פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

בעבודה זו, נדגים פרוטוקול קל לייצור חלבונים אצטיליים הומוגניים באתרים ספציפיים על ידי שימוש ב-E.coli כמארח הביטוי. אצטילציה הפיכה של ליזין של חלבונים היא אחד השינויים הנפוצים ביותר בטבע. הוא ממלא תפקידים חשובים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל שעתוק גנים, תגובת לחץ, התמיינות תאים וחילוף חומרים.

יצירת חלבונים אצטיליים טהורים בעמדות תכנון שימושית מאוד לחקר אצטילציה של חלבונים. עם זאת, זה קשה לרוב השיטות הקלאסיות. אתגר זה נפתר על ידי טכניקת הרחבת הקוד הגנטי.

הוא משתמש במשתנה מהונדס של פירוליזיל-tRNA סינתטאז כדי לטעון tRNA-Pyl עם אצטיליזין, ואז משתמש במנגנון התרגום המארח כדי לדכא את קודון העצירה של UAG ב-mRNA, ומכוון את השילוב של אצטיליזין במיקום התכנון של חלבון המטרה. ראשית, יש להכניס את קודון עצירת הענבר למיקום המתאים בגן המטרה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר. להגביר את פלסמיד התבנית המכיל את הגן של החלבונים מסוג הבר, ולהכניס את מוטציית קודון העצירה מהפריימרים על ידי תגובת ה-PCR.

לאחר PCR, החומר המוגבר מתווסף ישירות לתערובת האנזים kinase-ligase-Dpn1 למשך שעה בטמפרטורת החדר לצורך סירקולריזציה והסרת תבנית. הוסף חמישה מיקרוליטר מהתערובת לצינור של 25 מיקרוליטר תאי E.coli מוסמכים מופשרים. העבירו בזהירות את השפופרת לערבוב, והניחו את התערובת על קרח למשך 30 דקות.

יש לחמם את התערובת בחום של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ולהניח על קרח למשך חמש דקות נוספות. פיפטה 600 מיקרוליטר של מדיה SOC בטמפרטורת החדר לתוך התערובת. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם ניעור.

מורחים 100 מיקרוליטר על הצלחת עם האנטיביוטיקה המתאימה, ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. הפלסמיד מהמושבה הבודדת נשלח לריצוף. השלב השני הוא לבטא ולטהר חלבון אצטיל ספציפי לאתר.

הרם מושבה בודדת מהצלחת, המכילה את גן המטרה המכיל TAG מוטנטי ואת מערכת שילוב האצטיליזין. יש לחסן לתוך 15 מיליליטר חומר LB טרי עם אנטיביוטיקה מתאימה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבירו את תרבית הלילה של 15 מיליליטר למדיה טרייה של 300 מיליליטר עם אנטיביוטיקה, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס.

הוסף אצטיליזין של חמישה מילי-מולרית וניקוטינאמיד של 20 מילי-מולרית כריכוזים הסופיים במצעי הגידול כאשר הספיגה מגיעה ל-5 ב-600 ננומטר. לגדל תאים למשך שעה נוספת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו את המשרה לביטוי חלבון, וגידלו תאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בן לילה.

אוספים תאים על ידי צנטריפוגה בחום של 3, 000 גרם למשך 15 דקות. השליכו את הסופרנטנט ואחסנו את כדורי התא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות. הפשירו את כדורי התאים הקפואים על קרח והשעו מחדש עם 15 מיליליטר של מאגר ליזה, חמישה מיקרוליטרים של בטא-מרקפטואתנול ומיקרוליטר אחד של נוקלאז.

תאים נשברים על ידי סוניקציה. תמצית גולמית של צנטריפוגה ב -20, 000 גרם למשך 25 דקות בארבע מעלות. מסננים את הסופרנטנט בעזרת פילטר ממברנה של 45 מיקרומטר.

טען דגימה מסוננת לעמודה המכילה מיליליטר אחד של שרף ניקל NTA, מאוזן עם 20 מיליליטר של מאגר ליזה. שוטפים את העמוד עם 20 מיליליטר מאגר כביסה. חלבון המטרה חומק עם שני מיליליטר של מאגר פליטה.

החלבון המטוהר מותפל על ידי עמודת PD-10 על ידי הוספת דגימה של 2.5 מיליליטר, ואוסף דגימה מותפלת עם מאגר התפלה של 3.5 מיליליטר. השלב הבא הוא אפיון ביוכימי של חלבון אצטיל מטוהר. דנטורציה של חלבונים עם מאגר דגימת SDS מעל 100 מעלות למשך חמש דקות.

צנטריפוגה את התערובת, טען על ג'ל SDS-PAGE והפעל ב-200 וולט למשך 30 דקות. שוטפים את הג'ל במים מזוקקים ומנערים בעדינות. להכנת הכריך לכתמים מערביים, מקתודה לאנודה הוא ספוג, נייר סינון, מאגר העברה, ג'ל SDS-PAGE ספוג, קרום PVDF המופעל על ידי מתנול, נייר סינון נוסף, הסר את הבועות בכריך וספוג נוסף.

הכניסו את הערימה למיכל ההעברה. הפעל בזרם קבוע של 350 מיליאמפר למשך 45 דקות. שוטפים את קרום ה- PVDF עם מאגר TBST של 25 מיליליטר למשך חמש דקות בניעור עדין.

חסום את הממברנה עם 5% BSA ואת מאגר ה-TBST למשך שעה בטמפרטורת החדר. דגרו את הממברנה עם נוגדן אצטיליזין מצומד HRP מדולל בטמפרטורת החדר למשך שעה או ארבע מעלות למשך הלילה עם ניעור עדין. שוטפים את הממברנה עם מאגר TBST של 20 מיליליטר למשך חמש דקות בניעור עדין.

חזור על שלב זה ארבע פעמים. מרחו את המצע הכימילומינסנציה על הממברנה למשך דקה אחת. צלם את האות עם מצלמת בסיס של מצלמת CCD.

אותם נפחים של שברי פליטה וטיהור חלבון הועמסו על ג'ל SDS-PAGE. התפוקה של חלבון אצטיל היא כמחצית מהחלבון מסוג הבר, שהוא יעיל ביותר, ואותו זן ביטוי ללא אצטיליזין ומצע גידול אינו יכול לייצר חלבונים עם כמות ניתנת לזיהוי, מה שמעיד על טוהר גבוה של חלבון אצטיל מכיוון שאין חומצות אמינו קנוניות המשולבות במיקום ספציפי זה. Western Blotting הראה כי אין אצטילציה ניתנת לזיהוי בחלבון מסוג בר, מה שמצביע על הרקע הנמוך של אצטילציה לא ספציפית של מערכת ביטוי זו, בעוד שלחלבון אצטילציה היה פס ברור.

ספקטרומטריית מסה טנדם אישרה כי אצטילציה מתרחשת באתר הנכון שמיקומו המקביל בגן עבר מוטציה לקודון העצירה. כדי לקבל תשואות טובות וטוהר של חלבונים אצטיליים, יש להשתמש במערכת שילוב האצטיליזין האופטימלית הן ליעילות גבוהה והן לטוהר גבוה. יש להשתמש בתאי BL21(DE3) לרקע נמוך ואצטילציה לא ספציפית כדי להגביר את הטוהר.

מערכת השילוב הגנטי יכולה לשמש במערכות איקריוטיות ליישומים רחבים יותר.