Name: זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו לזהות וריאנט תעתיק נדיר של CDH1 בסרטן קיבה באמצעות שבב דיגיטלי PCR. שיטה זו משפרת רגישות ודיוק בזיהוי מולקולות cDNA בדגימות רקמה מוקפאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות Gráinne טירני לסיוע העריכה.

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה IRST מחקר אנושי.
הערה: הליך זה היא תוכננה במיוחד עבור זיהוי מספר נמוך של cDNA מולקולות ברקמות אנושיות מוקפאות. הסעיפים רקמות צומצמו בקרח יבש, בעוד עדיין קפוא, הגידול המאומת בעבר נגזר החולה קיבה או דגימות רקמה נורמלית.
1. RNA בידוד וטיהור
<ol><li>
החילוץ-RNA הערה: בידוד RNA מתבצע מתחת למכסה המנוע באמצעות מוצר מסוים (ראה טבלה של חומרים). עם זאת, מגוון רחב של אלייזה זמינים מסחרית.<ol>
<li>Homogenize 50-100 מ"ג של דגימת הרקמות קפוא טרי חתוך דק צינור 1.5 מ עם 1 מ"ל של RNA בידוד ריאגנט ו מערבולת נמרצות עבור Incubate ס' 15 הצינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>דגירה של שפופרת המכילה את הדגימה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות, מערבבים על-ידי vortexing עבור 15 s.</li>
		<li>לשמור את הצינורית על קרח, להוסיף 200 µL של כלורופורם, מערבולת נמרצות במשך 15 s.</li>
		<li>דגירה של הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 60 s, צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להעביר את השלב מימית צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µg של גליקוגן. הערה: חשוב להימנע בקפידה העברת לאטמוספרה או שכבה אורגני כדי לצמצם זיהום.</li>
		<li>להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל, היפוך את הצינור כדי לערבב, דגירה על קרח למשך 10 דקות.</li>
		<li>Centrifuge את הצינור ב g x 12,000 למשך 15 דקות ב 4 ° C, כדי לזרז את ה-RNA. הערה: RNA יהיה נוכח גלולה דמוי ג'ל בצד ולמטה של הרכבת התחתית, לעתים קרובות בלתי נראה לאחר צנטריפוגה.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע מבלי להפריע את התמיסה, לשטוף אותו עם 1 מ"ל של 75% אתנול על-ידי pipetting.</li>
		<li>Centrifuge את הצינור ב 7,500 g x עבור 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר.</li>
		<li>תן בגדר יבש עד התמיסה הופכת לשקופה, לפזר זאת בתוך µL 50 RNase ללא מים.</li>
		<li>להקפיא את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס לפחות ללילה לפני כמת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חיסול דנ א גנומי וטיהור RNA הערה: צעד עיכול DNase, ואחריו טיהור RNA מבוססי עמודה, מומלצת עבור ניתוחים של מטרות נמוך-שפע כדי לעכל דנ משחיתה.<ol>
<li>להמיס את DNase lyophilized אני (1,500 קוניץ יחידות) ב 550 µL של נטול RNase מים באמצעות מזרק, לערבב בעדינות על-ידי היפוך המבחנה, ולא לחלק את הפתרון מניות משוקם aliquots.</li>
		<li>העברת צינור 1.5 mL הנפח מחושב של הדגימה עם 15 µg של RNA µL 10 DNase העיכול מאגר הערכה (הרשומים בטבלה של חומרים), 2.5 µL של DNase אני הפתרון מניות, נטולת RNase למים ל 100 µL. Incubate בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
		<li>להוסיף 350 µL מאגר פירוק רקמת (הערכה, ראה טבלה של חומרים) על ידי pipetting.</li>
		<li>להוסיף 250 µL של 100% אתנול וביו -מיקס על ידי pipetting.</li>
		<li>להעביר את כל אמצעי האחסון (700 µL) לתוך עמודה חדשה ספין צנטריפוגה ב 12,000 x g 15 s.</li>
		<li>להעביר את המסנן לתוך צינור אוסף חדש, להוסיף 500 µL של 80% כוהל העמודה ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g למשך 2 דקות.</li>
		<li>פותחים את המכסה של עמודה ספין, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות עם צינור אוסף חדש כדי לייבש את המסנן; ואז להעביר את המסנן צינור 1.5 מ.</li>
		<li>להוסיף µL 14 של מים נטולי RNase ישירות סינון העמודה ואילו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות.</li>
		<li>שומרים את הדגימות על הקרח להמשיך כימות באמצעות 2 µL של המדגם על ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון או לאחסן את הרנ א ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cDNA סינתזה
<ol><li>במקום 1,000 ng של RNA, µL 4 של מיקס מאסטר, µL 1 של רוורס טרנסקריפטאז ומים ללא RNase לאמצעי הסופי של 20 µL בשפופרת PCR סטרילי. לערבב בעדינות, ספין למטה.</li>
	<li>דגירה המיקס התגובה ב הצנטרפוגה תרמי, החלת התנאים הבאים: 5 דקות 25 ° c, 30 דקות ב- 42 ° C, 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות בקצרה להמשיך dPCR ניתוח או לאחסן ב-20 ° C עד שהוא נדרש.</li>
</ol>3. PCR דיגיטלי תגובת להגדיר
<ol><li>
התגובה dPCR לערבב, לטעום הכנה
	<ol>
<li>להפשיר את תערובת הבסיס ואת וזמינותו בטמפרטורת החדר במשך לפחות 20 דקות.</li>
		<li>לדלל את דגימות cDNA ריכוז של 300 ng ב- 6 µL של מים.</li>
		<li>בעדינות מערבולת המאסטר לערבב, להכין את התמהיל בשפופרת סטרילי עם 8.7 µL של מיקס מאסטר, µL 0.87 של CDH1a assay מעוצב מותאם אישית ומהצמיגים 1.83 µL של מים נטולי נוקלאז נפח סופי של 11.4 µL. הערה: לקבלת CDH1a assay מעוצב מותאם אישית פריימר פרטים ראה את הטבלה של חומרים.</li>
		<li>µL 11.4 של המיקס מוכן להעביר הדגימה cDNA מדולל, מערבבים בעדינות, בקצרה צנטריפוגה. הערה: אמצעי אחסון כוללים 20% עודף כדי לפצות על אובדן נפח של pipetting. להכין את התערובת כל דוגמאות ופקד אין תבנית (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת צ'יפס הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות לטעון את האסימונים בהקדם האפשרי.<ol>
<li>הכנס מטעין שבב והמתן עד שנורית החיווי הופך לירוק.</li>
		<li>להסיר את הכובע של המזרק נוזלים טבילה על-ידי בעדינות למשוך בחזרה על הבוכנה 1-2 מ מ, משחררים אותו כדי להקל על שלב זה, ולהחליף אותו עם טיפ.</li>
		<li>שבב חדש ואין לרשום הקוד שנכתב על המכסה כדי לשייך אותה המדגם.</li>
		<li>להחזיק את המכסה בזהירות על ידי הצד שלו, הקילוף הסרט המגן ולמקם את המכסה עם הפנים נדבקים למעלה לכיוון הנכון.</li>
		<li>. ובזהירות לאסוף שבב, מטפל לא לגעת החלק הפנימי, להעמיס אותם על הקן שבב בתנוחה הנכונה על ידי לחיצה הידית כדי לפתוח את המלחציים</li>
		<li>לטעון להב הטעינה חדש לתוך מטעין ודחף אותו בעדינות כדי לוודא שהוא מחובר בחוזקה במקום.</li>
		<li>העברת µL 14.5 של המיקס תגובה dPCR על גבי הלהב הטעינה מבלי לבצע בועות אוויר הסחה הלהב, לאחר תודה השחור טעינת כפתור כדי להפיץ את עוצמת הקול על השבב.</li>
		<li>להשתמש במזרק נוזלים טבילה להעביר כ 20 טיפות על גבי משטח השבב מקפיד לא לעלות על פני השטח עם הקצה. הערה: חשוב לכסות את השטח כולו מבלי לשפוך נוזל פינות.</li>
		<li>לסובב את הזרוע מטעין כדי להפוך את המכסה לבוא במגע עם השבב ולחץ מטה עבור 15 s.</li>
		<li>לחץ על לחצן המכסה כדי לשחרר את השבב ולחזור הזרוע את מיקומו.</li>
		<li>להחזיק את השבב שהורכב בזווית של 45° בקפידה לוותר על הנוזל טבילה עם המזרק דרך היציאה מילוי, לסובב מעט את השבב, ודא כי קיימים אין בועות אוויר ו להסיר את כל הנוזלים העודפים עם מגבון סטרילי.</li>
		<li>לאטום את התיק שבב על ידי בעדינות פילינג משם את התווית על גבי שבב פנים העיתונות מעל הנמל למלא לפחות 5 s.</li>
		<li>לאחסן את השבב בחושך עד מוכן לטעון הצנטרפוגה תרמי. הערה: צ'יפס מוכן אמור לשמש בתוך שעתיים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תגובה dPCR
	<ol>
<li>פותחים את המכסה, להתקין מתאמי של שני בלוקים, אפילו כאשר בלוק יחיד משמש.</li>
		<li>מניחים את הז'יטונים על הרחוב דגימה בתנוחה הנכונה. הערה: הנמל המילוי חייב להיות מכוון לכיוון החלק הקדמי של הצנטרפוגה תרמי במיקום גבוה כדי לאפשר בועות אוויר כדי לצוף למעלה מבלי להפריע את החלון של השבב. השתמש שבבי ריק כדי לאזן את שני רחובות.</li>
		<li>שכב משטח תרמי על הרחוב דגימה לכסות לגמרי את האסימונים.</li>
		<li>סגור את המכסה. ולהתחיל את PCR לרוץ, החלת התנאים הבאים: להחזיק ב 96 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; 45 מחזורים של 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ו- 98 ° C ל 30 s; להחזיק ב 60 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; . תחזיק על 4 מעלות צלזיוס. כבה הצנטרפוגה תרמי ואת להפשיר את האסימונים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 10 דקות. הערה: ניתוח שבב חייב להתבצע בתוך שעה אחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח צ'יפ
	<ol>
<li>פתח את המכסה של הכלי, להסיר את רפידות תרמי ולאחר מכן להסיר את האסימונים המתאמים. הערה: אחסן את האסימונים במיקום כהה, נקי עד הניתוח.</li>
		<li>לנקות את השטח שבב עם אלכוהול איזופרופיל ולנגב סטרילי. הערה: לבדוק כל שבב נזילות או בעיות פוטנציאליות.</li>
		<li>הכנס ה-USB לתוך מערכת גלאי כדי לשמור את הנתונים.</li>
		<li>פתח את מגש שבב של מערכת גלאי, לטעון את השבב הפנים כלפי מעלה בתנוחה הנכונה ולאחר מכן סגור את המגש.</li>
		<li>המתן 30 s לעיבוד, ואז להסיר את השבב והכנס הבא.</li>
		<li>מחכים ניתוח להשלים עבור כל האסימונים מעובד ואז להוסיף את ה-USB למחשב. כדי להעביר את הקבצים. הערה: הזמן הכולל לניתוח הוא בסביבות 2 דקות 3/שבב.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. נתוני ניתוח ופרשנות
<ol><li>להתחבר פלטפורמת תוכנה מבוססי ענן הדרושים לביצוע כל הבדיקות במורד הזרם.</li>
	<li>יצירת פרוייקט, לייבא את כל קבצי הנתונים של האסימונים של עניין.</li>
	<li>הזן את השם מדגם; בחר את צבען ואת וזמינותו להשתמש בכרטיסיה "להגדיר צ'יפס".</li>
	<li>לקבוע אם השבב הוא מקובל דמיין זאת בכרטיסיה "סקירת נתונים", בודק איך ביסודיות המדגם היה טעון על גבי השבב, כמה נקודות הנתונים הן להערכה. הערה: דוחים צ'יפס עם פחות מ-13,000 נקודות נתונים להערכה.</li>
	<li>לעבור העלילה פיזור של השבב שנבחר בצד ימין של המסך. להחיל את הסף של 6,000 עבור אותות צבע (ציר y) כתב amidite (FAM) fluorescein על כל האסימונים. הערה: הסף להגדיר עשויים להשתנות על בסיס מבחני בשימוש.</li>
	<li>הסרה של סימנים חיוביים מפוקפק כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות על-ידי בחירת המקום היחסי על הפיזור מגרש באמצעות הכלי לאסו והקשה על "לא ידוע". כל נקודות חיוביות הנותרים את נוכחותם cDNA עותקים של המטרה נדיר מנותח.</li>
</ol>

<ol><li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
<li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer%3A+cellular+consequences%2C+clinical+applications+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin%2FCDH1+intron2%3A+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li>
<li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+%28E-cadherin%29+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li>
<li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Assays+Part+I%3A+Partitioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li>
<li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR%3A+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li>
<li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Transl.Med%22%5BJournal%5D)">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897(2017).</li>
<li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849(2015).</li>
<li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296(2013).</li>
</ol>

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים לעבודה זו.

dPCR פותחה במקור עבור ה-DNA מדידות מולקולרית10,11,12,13 , בזמן שטכנולוגיה זו הותאמה עבור כימות של מיקרו Rna ו- RNA תעתיקים5, 14,15. ב פרוטוקול זה הרחבנו את רשימת יישומים לכלול גילוי של תעתיקים נדירים נגזר דגימות רקמה מוקפאות. . למטרה הזאת אנחנו מנוצל כמות גבוהה למדי של cDNA (300 ng). למרות כמות זו אינ...

הגן CDH1 מקודד עבור E-קדהרין, גורם מפתח מעורב קיומם של האפיתל קיבה רגיל באמצעות ויסות תא אדהזיה, הישרדות, הפצה, העברה1. איבוד חלבון E-קדהרין כתוצאה germline ברישול או שינויים סומאטית של CDH1 היה קשור עם התפתחות GC2,3. Non-קנונית תעתיקים הנובעים אינטרון 2 של הגן יש גם היה שיערו לשחק תפקיד carcinogenesis קיבה4,5. בפרט, אחד תעתיק כזה, CDH1a, הוכח להתבטא שורות תאים GC אבל הוא נעדר מן בקיבה נורמלי4. לאחרונה גילינו CDH1a GC דגימות רקמות מחולים GC משתמש המבוסס על שבב dPCR5. dPCR שימש כדי להעריך, בפעם הראשונה, הנוכחות של בתמליל ג'ין CDH1a GC מעיים, רקמה נורמלית.
השיטה תקן הזהב כדי לקבוע ביטוי גנים היא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR). עם זאת, הנתונים המתקבלים לפעמים יכול להיות משתנה, באיכות ירודה, במיוחד כאשר רמת היעד במדגם הוא נמוך. ההשתנות יכולה להיגרם על ידי מזהמים, ומפריעים פולימראז פעילות של פריימר חישול, המוביל שאינם ספציפיים הגברה צידו התחרותי תגובות6.
העקרונות הבסיסיים הביוכימי של dPCR אמנם דומים לאלה של qPCR, dPCR מראה כמה יתרונות, מתן אפשרות עבור מדידות מדויקות מאוד של דנ א גנומי (gDNA) / משלימים במולקולות דנ א (cDNA). אכן, dPCR הוא לתגובה מובילים המסתמך על מכוילת חלוקת מדגם לאלפי וולס, כך שכל אחד טוב מכיל אפס או מולקולה יעד בודד. הגברה ואז מתרחשת רק אצל הבארות המכיל עותק של המטרה, הוא הצביע על ידי אות ניאון. המספר המוחלט של היעד מולקולות במדגם המקורי ואז יכול להיות מחושב על-ידי קביעת יחס חיובי הכולל מחיצות באמצעות פואסון בינומי סטטיסטיקה7.
בנוסף, הטכניקה dPCR מבטל את הצורך להפעיל עיקול רגיל ומכאן הטיה המשויך ולשינויים, המאפשרות כימות ישירה של מטרות8,9; הוא מייצר תוצאות מדויקות יותר לשחזור ללא תלות מזהמים ויעילות בשל שלה עמידות גבוהה בפני מעכבי10; זה הוא רגיש יותר ספציפית יותר qPCR, והוא לכן שיטה אמינה עבור זיהוי מטרה נדיר. לבסוף, חלוקת המדגם לתוך תגובות מרובות מפחיתה את התחרות עם רקע מולקולות ומשפר את הגבול של גילוי מטרה, כך הגברה מאפשר והקלה הגילוי של מולקולות יחיד של gDNA/cDNA6 . זיהוי, כימות של חומצות גרעין על ידי מבוססי שבב dPCR יותר ויותר הוחל להעתיק מספר וריאציות, כימות של ה-DNA שברים, וניתוחים מוטציה11,12,13, נתן דיוק של החומר נמוכה קלט דרישה של השיטה. בנוסף, dPCR לאחרונה שולב הניתוח של שני מיקרו Rna14 וג'ין תעתיקים5,15.

<table><tbody><tr><td>TRIazol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן 20 מ"ג/מ"ל</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute ערכת ניקוי</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT מבחן בעיצוב מותאם אישית</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [ריכוזי בדיקה אופטימליים של dPCR: 900 ננומטר (F),&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 900 ננומטר (R), 250 ננומטר (P)]</td></tr><tr><td>ערכת שבבים QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td> <td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Dual Flat Block Sample Module</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מתאם שבב PCR דיגיטלי QuantStudio 3D עבור בלוק שטוח Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR מעמיס שבבים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR מכשיר עם כבל חשמל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של variant התעתיק נדיר cdh1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי pcr

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, תעתיק קאנונית של הגן CDH1 , נמצאה לבוא לידי ביטוי כמה שורות תאים של סרטן קיבה (GC), ואילו זה נעדר ב רירית קיבה נורמלית. לאחרונה, הבחנו variant תעתיק CDH1a ברקמות הגידול מוקפאות המתקבל חולים עם GC. הביטוי של זה וריאנט של דגימות רקמה נחקר על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR (dPCR) הגישה המובאת כאן. dPCR מציע את הפוטנציאל מדידה מדויקת, חזקים, רגישה מאוד של חומצות גרעין, הוא מנוצל יותר ויותר עבור יישומים רבים בתחומים שונים. dPCR הוא מסוגל גילוי מטרות נדיר; בנוסף, dPCR מציע את האפשרות על כימות מוחלטת ומדויק של חומצות גרעין ללא צורך כיילים ועיקולים סטנדרטי. למעשה, התגובה למחיצות מעשיר את המטרה מהרקע, אשר משפר את עמידות בפני מעכבי ויעילות הגברה. תכונות אלה להפוך dPCR כלי אופטימלית עבור זיהוי בתמליל נדירים CDH1a .

באמצעות ההליך המובאת כאן, בדקנו עבור הביטוי של variant התעתיק נדיר CDH1a ברקמות מוקפאות קיבה. ניתוח הנתונים על-ידי dPCR היה הופיעה על 21-זוגי רגיל וסרטן דגימות רקמה 11 דגימות הגידול נוספים. CDH1a היה לזיהוי גידולים 15 מתוך 32 (47%), ואילו דגימות רקמה נורמלית לא הראה הנוכחות של התעתיק נדיר זה5. בניתוח שלנו, נדחו צ'יפס עם פחות מ-13,000 נקודות נתונים, כמו צ'יפס עם טעינת אי-הומוגניות. איור 1 מראה לאסימון בדוגמאות עבור להע...

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות גרסאות תעתיק נדירות ברקמות קפואות טריות על ידי PCR דיגיטלי מבוסס שבב. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון איתור וריאנטים נדירים של תעתיק שיכולים להיות מעורבים בסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת זיהוי מטרות בשפע נמוך, ומשפרת את הדיוק ויכולת השחזור ביחס ל-PCR הכמותי של תקן הזהב.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהוי מספר נמוך של מולקולות cDNA ברקמות אנושיות קפואות טריות, ניתן ליישם אותה גם על סוגים אחרים של דגימות ביולוגיות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש צורך לרכוש מיומנות מסוימת בהכנת השבבים והגדרת פרמטרים לניתוח. כדי להתחיל, תנו למאסטר להתערבב ולבדיקה להפשיר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.לאחר מכן, טען צינורות של 0.5 מיליליטר עם שש מנות מיקרוליטר של דגימות ה-cDNA. כמו כן, צור צינור בקרה ללא תבנית. לאחר מכן, מערבל בעדינות את תערובת המאסטר ומכניס 8.7 מיקרוליטר לתגובה לתוך צינור סטרילי.לאחר מכן, עבור כל תגובה, הוסף 0.87 מיקרוליטר של פריימר הבדיקה המותאם אישית, והוסף 1.83 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז. מערבבים את השילוב בעדינות, ומעבירים 11.4 מיקרוליטר לכל צינור המכיל cDNA, ולבקרת ללא תבנית. לאחר מכן, מערבבים את הצינורות בעדינות, ואוספים את תכולת הצינור באמצעות צנטריפוגת דופק.לקבלת תוצאות מיטביות, טען את השבבים בהקדם האפשרי. חבר את מעמיס השבבים לחשמל והמתן עד שנורית החיווי תהפוך לירוקה. לאחר מכן, הכינו את מזרק נוזל הטבילה על ידי משיכה עדינה של הבוכנה למילימטר עד שניים, ואז הסירו את המכסה והוסיפו את הקצה.לאחר מכן, שימו לב לקוד הכתוב על מכסה של שבב חדש. לאחר מכן, החזיקו את המכסה בזהירות בצד, קלפו את סרט המגן והניחו אותו בקן המכסה כשהצד הדביק כלפי מעלה. כעת, לחץ כלפי מטה על הידית כדי לפתוח את המהדק, וטען בזהירות את השבב לקן השבבים.לאחר מכן, הכניסו להב טעינה חדש למעמיס. דחוף אותו בעדינות כדי לוודא שהוא יציב במקומו. כעת, העבירו 14.5 מיקרוליטר של תערובת תגובה ללהב הטעינה.אין ליצור בועות אוויר ואל תסיט את הלהב. לאחר מכן, לחץ על כפתור הטעינה השחור כדי להפיץ את עוצמת הקול על השבב. חשוב לוודא שלהב הטעינה נמצא במקומו.לאחר מכן, בזמן מילוי הלהב, אל תלחץ על הפיפטה עד לתחנה השנייה, כדי למנוע הכנסת בועות. כמו כן, אל תסיט את הלהב עם הקצה. המשך על ידי שימוש במזרק כדי להעביר כ-20 טיפות נוזל טבילה על משטח השבב.הקפד לא לגעת במשטח עם הקצה, ולכסות לחלוטין את המשטח מבלי להציף אותו. לאחר מכן, סובב את זרוע המעמיס כדי לגרום למכסה לבוא במגע עם השבב ולחץ כלפי מטה למשך 15 שניות. לאחר מכן, לחץ על כפתור המכסה כדי לשחרר את השבב, והחזר את זרוע המעמיס למצב מנוחה.כעת, פתח את המהדק והחזק את השבב המורכב בזווית של 45 מעלות כדי להוציא בזהירות את נוזל הטבילה דרך יציאת המילוי באמצעות מזרק. לאחר מכן, סובב מעט את השבב כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן הסר את כל הנוזלים העודפים בעזרת מגבון סטרילי. הימנע משפיכת נוזל טבילה על גבול השבב.אם זה קורה, הסר בזהירות עודפים לפני האיטום. לבסוף, אטום את מארז השבבים על ידי קילוף עדין של התווית שעל המכסה, ולאחר מכן חסימת יציאת המילוי למשך חמש שניות לפחות. כעת, השתמש בשבב תוך שעתיים, ועד אז, אחסן אותו בחושך.כדי להגדיר את התגובה, פתח את המכסה והתקן את המתאמים בשני הבלוקים, גם כאשר משתמשים בבלוק בודד. לאחר מכן, הנח שבב על בלוקי הדגימה וכוון את יציאות המילוי שלו לכיוון החלק הקדמי של המחזור התרמי, והרם מעט את היציאה. השתמש באסימונים ריקים כדי לאזן את שני הבלוקים.לאחר מכן, הנח את הכרית התרמית מעל ההתקנה כדי לכסות לחלוטין את השבבים. לאחר מכן, תכנת את המחזורים, סגור את המכסה והתחל את התגובה. בסיום התגובה, כבה את המחזור התרמי, הסר את הרפידות התרמיות ולאחר מכן הסר את השבבים.תנו לצ'יפס להפשיר לטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות בחושך, ונתחו אותם תוך שעה. נקה את משטח השבב עם איזופרופנול תוך כדי בדיקתם לאיתור נזילות או בעיות אחרות. כדי לשמור את הנתונים, הכנס מקל זיכרון USB למערכת הגלאי, שם ניתן לשמור את הנתונים.לאחר מכן, פתח את מגש השבבים של מערכת הגלאים וטען את השבב עם הפנים כלפי מעלה. סגור את המגש והמתן 30 שניות לעיבוד הנתונים. לאחר מכן, הסר את השבב וחזור על התהליך עבור השבב הבא.לאחר מכן, העבר את מקל ה- USB מהגלאי למחשב והעבר את הקבצים. פתח את התוכנה מבוססת הענן, ולאחר מכן צור פרויקט וייבא את כל קבצי הנתונים עבור השבבים המעניינים. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה הגדרת שבבים, בחר את הצבע והבדיקה שבהם נעשה שימוש.קבע אם השבב מקובל על-ידי הצגתו באופן חזותי בכרטיסיה סקירת נתונים. אם הדגימה נטענה היטב, לפחות 13,000 נקודות צריכות להיות שמישות. לאחר מכן, התבונן בעלילת הפיזור עבור השבב שנבחר.שם, החל סף המוגדר לפי סוג הבדיקה. עבור אות צבע מדווח פלואורסצאין אמידיט השתמש בסף של 6,000. כעת, הסר את כל האותות המפוקפקים שעלולים לגרום לתוצאות חיוביות כוזבות.בחרו בנקודה המפוקפקת בתרשים הפיזור בעזרת הכלי לאסו, ובחרו באפשרות Undetermined. כל הכתמים החיוביים הנותרים מצביעים על נוכחות של עותקי cDNA של המטרה הנדירה שנותחה. באמצעות ההליך המוצג כאן, בדקנו את הביטוי של גרסת התעתיק הנדירה CDH1a ברקמות קפואות טריות בקיבה.אם לשבב היו בועות מרובות, בועה אחת גדולה, או פחות מ-13,000 נקודות נתונים, הוא הושמט מהניתוח. לא היו אותות חיוביים מעל הסף שנבחר של 6,000 עבור ערוץ FAM בפקד ללא תבנית. הנקודות הצהובות אינן מציינות הגברה.ניתוח שבב עדין סינן את נקודות הנתונים באיכות נמוכה וביטל את הסיכון לתוצאות מעורפלות. כאשר אותר אות כחול, המציין הגברה, אם הוא היה ממש בגבולות השבב או סביב בועות, האות הושמט. באופן דומה, כדי למנוע עוד יותר את הסיכון לתוצאות חיוביות כוזבות, סביר להניח שאותות מעל סף ה-FAM שנבחר ובקצה הימני של העלילה היו לא ספציפיים וגם סוננו החוצה.נותחו 21 דגימות תקינות ורקמות סרטניות מזווגות ו-11 דגימות גידול נוספות. בסך הכל, התעתיק הנדיר CDH1a היה ניתן לזיהוי ב-15 מתוך 32 גידולים. לעומת זאת, אף אחת מ-21 דגימות רקמת הביקורת לא הראתה נוכחות של תעתיק נדיר זה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות וריאנט תעתיק נדיר ברקמות קפואות טריות על ידי PCR דיגיטלי מבוסס שבב. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש עד שמונה שעות, תלוי במספר הדגימות, אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטעון במדויק את הדגימה לתוך הלהב.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האבחון המולקולרי לחקור וריאנטים נדירים של רצף בחולי סרטן.

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים את התועלת של PCR דיגיטלי בפורמט שבב בצינור לזיהוי וריאציות נוקלאוטידים בודדים בדגימות DNA. תגובת PCR יחידה מחולקת לחדרים הפועלים כתגובות PCR עצמאיות, וזיהוי אותות פלואורסצנטיים מהמטרות המוגברות בתאים משמש לחישוב תדירות האלל המשתנה בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב בצינור לכימות גרסאות נוקלאוטידים בודדים

סרטון זה מדגים PCR דיגיטלי מבוסס שבב — וריאציה של טכניקת ה-PCR הדיגיטלית השימושית בזיהוי גרסאות תמלול נדירות. תגובת ה- PCR מחולקת לחדרים של שבב ננופלואידי, שכל אחד מהם פועל כתגובה עצמאית. זיהוי אותות פלואורסצנטיים מהתאים עם מטרות מוגברות מאשר את נוכחותם של וריאנטים נדירים של תעתיק בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב לזיהוי וריאנטים נדירים של תעתיק באמצעות שבב ננופלואידי

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (PCR) הוא כלי שימושי עבור גילוי רגישות גבוהה של נוקלאוטיד יחיד גרסאות ו- DNA עותק מספר גרסאות. . הנה, נדגים שיקולים מרכזיים למדידת גרסאות נדיר הגנום האנושי באמצעות PCR דיגיטלי עם התבנית שבב-ב--שפופרת.

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

כאן מוצג פרוטוקול שבו משולבים כלים ביואינפורמטיים מרובים כדי לחקור את הפונקציות הביולוגיות של TMEM200A בסרטן. בנוסף, אנו גם מאמתים באופן ניסיוני את תחזיות הביואינפורמטיקה.

ניתוח מולטיומיקס של TMEM200A כסמן ביולוגי פאן-סרטני

פרוטוקול זה מציע הליכי מעבדה הוליסטיים הנדרשים לאיתור פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בדגימות סרטן קיבה המבוססים על פלטפורמת ריצוף מוליכים למחצה של יונים. רצפי היעד, מתאמי קשירה, הגברה וטיהור ספרייה וקריטריונים לבקרת איכות מתוארים גם הם בפירוט.

זיהוי פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד רב-גני בסרטן קיבה המבוסס על פלטפורמת ריצוף מוליכים למחצה של יון

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

פרוטוקול זה מתאר את התפתחות במבחנה האנושי פרה מודל של osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי עם שורות תאים של סרטן השד כדי לחקות את האינטראקציה תא-אוסטאוקלסט סרטן. המודל יכול לשמש כדי לקדם את ההבנה שלנו של עצם היווצרות גרורות ולשפר את אפשרויות טיפוליות.

התפתחות מודל פרה האנושית של Osteoclastogenesis של דם היקפיים ומונוציטים תרבותי משותף עם שורות תאים של סרטן השד

למדו לזהות וריאנט תעתיק נדיר של CDH1 בסרטן קיבה באמצעות שבב דיגיטלי PCR. שיטה זו משפרת רגישות ודיוק בזיהוי מולקולות cDNA בדגימות רקמה מוקפאות.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

גלה סרטונים נוספים