בשימוש, כגון 5-ethynyl uridine (5-האיחוד האירופי), 4-thiouridine (4-טו) וברו. אלה בקלות נלקח על ידי בתרבית של תאים, שולבו לאחרונה מסונתז RNA, הפעלת הדופק-תוויות של RNA בתוך פרק זמן מסוים. ברו רעיל פחות מ 5-האיחוד האירופי, 4-טו, הפיכתה של אנלוגי המועדפת של הבחירה11,12.
ברו-IP יכול לשמש כדי לחקור את קצב סינתזת RNA ויציבות, וכך להבדיל בין הגורמים הבסיסיים של שינויים ב- RNA הכולל. מאמר זה יתמקד המידה של סינתזת RNA ומתייחס להפנות2 פרטים על החקירה של יציבות הרנ א. לחקור סינתזה RNA, התאים הם בקצרה בלוחיות ברו למשל עבור h 1 ואחריו ברו-IP1 (איור 1C). דבר זה מאפשר מדידות של RNA מסונתז בתוך זמן קצר labelling וייתן שינויי אומדן טוב יותר של תקנות ב סינתזה RNA מאשר על ידי מדידת שינויים ב- RNA הכולל מאת RT-qPCR. יש לציין, עם זאת, כי למרות הזמן labelling הוא, לדוגמה, רק 1 h, השפלה יכולים עדיין יש השפעה על רמות ה-RNA שנצפו.
RNA של ברו-IP ניסויים מתאימים לניתוח במורד הזרם על ידי שני RT-qPCR1 או2,רצף הדור הבא13. תקן RNA לזיהוי בשיטות אחרות, כגון סופג בצפון או ribonuclease הגנה assay, עשוי גם להיות ישימים עבור RNAs מסוימים.

<table><tbody><tr><td>מעכב Ribolock Rnase</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 כבשים נגד עכבר IgG</td><td>Life Technologies</td><td>11202D</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bromodeoxyuridine mouse נוגדן</td><td>BD Bioscience</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>ספקטרופוטומטריה אולטרה סגולה גלויה</td></tr><tr><td>פנול pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9712</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: IAA 25: 24: 1 pH 6.6</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד RNA טהור גבוה</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>ThermoFisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444557</td><td>qPCR Master Mix</td></tr><tr><td>בדיקות RNA של Taqman</td><td>ThermoFisher</td><td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: בדיקות</td><td>פלורוגניות</td></tr><tr><td>Hs01072843_m1 7500 מערכת PCR מהירה בזמן אמת</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T קו תאים</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dubbecco Modified Eagle's Medium Lonza</td><td></td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Biochrom</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> האנק <td>5,3 מ"מ KCl, 0.44 מ"מ KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 ו-136.8 mM NaCl pH 6.77, חיטוי.</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td></td><td></td><td>0.1% דיאתילפירוקרבונט מטופל H2O</td></tr><tr><td>2xBrU-IP מאגר</td><td></td><td></td><td>40 מ"מ Tris-HCl pH 7.5 ו-500 מ"מ NaCl במעכב</td></tr><tr><td></td><td></td> DEPC H2O<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse</td><td>מאגר 2xBrU-IP בתוספת 1 &mu; g/&mu; L BSA ו-80 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>BrU-IP+ 1 מ"ג/מ"ל מאגר הפרין</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP מדולל 1:1 DEPC-H2O ובתוספת 1 מ"ג/מ"ל הפרין</td></tr><tr><td>1xBrU-IP</td><td></td><td></td><td>2xBrU-IP מדולל 1:1 ב-DEPC-H2O ובתוספת 0.5 &mu; g/&mu; L BSA ו-20 U/mL Ribolock</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td></td><td>0.1% SDS ב-H2O נטול RNAse</td></tr></tbody></table>

חקירה של סינתזת rna באמצעות labelling 5-bromouridine ו- immunoprecipitation

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

כאשר רמות מצב יציב RNA מושווים בין שני תנאים, אין אפשרות להבחין בין אם השינויים נגרמים שינויים ייצור או השפלה של RNA. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת ייצור RNA, באמצעות 5-Bromouridine תוויות של RNA ואחריו immunoprecipitation, אשר מאפשר חקירה של RNA מסונתז בתוך פרק זמן קצר (למשל, 1 h). היתרון של immunoprecipitation ו- 5-Bromouridine-תוויות על השימוש של מעכבי תעתיק רעילים, כגון אמניטין α וואקטינומיצין D, היא שאין שום או אפקטים נמוך מאוד על יכולת הקיום תא במהלך שימוש לטווח קצר. עם זאת, כי 5-Bromouridine-immunoprecipitation רק לוכד RNA שהופק במסגרת הזמן labelling קצר, לאט המיוצר וכן במהירות השפיל RNA יכול להיות קשה למדוד בשיטה זו. ניתן לנתח את הרנ א. 5-Bromouridine-מתויג שנתפסו על ידי 5-Bromouridine-immunoprecipitation על ידי שעתוק במהופך, כמותית של תגובת שרשרת פולימראזית רצף הדור הבא. כל סוגי RNA יכול ייחקרו, השיטה אינה מוגבלת מדידה mRNA כפי מוצג בדוגמה זו.

לפי הבדיקות הראשוניות של זמן labelling ברו בוצעו בתאים AsPC-1. התאים טופלו על-ברו על 0, 1, 2, ו- 4.5 h, ואחריו הכולל החילוץ-RNA, ברו-IP. GAS5, GAPDH נמדדו ב- RNA ברו-IP, אשר הראו כי 1 h labelling הספיק להגיע כ 9 - ו 44 פי שינוי לעומת הרקע (0 h) עבור GAPDH ו- GAS5, בהתאמה.
ברו-IP הניתוח שתוארו לעיל שימשו כדי לחקור אם גילה השינויים ברמות מצב יציב של mRNA α-synuclein על פולו דמוי קינאז 2 (PLK 2) עיכוב נגרמו שינויים סינתזת mRNA<sup ...

בשיטה זו ניתן למדוד את סינתזת RNA. 5-Bromouridine הוסיף לתאים, שולבו RNA מסונתז. סינתזת RNA נמדד על ידי RNA חילוץ מיד לאחר labelling, ואחריו immunoprecipitation 5-Bromouridine-ממוקד של RNA וניתוח עם תוויות ברורות על ידי שעתוק במהופך ואת תגובת שרשרת פולימראזית כמותית.

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד שינויים בסינתזת RNA על ידי תיוג ברומורידינים ומשקעים חיסוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים של RNA על ידי מדידה האם שינוי ברמות RNA נגרם על ידי שינויים בסינתזת RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בכל סוג מועדף של תרבית תאים והחומרים המשמשים נגישים בקלות.כדי להתחיל את הפרוטוקול, זרעו 3.5 פעמים 10 עד HEK293T השישי בצלחת פטרי של 10 סנטימטר ב-10 מיליליטר של מצע גידול כדי להשיג סך כולל של יותר מ-40 מיקרוגרם של RNA עם מיצוי 48 שעות לאחר מכן. שמרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.48 שעות לאחר הזריעה, שאפו שמונה מיליליטר של מצע גידול והשאירו מאחור שני מיליליטר כדי למנוע מהתאים להתייבש. הוסף שני מילימול של ברומורידין וטיפול למצע הגידול, והסר את שאריות שני המיליליטר מהתאים לפני מריחה חוזרת של שמונת המיליליטר של ברומורידין.לאחר מכן, דגרו על התאים למשך שעה. לאחר הדגירה, שטפו את התאים בחמישה מיליליטר של המאגר של האנק, ונסו את התאים עם שני מיליליטר של 0.05% טריפסין למשך חמש דקות. הוסף שמונה מיליליטר של מצע גידול כדי לעצור את התגובה, העביר את התאים לצינור של 15 מיליליטר וסובב את התאים במשך שתי דקות ב -1, 000 פעמים גרם.לאחר מכן, הסירו את הסופרנטנט וחלצו את ה-RNA הכולל מכדורית התא באמצעות ערכת בידוד RNA,

investigation-rna-synthesis-using-5-bromouridine-labelling

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

סה"כ הסלולרי RNA מספק תבנית עניים לחקר שינויים קצרי טווח בסינתזה וריקבון RNA, כמו גם את הקינטיקה של רנ"א עיבוד. כאן, אנו מתארים תיוג חילוף חומרים של RNA החדש שעבד עם 4-thiouridine אחרי biotinylation תיאול ספציפי ולטיהור של RNA החדש שעבד ומאפשר להתגבר על המגבלות האלה.

סימון מטבולי של רנ&quot;א חדש עיבד לביטוי פרופיל גנטי רזולוציה גבוהה של הסינתזה רנ&quot;א, עיבוד וריקבון בתרבית תאים

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

אנו מתארים גישה ניסויית בסיסית לניתוח סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז II in vivo באמצעות BrUTP על ידי גישת השעתוק הספציפי לגדיל (TRO) בשמרים ניצנים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחקר סיום שעתוק על ידי פולימראזות RNA אחרות הן בשמרים והן באיקריוטים גבוהים יותר.

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

השימוש העצמי אורציל לטיהור ברגישות ובמיוחד לטהר את ה-RNA החדש שהועתק מן השמרים סכביסיטאה.

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

חקור שיטה לסינתזת RNA באמצעות תיוג 5-Bromouridine ו-Immunoprecipitation בתרביות תאים. טכניקה זו מאפשרת למדוד שינויים בשיעורי סינתזת RNA ולהבין דינמיקה של מטבוליזם RNA במחקר תאי.

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

גלה סרטונים נוספים