חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation
3 במאי 2018
בשיטה זו ניתן למדוד את סינתזת RNA. 5-Bromouridine הוסיף לתאים, שולבו RNA מסונתז. סינתזת RNA נמדד על ידי RNA חילוץ מיד לאחר labelling, ואחריו immunoprecipitation 5-Bromouridine-ממוקד של RNA וניתוח עם תוויות ברורות על ידי שעתוק במהופך ואת תגובת שרשרת פולימראזית כמותית.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא למדוד שינויים בסינתזת RNA על ידי תיוג ברומורידינים ומשקעים חיסוניים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים של RNA על ידי מדידה האם שינוי ברמות RNA נגרם על ידי שינויים בסינתזת RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה בכל סוג מועדף של תרבית תאים והחומרים המשמשים נגישים בקלות.
כדי להתחיל את הפרוטוקול, זרעו 3.5 פעמים 10 עד HEK293T השישי בצלחת פטרי של 10 סנטימטר ב-10 מיליליטר של מצע גידול כדי להשיג סך כולל של יותר מ-40 מיקרוגרם של RNA עם מיצוי 48 שעות לאחר מכן. שמרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.48 שעות לאחר הזריעה, שאפו שמונה מיליליטר של מצע גידול והשאירו מאחור שני מיליליטר כדי למנוע מהתאים להתייבש. הוסף שני מילימול של ברומורידין וטיפול למצע הגידול, והסר את שאריות שני המיליליטר מהתאים לפני מריחה חוזרת של שמונת המיליליטר של ברומורידין.
לאחר מכן, דגרו על התאים למשך שעה. לאחר הדגירה, שטפו את התאים בחמישה מיליליטר של המאגר של האנק, ונסו את התאים עם שני מיליליטר של 0.05% טריפסין למשך חמש דקות. הוסף שמונה מיליליטר של מצע גידול כדי לעצור את התגובה, העביר את התאים לצינור של 15 מיליליטר וסובב את התאים במשך שתי דקות ב -1, 000 פעמים גרם.
לאחר מכן, הסירו את הסופרנטנט וחלצו את ה-RNA הכולל מכדורית התא באמצעות ערכת בידוד RNA, והסירו את ה-RNA במים נטולי RNase. טכניקה זו רגישה מאוד, ולכן חשוב לעבוד עם רנ"א באיכות גבוהה. מיצוי ה-RNA הוא אפוא שלב קריטי, אך הוא גם מבוצע בקלות עם ערכות מיצוי ה-RNA של ימינו.
הכן חרוזים באצווה אחת למספר הדגימות שיש לחקור בתוספת אחת נוספת כדי להסביר את האובדן במהלך פיפטינג וערבוב מערבולת. השעו מחדש חרוזים מגנטיים IgG נגד עכבר ביסודיות על ידי ערבוב מערבולת, והוציאו 20 מיקרוליטר חרוזים לדגימה בשפופרת 1.5 מיליליטר נטולת RNase. הנח את הצינור בנפח 1.5 מיליליטר במעמד מגנטי למשך 20 שניות כדי שהחרוזים יתאספו בצד.
הסר את הסופרנטנט, הוצא את הצינור מהמעמד המגנטי והשהה מחדש את החרוזים ב-40 מיקרוליטר של מאגר ברומורידין-IP חד פעמי על ידי פיפטינג. סובב את הצינור למשך שתי שניות בצנטריפוגה שולחנית, הנח אותו בחזרה במעמד המגנטי והסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, חסום כריכה לא ספציפית לחרוזים באמצעות הפרין.
השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של פעם אחת ברומורידין-IP בתוספת מיליגרם אחד למיליליטר של מאגר הפרין, וסובבו את הצינור למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את החרוזים פעם אחת. השעו מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של מאגר ברומורידין-IP חד פעמי, והוסיפו 1.25 מיקרוגרם לדגימה של נוגדן אנטי-אלפא-ברומודוקסיורידין.
דגרו את החרוזים למשך שעה תוך כדי סיבוב. לאחר הדגירה יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים. השעו מחדש את החרוזים השטופים ב-50 מיקרוליטר לדגימה של מאגר ברומורידין-IP חד פעמי בתוספת ברומורידין מילי-מולרית אחת, והשאירו את החרוזים מסתובבים למשך 30 דקות.
לאחר הסיבוב יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים, ולהשעות את החרוזים ב-50 מיקרוליטר לדגימה של מאגר ברומורידין-IP חד פעמי. למדוד את ריכוזי ה-RNA בתמציות ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטריה הנראית לעין אולטרה סגולה, ולדלל 40 מיקרוגרם של RNA מכל דגימה במים נטולי RNase לנפח כולל של 200 מיקרוליטר. לאחר דנטורציה של ה-RNA במשך שתי דקות ב-80 מעלות צלזיוס, סובב את הדגימות לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית.
לאחר הסחיטה, הוסף 200 מיקרוליטר של פי שניים ברומורידין-IP בתוספת BSA, מעכב RNase. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר מהחרוזים התלויים והמוכנים לכל דגימה, וסובב את הדגימות למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשטוף את החרוזים ארבע פעמים.
השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של מאגר פליטה כדי לחסל את ה-RNA, והוסיפו במהירות 200 מיקרוליטר של פנול pH 6.6 כדי להסיר כל מולקולה שאינה RNA מהדגימה. סובבו את הדגימה לערבוב, וסובבו אותה במשך שלוש דקות בחום של 25,000 פעמים גרם בצנטריפוגה על השולחן. לאחר מכן, שאפו כמה שיותר מהשלב העליון, כ -190 מיקרוליטר, והעבירו אותו לצינור עם 200 מיקרוליטר של pH 6.6 פנול-כלורופורם.
הקפד לשאוף את אותה כמות בכל הדגימות. סובב את הדגימה וסובב אותה. לאחר הסיבוב, בצע מיצוי כלורופורם על ידי שאיבת השלב העליון הימי, כ-180 מיקרוליטר, והעברתו לצינור המכיל 200 מיקרוליטר כלורופורם.
סובב ואז סובב את הדגימה. שאפו את השלב העליון הימי, כ-170 מיקרוליטר, והעבירו אותו לצינור המכיל 17 מיקרוליטר של pH שלושה מולארי שש נתרן אצטט כדי לנטרל ולזרז את ה-RNA מהתמיסה המימית. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של גליקוגן, אשר ישקעו עם ה- RNA ויהפכו את הגלולה לגלויה יותר.
הוסף 500 מיקרוליטר של אתנול 96% כדי להגביר את הקישור בין יוני המלח ל-RNA, וערבב על ידי היפוך הצינור כמה פעמים. השאירו את הצינור למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס או למשך 15 דקות על קרח יבש. סובב את הדגימה המצוננת, השליך את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה, ושטוף את הגלולה ב-185 מיקרוליטר של 75% אתנול כדי להסיר שאריות מלח.
לאחר מכן, סובב את הדגימה ב-25,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט לחלוטין מבלי להפריע לגלולה, והשאירו את הכדור לייבוש במשך חמש עד 10 דקות כשהמכסה פתוח. השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיקרוליטר מים נטולי RNase המונחים על צד הצינור כדי למנוע הפרעה לגלולה.
תאי AsPC-1 טופלו בברומורידין במשך אפס, שעה, שעתיים ו-4.5 שעות, ולאחר מכן מיצוי RNA כולל וברומורידין-IP. GAS5 ו-GAPDH נמדדו ב-RNA ברומורידין-IP, שהראה ששעה אחת של תיוג הספיקה כדי להגיע לשינוי של פי 9 ו-44 בהשוואה לרקע. שני מילימול של טיפול בברומורידין לא גרמו לשינויים מורפולוגיים בתאי HEK293T במשך שעה אחת או טיפול ארוך יותר של ארבע שעות.
עיכוב PLK-2 גרם לעלייה ב-mRNA אלפא-סינוקלאין הן בקלט והן בברומורידין-IP, מה שמצביע על כך שהעלייה ב-RNA במצב יציב נגרמת על ידי עלייה בסינתזה של RNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתייג RNA מסונתז חדש עם ברומורידין, ולבצע משקעים חיסוניים לאחר מכן של ברומורדין ושל ה-RNA המסומן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ניתן להשתמש בשיטה זו למדידת סינתזת RNA באמצעות סימון בברומו-יורידין (bromouridine) ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation). היא מסייעת לקבוע האם שינויים ברמות ה-RNA נובעים משינויים בסינתזת ה-RNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מטבוליזם של RNA
- טכניקות תרביות תאים
- ניתוח כמותי
רקע
- סינתזת RNA היא תהליך קריטי בתפקוד התאי.
- בּרוֹמוּאוּרִידִין הוא אנלוג של נוקלאוזיד המשמש לסימון RNA.
- אימונופרסיפיטציה מאפשרת בידוד של RNA מסומן.
- טכניקה זו ישימה עבור סוגי תאים שונים.
מטרת המחקר
- למדידת שינויים בסינתזה של RNA.
- לבדיקת הקשר בין רמות ה-RNA לבין קצבי הסינתזה.
- לשימוש בשיטה נגישה וניתנת להתאמה לתרביות תאים שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- זריעת תאי HEK293T בצלחת פטרי.
- הוספת ברומו-יורידין (bromouridine) למצע הגידול.
- מיצוי RNA לאחר תקופת אינקובציה מוגדרת.
- ביצוע אימונו-פרסיפיטציה (immunoprecipitation) וניתוח של ה-RNA באמצעות quantitative PCR.
תוצאות עיקריות
- שילוב מוצלח של ברומויורידין ב-RNA המסנתז.
- השגה של מדידה כמותית של סינתזת RNA.
- הדגמת ישימות השיטה בסוגי תאים שונים.
- מתן תובנות לגבי הדינמיקה של חילוף חומרים של RNA.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר סינתזת RNA.
- היא יכולה לסייע בהבהרת מנגנונים של מטבוליזם של RNA.
- חומרים וטכניקות נגישים מגבירים את התועלת שלה במחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה ישירה של סינתזת RNA באמצעות סימון ב-5-bromouridine ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation) מאפשרת לצוותי ביו-פארמה להבחין בין ייצור תעתוקי לבין פירוק RNA, נקודה קריטית בתיקוף מטרה (target validation) והפחתת סיכונים מכניסטיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הבהרה האם שינויים נצפים ברמות ה-RNA נובעים משינויים בקצבי הסינתזה. התאימות של השיטה למערכות תאים מגוונות ולניתוחים כמותיים המשכיים מגבירה את ישימותה עבור פורטפוליו רחב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של פעילות תעתוק לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרה.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין שינויים ב-RNA הנובעים מסנתזה לבין שינויים הנובעים מדגרדציה.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי במחקרים של מודולציה של נתיבים ומעורבות מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין קריאות מאושרות של סינתזת RNA עבור תהליכי עבודה כמותיים בהמשך.
- מאפשר סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות שלבי סימון ושיקוע חיסוניים מוגדרים.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה של השפעות תרכובות על ייצור RNA בסוגי תאים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם למודלים רלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות למדידת סינתזת RNA במערכות תאים שונות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה בניתוח כמותי של סמנים ביולוגיים.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבהרת המנגנונים התעתוקיים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף שלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני על ידי מתן קריאה ישירה של סינתזת RNA, ובכך היא תומכת הן בבדיקת השערות והן בניתוחים כמותיים.
- ביולוגיה של גילוי: מבהיר האם מודולציה של המטרה משפיעה על ייצור ה-RNA או על יציבותו, ובכך מספק מידע לניתוח מסלולים.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על סינתזת RNA, המתאימים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת ביצוע qPCR וריצוף בשלבים הבאים למדידה חסונה של RNA שסונתז לאחרונה.
- מחקר תרגומי: תומכת בהתאמת סממנים ביולוגיים באמצעות מדידת סינתזה של RNA הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה בעל יישום רחב למחקרי מטבוליזם של RNA על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של מדידת סינתזת RNA באמצעות ריאגנטים ופרוטוקולים נגישים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי הבהרת מנגנונים של שעתוק בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון על ידי הבחנה בין שינויים ב-RNA המונעים על ידי סינתזה לבין כאלו המונעים על ידי פירוק.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA ובטכניקות של immunoprecipitation.
- נדרשת גישה לתרביות תאים, ל-immunoprecipitation מבוסס חרוזיים מגנטיים ולפלטפורמות ניתוח כמותיות.
- נדרשת בקרת איכות קפדנית של ה-RNA כדי להבטיח הדירות ורגישות.
- עשוי לדרוש התאמה עבור RNA שסנתזתו איטית או שמתפרק במהירות, בשל חלונות סימון קצרים.
- מגבלות מעשיות כוללות תת-ייצוג פוטנציאלי של מיני RNA מסוימים, בהתבסס על קינטיקת הסנתזה והפירוק.
