Name: הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: חקור את תפקוד השלפוחיות החוץ-תאיות המופרשות מתאי דם אדומים נגועים בטפיל המלריה Plasmodium falciparum. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על תקשורת טפיל-מארח ואת תפקיד ה-RNA הווזיקולרי ברגולציה של תאי אנדותל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך בחלקה על ידי קרן נוברטיס רפואי - ואת המחקר הביולוגי (כדי פים), של גוטפריד, יוליה Bangerter-Rhyner-Stiftung (ל MW, פים) של הבריכה מחקר של האוניברסיטה של פריבורג (כדי פים). מענקים נוספים כוללים המלגות מצוינות הממשלה השוויצרית עבור חוקרים זרים (כדי KAB ו- SM). אנו מודים איזבל Fellay, הס Kharoubi סולנג לקבלת תמיכה טכנית.

RBCs האנושי התקבלו מהדם של תורמים בריא, בהתאם להנחיות של Swissethics (swissethics.ch).
הערה: תרבויות טפיל falciparum פ (3D 7) ו- EV הייצור היו שתואר קודם לכן ב- Mbagwu, et al. 11 מכיוון falciparum פ פתוגניות, להתייעץ עם התקנות מקומיות לטיפול. התרבויות יש לשמור עקר את כל הזמן.
1. זריחה תיוג של EVs
הערה: ההליך הבא מנצל הטכנולוגיה תיוג stably לשלב צבע ירוק פלואורסצנטי (PKH67) עם זנבות אליפטיות גדול באזור השומנים של קרום EV. התגובה מתבצע ב- µL 200 הסופי מכתימה את אמצעי האחסון המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרומטר של PKH67. לבצע את כל הצעדים בטמפרטורת החדר (20-25 ° C)
<ol><li>המקום 100 µg של EVs ב 1 מ"ל של PBS צינור microcentrifuge.</li>
	<li>Centrifuge של EVs צינור microcentrifuge במהירות המרבית (20,000 x g) במשך 7 דקות כדי גלולה. הערה: מאחר הימוזוין נוכח EVs, גלולה חום אדום-כהה להתייחס. אם תגובת שיקוע אדמדם, ואז EVs יש lysed.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, וארוקן את תגובת שיקוע בקפידה, על מנת למנוע הסרת כל EVs. הערה: למזער את כמות מתנה בעבר resuspending EVs בדו diluent על מנת להגדיל הפארמצבטית והיעילות של ההכתמה הנותרים מאגר.</li>
	<li>Resuspend בגדר EV ב 100 µL של diluent C (2 X ההשעיה EV), pipet בעדינות כדי להבטיח פיזור מלאה.</li>
	<li>הכן צינור microcentrifuge ולהוסיף 4 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 µL 100 של diluent ג מערבולת טוב לערבב. להכין 2 x צבע פתרון זה (40 מיקרומטר) מייד לפני צביעת. הערה: כדי להימנע מכתים הטרוגנית, אל תוסיף הפתרון צבע ethanolic PKH67 ישירות בגדר EV.</li>
	<li>במהירות, משלבים את µL 100 של 2 X EV ההשעיה (שלב 1.4) µL 100 של 2 X צבע פתרון (שלב 1.5). לאחר מכן, מערבבים את הדגימה על-ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים.</li>
	<li>דגירה ההשעיה EV/צבע מהשלב 1.6 עבור 5 דקות מוגן מפני האור ואת תערובת מאת vortexing 3 - 4 פעמים במהלך 5 דקות. הערה: המקננת ההשעיה EV/צבע משכי זמן ארוכים יותר מספק אין יתרון, כי ההכתמה היא כה מהירה.</li>
	<li>עוצרים את התגובה צביעת על-ידי הוספת אמצעי שווה (200 µL) של נסיוב, תקופת דגירה של 1 דקות לאפשר קשירה של עודף צבע. הערה: לפני העצירה ההכתמה, לרוקן את הסרום של EVs על ידי צנטריפוגה-g x 20,000 עבור 20 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBS, ספין למטה ב- g 20,000 x עבור 5 דק Resuspend של EVs ב 100 µL ל- PBS להגיע ריכוז הסופי של µg 1/µL.</li>
</ol>2. לדמיין את ספיגת של EVs מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית
הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את המעקב אחר EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל גדל על coverslips זכוכית דקה. תאי אנדותל הם תאי אנדותל מח עצם אדם למחצה immortalized כמתואר ב-12.
<ol><li>עבודה בסביבה סטרילית, מעיל coverslips עם עודף של 0.01% פולי-L-ליזין 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>האחות הפתרון פולי-L-ליזין ולאפשר את coverslips להתייבש לגמרי.</li>
	<li>לבצע ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות Trypan blue הדרה של hemocytometer.</li>
	<li>העברת תאי אנדותל5 עונה 1 פרק 10 ב 1 מ"ל של שלמה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את שילוב תוספת coverslips זכוכית אקרילית-L-ליזין-מצופה ולתת את התאים לגדול טפט. הערה: המדיום מכיל חומרים שמאפשרים לתאים כדי ליצור טפט וכדי ליצור צמתי צר.</li>
	<li>ברגע התאים יוצרים של טפט, בזהירות תשאף המדיום ולהוסיף 1 מ"ל בינוני טריים לשטוף את התאים. חזור על לשטוף את פעם נוספת. הוסף µg 50 של EVs התווית על-ידי PKH67, דגירה במשך 4 שעות. הערה: כדי למצוא את נקודת-הזמן אופטימלי עבור ספיגת, זמן-קורס יכול להתבצע.</li>
	<li>לאחר 4 שעות, תשאף המדיום, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS להסיר EVs עודף והלא מאוגדים. לתקן את התאים עם 3% paraformaldehyde פתרון PBS למשך 15 דקות. הערה: מתנול יכול לשבש אקטין במהלך תהליך קיבוע; לכן, עדיף להימנע כל מתנול המכיל כתות ומייצבים או כתות אחרות ממס מבוסס ומייצבים. מומלץ לשימוש ללא מתנול פורמלדהיד מקבע.</li>
	<li>לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. להוסיף בזהירות 250 µL של 0.1% X-100 Triton ב- PBS כדי permeabilize את התאים. דגירה-RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBS. להוסיף 400 µL מאגר חסימה (BSA 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- RT לחסום את הכריכה לא ספציפית.</li>
	<li>לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS. הכן את הפתרון מכתימים על ידי המדללת 5 µL של הפתרון phalloidin מניות ב- BSA PBS/1% µL 200 לכל שובר כל כיסוי. Pipet 200 µL של הפתרון מכתימים על coverslip דגירה במשך 20 דקות ב- RT.</li>
	<li>לשטוף 3 פעמים עם PBS. Counterstain ה-DNA ל 30 s עם Hoechst 33342-ריכוז הסופי של µg/mL 2 ב- µL 200 ל- PBS.</li>
	<li>לשטוף 2 x coverslip על-ידי הוספת µL 400 ל- PBS. בזהירות לתפוס את coverslip עם מלקחיים, היפוך זה על ירידה של antifade הרכבה מדיה על משטח זכוכית. מסיר בעדינות את המדיה עודף עם רקמה, חותם בכל צד עם לק.</li>
	<li>לאחסן את השקופיות מוגן מפני האור ב 4 º C.</li>
	<li>דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לייזר excitations 405, 488, 543 nm ו 63 X, המטרה שמן נה 1.3 עם פליטת פלורסנט-450-470 nm (כחול), 505-530 ננומטר (ירוק), 620 ננומטר. הערה: תוצאות צביעת F טיפוסי-אקטין מוצגות באיור1.</li>
</ol>3. חדירות תא אנדותל
הערה: תא אנדותל חדירות מוערך על ידי מדידת ההעברה של rhodamine B isothiocyanate-לתוספי (70,000 MW הממוצע) מעבר חד שכבתי תאי אנדותל. לתוספי מספק כלי מצוין ללמוד חדירות כלי דם.
<ol><li>ספירת תאי אנדותל קיימא באמצעות הדרה Trypan blue 0.4% ו- hemocytometer.</li>
	<li>צלחת תאי אנדותל-צפיפות של 0.6 x5 10, לתאים הנהרות תרביות רקמה 24-ובכן מוסיף (0.4 µm גודל הנקבוביות) ואת השאר ללא הפרעה במשך לפחות 5 ימים ליצור monolayers הבדיל. רענן המדיום בכל יום שני.</li>
	<li>ברגע התאים להגיע עם טפט, לטעון את EVs (50 µg ב 1 מ"ל) על התא העליון. הוסף את rhodamine-לתוספי הבאר העליון-ריכוז סופי של 20 מ"ג/מ"ל. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לפקח על העברת לתוספי פלורסנט לתחתית היטב על ידי מדידת פליטת קרינה פלואורסצנטית מ 40 µL aliquots בינונית. להגדיר את הקורא מרובה-תוויות microplate 544 עירור nm ו 590 פליטה nm למדידות. הערה: מכמות לתוספי כשמאירים ניתן לכמת באמצעות עקומות כיול נוסדה עם הפתרון מניות. בנוסף, ניסויים קינטי יכולה להתבצע על-ידי הסרת דגימות קטנות של המדיום קאמרית החיצוני במהלך הזמן (איור 2). אפילו ללא כל טיפול, לתוספי מפוזרת באמצעות טפט התא.</li>
</ol>4. לקבוע רגישות Puromycin
הערה: לפני transducing את שורות תאים עם lentivirus, חשוב לקבוע העקומה kill של תרופה שנבחרה עבור הקו לתא מסוים זה. כדי לקבוע את הכמות המינימלית של ריכוז התרופה הכרחי להרוג את כל התאים, לבצע ניסוי תגובה מינון באמצעות מינונים מצטברים של הסם הנבחר. כי כל שורה בתרבית של תאים יש רגישות שונה, לפני ניסויים, ריכוז אופטימלי של האנטיביוטיקה צריך להיקבע על ידי פיתוח להרוג עקומת טיטרציה כפי שיפורט להלן.
<ol><li>לספור את התאים באמצעות את hemocytometer. Resuspend תאי אנדותל-ריכוז של עונה 1 פרק 105 תאים/מ ל מלאה אנדותל תא מדיום הגידול המכיל את התמהיל תוספת.</li>
	<li>צלחת עונה 1 פרק 104 תאים לתוך צלחת 96-ובכן באמצעי אחסון הסופי של 100 µL של המדיום צמיחת תאי אנדותל.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של המדיום המכיל את האנטיביוטיקה בריכוז של 0.1-10 µg/mL (ראה איור 3).</li>
	<li>לבחון את הכדאיות תא כל יומיים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות מטרה X 20. התרבות התאים במשך 10-14 ימים ולהחליף שהמדיה המכילה puromycin כל 2-3 ימים בהתאם צמיחת תאים.</li>
	<li>להוסיף 10 µL/טוב MTS ריאגנט לבאר כל, מיקס, ולאחר תקופת דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים סטנדרטיים תרבות.</li>
	<li>לנער את הצלחת בקצרה על מטרף ולמדוד את ספיגת תאים טיפול ללא טיפול שימוש בקורא צלחת 490 nm (איור 3).</li>
</ol>5. התמרה חושית של תאי אנדותל עם וקטור Lentiviral
<ol><li>צלחת עונה 1 פרק 10 תאי אנדותל5 ב 1 מ"ל של מדיום מלאה ביום שלפני התמרה חושית. לבצע התמרה חושית כאשר התאים הגיעו 50-80% confluency.</li>
	<li>להפשיר את lentivirus על הקרח, ולעשות aliquots של המניות ויראלי להימנע מחזורים ההקפאה-הפשרה. ספין למטה החומר ב 200 x g עבור 30 s, צינורות לפני פתיחת להימנע לשפוך מעל.</li>
	<li>להוסיף hexadimethrine ברומיד התאים-ריכוז סופי של 8 µg/mL. הערה: Hexadimethrine ברומיד מסייע את היעילות התמרה חושית, אולם במקרים מסוימים זה יכול להיות רעיל לתאים. לכן, ריכוז אופטימלי צריך להיקבע על-ידי ביצוע עיקול הרג לפני התמרה חושית.</li>
	<li>מערבולת את הצלחת בעדינות כדי לערבב. להוסיף את הכמות המתאימה של נגיפים (בין 0.5-2 x 106 חלקיקים)-ריבוי מתאים לזיהום (MOI) ו מערבולת את הצלחת בעדינות ב-30 s לערבב.</li>
	<li>Centrifuge את המיקס חלקיק תא-נגיפים בצנטריפוגה ב RT למשך 45 דקות ב- g 300 x כדי להגביר את היעילות התמרה חושית. דגירה התערובת חלקיק תא-נגיפים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>הסר בזהירות המדיום המכיל חלקיקים נגיפיים וזורקים כראוי. להחליף אותו טרי, מראש ומחוממת בינוני תרבות שלמה.</li>
	<li>להפעיל את הבחירה עם puromycin ביום השני: להסיר את המדיום ולהחליפו בינוני טריים המכילים את הריכוז הנכון של puromycin כפי שנקבע בעבר בסעיף 4 (איור 3).</li>
	<li>קציר תאים לאחר הבחירה puromycin, לבודד RNA באמצעות של RNA לבודד ערכת ההוראות של היצרן.</li>
	<li>לבצע סינתזה cDNA עם הנבחר miRNAs באמצעות תיעוד הפוכה קיט (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
	<li>להגדיר את התגובה qPCR לפי פרוטוקול מצוטט13.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11832955">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li>
<li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li>
<li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
<li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%3A+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li>
<li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port%3A+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+clinical+features%2C+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li>
<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כמה טפילים, לרבות Toxoplasma, Trypanosoma, לישמניה Trichomonas לעורר על שחרורו של EVs התא המארח נגועים. בהתאם פתוגנים, EVs שפורסמו ניתן לווסת את התגובה החיסונית מארח או לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים6. ובכל זאת, יש מעט עדויות רומז כיצד אלה שלפוחית קטנה לתרום מחלת המלריה. . הנה, שתיארנו במספר דרכים כדי לחקור את הפונקציה של EVs במהלך זיהום הפלזמודיום . למשל, תפיסה של EVs על ידי תאים הנמען ויוו ניתן לנטר ביעילות על ידי תיוג אותם עם תיוג הפלורסנט PKH67. מספר פקדים חייב להתבצע כדי לה...

על פי ארגון הבריאות העולמי, היו 212 מיליון מקרים חדשים של מלריה ברחבי העולם בשנת 2015, כ 429,000 אנשים מתו, בעיקר ילדים מתחת לגיל חמש שנים של גיל1. המנגנונים למחלות חמורות, אשר מזוהה לעתים קרובות עם חוסר תפקוד כלי הדם, נותר מעורפל2. הפלזמודיום- iRBCs מפרישים כדורים קטנים bi-השומנים קרום המכונה שלפוחית חוץ-תאית (EVs). זה ידוע כי אלה EVs שעשוי להיות רלוונטי לתהליך זיהום וכדי התגובה החיסונית מארח לזיהום; עם זאת, מעט מאוד ידוע על הפונקציה המדויק של אלה שלפוחית קטנה במהלך מלריה זיהום3. זה אפשרי כי הם משחקים שני תפקידים חשובים: מצד אחד, הם עשויים לתרום בפתוגנזה על ידי הפעלת מקרופאגים4,5; מצד שני, הם עשויים לתווך תקשורת סלולרית בין טפילים ובין טפילים מארח6,7. למעשה, טפילים יכולים להעביר חלבונים או חומצות גרעין בין אחד לשני דרך EVs. לדוגמה, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs יכול להעביר התקפה אלימה פקטור Serum Resistance-Associated (ההזמנות) ולאחר ניתן לייעד אריתרוציטים גם אחרים brucei טי וגם מארח8. יתר על כן, falciparum פ- iRBCs תקשורת בין אחד לשני על ידי העברת חומצות גרעין בתוך EVs. דבר זה מאפשר הטפילים למטב ולסנכרן את הצמיחה שלה. למעשה, EVs עשוי להיות הרגולטורים העיקריים של המרה gametocyte, לכן לתרום ברגולציה של שידור שלב7.
לא רק לעשות EVs לווסת הטפילים, הם גם לתווך טפיל-פונדקאי אינטראקציות. לאחרונה גילינו כי EVs מ iRBCs מכילים מארח-derived מיקרו Rna (miRNAs; מינים RNA קטנים בטווח של 21-25 נוקלאוטידים9) שנלקחו על ידי תאי אנדותל אדם. MiRNAs ב- EVs טופס אורווה מורכבים עם Ago2 (חבר של RNA-induced שתיקת מורכבים), אשר ברגע מועברת לתאי הנמען, הוא מסוגל במיוחד ביטוי גנים ואף להשפיע על מכשול מאפייני תאים10. פרוטוקולים סטנדרטיים פותחו כדי לחקור את הפונקציה של EVs. כאן, נתאר תחילה פרוטוקול המאפשר תיוג פלורסנט של EVs לחקור ספיגת שלהם על ידי תאים הנמען. בנוסף, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, אפשרי לעקוב אחר גורלם של EV בתוך התא. מספר צבעי פלורסנט יכול לשמש כדי לעקוב אחר EVs. לצבוע אמין-ריאקטיבי, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE), Calcein-אם הופכים פלורסנט פעם אחת בתוך השלפוחיות המוגלתיות. אנחנו מעדיפים להשתמש בתווית amphiphilic, PKH, כי זה נותן אות אחיד יותר ויותר בהיר. גישה זו מספקת מידע חשוב להבין את האינטראקציות בין EVs ותאים הנמען. אמנם במקרים מסוימים EVs לאגד פני השטח של התאים, יש שלפוחית נלקחים במהירות. על תפיסה, EVs להעביר מטענים שלהם התאים, שבהם הם מפעילים את הפונקציות התקינה שלהם.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי למדוד את הפונקציה מכשול של ה תאי אנדותל במבחנה על ידי לכימות בהעברת לתוספי פלורסנט דרך טפט הסלולר. ניתן להשתמש המשדרים יותר רגישים כגון סמני radiolabeled. עם זאת, הם דורשים זהירות מיוחדת לשימוש. מבחני אחרים קיימים כדי למדוד את הפונקציה מכשול במבחנה כגון transendothelial ההתנגדות החשמלית (TEER), אשר מודד צמוד לצומת שלמות. סוף סוף להמחיש זואי-1, חלבון צמוד לצומת, על-ידי immunofluorescence מאפשרת הערכה של שלמות צומת חזק כמו גם10. מאז EVs הם ישויות הטרוגנית ומורכבת המכיל מספר מטענים עם פוטנציאל מאפיין רגולטוריות, זה שימושי כדי overexpress של RNA ספציפיים כדי לחקור את השפעתו על התא הנמען. לכן, אנחנו גם להגדיר פרוטוקול אשר מטרתה ליצור שורות תאים יציב לבטא את miRNA של ריבית10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 ירוק פלואורסצנטי תא מקשר מיני ערכת</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>מדלל C</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>פלואידין CF594</td><td>ביוטיום</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong זהב אנטיפייד הרכבה</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>רודמין B isothiocyanate&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>הכנס עם קרום PET בז שקוף&nbsp; לצלחת 24 בארות</td><td>פלקון</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>צמיחת תאי אנדותל&nbsp; בינוני MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS התפשטות תאים ערכת בדיקה קולורימטרית</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Human has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, בקרה שלילית 1 חלקיקי התמרה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך 1000 תגובות</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, עם UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

מלריה היא מחלה מסכנת חיים הנגרמת על ידי טפילים הפלזמודיום , עם falciparum פ להיות הכי נפוצים ביבשת אפריקה, רוב מקרי מוות הקשורים מלריה ברחבי העולם. מספר גורמים, לרבות טפיל פחמיות רקמות בתפקוד כלי הדם, תגובות דלקתיות להשפיע על התפתחות המחלה אצל אנשים נגועים במלריה. פ falciparum-תאי דם אדומים (iRBCs) נגוע לשחרר שלפוחית קטנה חוץ-תאית (EVs) המכילים סוגים שונים של מולקולות מטען המתווכות פתוגנזה ו סלולר תקשורת בין טפילים של המארח. EVs ביעילות שנלקחה על ידי תאים שבהם הם לווסת את תפקידם. כאן נדון אסטרטגיות כדי לטפל את התפקיד של EVs באינטראקציות טפיל-פונדקאי. ראשית, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור תיוג ומעקב EV הפנמה על-ידי תאי אנדותל, באמצעות צבע מקשר תא ירוק. שנית, מדווחים דרך פשוטה כדי למדוד את חדירות מעבר חד שכבתי תאי אנדותל באמצעות לתוספי שכותרתו fluorescently. לבסוף, אנו מראים כיצד לחקור את התפקיד של לא קידוד RNA מולקולות קטנות בתפקוד תאי אנדותל.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים לחקור את האינטראקציות של EVs עם התאים המארחים. ספיגת של EVs fluorescently שכותרתו נמצא בפיקוח מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1). תאי אנדותל תופסים ביעילות EVs, אולם ניתן למטב את זמן הדגירה עם EVs כדי לעקוב אחר תפיסה. עבור לוקליזציה טוב יותר של EVs בתוך התאים, כתם אקטין עם phalloidin. בשלב הבא, אנו משתמשים קרום מסנן ובנוסף צומח טפט של תאי אנדותל. Rhodamine B isothiocyanate-לתוספי מוחל על התא העליון של קרום מסנן, ואז החדירות של טפט א...

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד השלפוחיות החוץ-תאיות המשתחררות על ידי תאי הדם האדומים הנגועים בטפיל המלריה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי המלריה, כגון כיצד הטפילים מווסתים את התקשורת בין הטפיל למארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה של ארביטאז' שלפוחית על ידי תאי אינדוטרוט תחת חקר התפקוד הרגולטורי של ה-RNA השלפוחית על ידי תאי אינדוטרו.ידגימו את ההליך מיה אלונדז, סמרטין באגו ובאיו באבטונדה, כולם סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. בצינור מיקרו-צנטריפוגה מוסיפים 100 מיקרוגרם של שלפוחיות חוץ-תאיות ומיליליטר אחד של מי מלח חוצצים פוספט. לאחר מכן צנטריפוגה את השלפוחיות החוץ-תאיות במהירות מקסימלית של 20,000 פעמים גרם למשך שבע דקות ליצירת כדור.לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן ממיסים את גלולת השלפוחית החוץ-תאית ב -100 מיקרוליטר דילומט C.To להבטיח ערבוב מלא של פיפטה מספר פעמים. לאחר מכן, בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש, הוסף ארבעה מיקרוליטר של תמיסת הצבע האתנולית PKH67 ל -100 מיקרוליטר של דילמנט C. ואז מערבל היטב את התערובת.הכן את תמיסת הצבע 40 מיקרומולר 2XPKH67 רגע לפני תהליך הצביעה. לאחר מכן שלב במהירות 100 מיקרוליטר של שני x תרחיף שלפוחית חוץ-תאית עם נפח שווה של תמיסת הצבע האתנולית PKH67. לאחר מכן פיפטה את התערובת 10 פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון.לאחר ערבוב מלא, דגרו על תמיסת השלפוחית החוץ-תאית ותמיסת הצבע האתנולית PKH67 למשך חמש דקות הרחק מהאור. במהלך הדגירה, המשיכו לערבב את התערובת שלוש עד ארבע פעמים. כדי לעצור את תגובת הצביעה, הוסיפו לתערובת 200 מיקרוליטר סרום ודגרו למשך דקה כדי שעודפי הצבע ייקשרו.לאחר מכן, שטפו את השלפוחיות החוץ-תאיות עם מי מלח עם פוספט שלוש פעמים. לאחר הכביסה, צנטריפוגה את הדגימה ב -20, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן ממיסים את הגלולה השלפוחית החוץ-תאית ב-100 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר.העבר את תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום גידול תאי אנדותל שלם לכיסוי מצופה פולי-אליטן. אפשר לתאים לגדל שכבה אחת על החלקת הכיסוי. לאחר היווצרות החד-שכבה, הסר את המדיום בזהירות והוסף מיליליטר אחד של מדיום טרי כדי לשטוף את התאים פעמיים.לאחר מכן הוסף 50 מיקרוגרם של שלפוחיות חוץ-תאיות מוכתמות PKH67 להחלקת הכיסוי ודגירה למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה יש לשאוב את המדיום. כדי להסיר את כל השלפוחיות החוץ-תאיות הלא קשורות, שטפו את התאים במי מלח חוצצים פוספט שלוש פעמים.יש לנקוט בזהירות רבה במהלך מניפולציה מכתים של החלקות הכיסוי באמצעות מלקחיים עדינים כדי למנוע אובדן תאים ושבירת החלקת הכיסוי. לאחר הכביסה, השתמש בשלושה אחוזים של תמיסת פרפורמלדהיד במי מלח חוצצים פוספט כדי לתקן את התאים למשך 15 דקות. שוב, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים והוסיפו 250 מיקרוליטר של 0.1 אחוז טריטן x 100 במי מלח עם פוספט כדי לחלחל לתאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר מכן, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים והוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לתאים. לאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שלושים דקות כדי למנוע קשירה לא ספציפית. לאחר החסימה יש לשטוף את התאים פעם אחת עם מי מלח עם פוספט.לאחר מכן יש לדלל חמישה מיקרוליטר של תמיסת מלאי פאלואידן ב-200 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט עם אלבומין סרום בקר אחד כדי להכין את תמיסת הצביעה לכל החלקת כיסוי. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה על החלקת הכיסוי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר סיום הדגירה, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים.לאחר מכן השתמש בריכוז הסופי של שני מיקרוגרם למיליליטר של 3342 מחובר ב-200 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט כדי להכתים את ה-DNA למשך 30 שניות. לאחר הצביעה, הוסף 400 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט כדי לשטוף את החלקת הכיסוי פעמיים. לאחר מכן הרם בזהירות את החלקת הכיסוי בעזרת מלקחיים והפוך אותה על גבי טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה על מגלשת זכוכית.השתמש בממחטת נייר כדי להסיר בעדינות את כל החומר העודף ולאחר מכן אטום את הסביבה עם לק. כמו כן, יש להקפיד מאוד לא לחשוף את התאים ליותר מדי צבע במהלך המיקרוסקופיה כדי למנוע הלבנת תאים. בתוספת תרבית רקמה של 24 בארות עם גודל מזיגה של 0.4 מיקרו-מולרי, תאי אנדותל זרעים.לאחר מכן הניחו לתאים לגדול בתרבית במשך חמישה ימים מבלי שיפריעו להם ליצור שכבה חד-שכבתית מובחנת. המשיכו להחליף את המדיום כל יומיים. לאחר שנוצרה השכבה החד-שכבתית, זרעו 50 מיקרוגרם במיליליטר אחד של שלפוחיות חוץ-תאיות בתא העליון.לאחר מכן הוסיפו 20 מיליגרם למיליליטר של דקסטרן רוטומין לבאר העליונה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. עקוב אחר נדידת הדקסטרן הפלואורסצנטי לתחתית הבאר על ידי מדידת משימת הפלואורסצנטיות מ-40 מיקרוליטר של תווך בינוני. לאחר מכן תכנת את אורך גל העירור ב-544 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ב-590 ננומטר עבור קורא מיקרו-צלחות מרובה תוויות.השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים. לאחר מכן השעו מחדש את תאי האנדותל במדיום תרבית אנדותל שלם וזרעו את התאים בצלחת של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול תאי אנדותל. כדי להשיג ריכוז של 0.1 עד עשרה מיקרוגרם למיליליטר הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום המכיל אנטיביוטיקה.עקוב אחר כדאיות התאים כל יומיים באמצעות מטרה פי 20 תחת מיקרוסקופ אור. המשיכו לתרבית התאים במשך 10 עד 14 ימים נוספים והחליפו את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל יומיים-שלושה, תלוי בגדילת התאים. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב MTS בכל באר וערבב את המגיב.דגרו על צלחת 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מערבבים לזמן קצר את הצלחת על שייקר. לאחר מכן קרא את הסופגים של התאים המטופלים והלא מטופלים באמצעות קורא צלחות ב-490 ננומטר.יום אחד לפני ההתמרה הלנטיויראלית, זרעו את תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום שלם. המתן עד שהתאים יגיעו למפגש של 50 עד 80 אחוז עבור התמרה לנטי-ויראלית לפני פתיחת הצינור, סובב את התרחיף הלנטי-ויראלי ב-200 פעמים גרם למשך 30 שניות כדי למנוע זליכה. לאחר מכן הוסיפו את הקסידימתרין ברומיד לתאים כדי להתאים לריכוז סופי של שמונה מיקרוגרם למיליליטר וסובבו בעדינות את הצלחת.הוסף את נגיף הלנטי לתאים ושוב סובב את הצלחת בעדינות למשך 30 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון. כדי להגביר את יעילות ההתמרה הלנטי-ויראלית, צנטריפוגה את תערובת התאים-ויראלית ב-300 פעמים גרם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו על תערובת התאים-ויראלים ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.למחרת, השליכו את החלקיק הנגיפי המכיל מדיום והחליפו במדיום תרבית שלם ומחומם מראש. ביום השני, התחל בבחירת הפורומיצין. החלף את מדיום התרבות השלם במדיום המכיל פורומיצין.לאחר בחירת הפורומיצין, קצרו את התאים. בהתאם להוראות היצרן, בודד RNA מהתאים באמצעות ערכת בידוד RNA. השתמש בערכת שעתוק הפוך כדי לבודד את ה-DNA המשלים עם המיקרו-RNA שנבחרו.לאחר מכן הגדר את תגובת ה-PCR הכמותית. כדי לנטר את הפנמת השלפוחיות החוץ-תאיות על ידי תאי אנדותל, נותחו שלפוחיות ירוקות עם תווית PKH67 באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בבדיקה, פלודין והוקסט 33342, שהכתמים פועלים באדום ובכחול גרעין, בהתאמה, משמשים למעקב אחר טרנסלוקציה של השלפוחיות בתוך תאי האנדותל.תמונות קונפוקליות שהתקבלו מראות קליטה מוכנה של השלפוחיות על ידי תאי האנדותל לאחר ארבע שעות. לאחר מכן, כדי לחקור את החדירות של יכולת הדיפוזיה החד-שכבתית של תאי האנדותל של רודמין b isothyosionadedextran. בדיקה זו מראה כי דגירה של תאי האנדותל עם 50 ו-100 מיקרוגרם למיליליטר של שלפוחיות חוץ-תאיות הגדילה את חדירות האנדותל לאחר שעתיים.בתרשים, ציר ה-x מייצג את ריכוז השלפוחיות החוץ-תאיות וציר ה-y מייצג את שינויי הקפל בחדירות האנדותל הנקראים ב-590 ננומטר. לאחר מכן, כדי לקבוע את הרגישות של תאי האנדותל בטיפול בפורומיצין, שורטטה עקומת הריגה. עקומת ההרג מראה שפחות מ-0.15 מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין מספיק כדי להרוג את כל התאים.יתר על כן, כדי לקבוע את רמת הביטוי של מיקרו-RNA451a שבודד מתאי האנדותל, בוצע PCR כמותי בזמן אמת. תרשימי העמודות מראים ביטוי יתר משמעותי של תעתיק מיקרו-RNA451a כנגד הגן U6 של עוזרת הבית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הזיהומיות לחקור את תפקידו של Evs באינטראקציה עם המארח ובתקשורת התאית באמצעות העברת חומר גנטי. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לדמיין קליטת EV על ידי תאים נמענים וכיצד לחקור תפקוד RNA קטן כולל בוויסות תאי אנדותל.אל תשכח שעבודה עם טפילי המלריה ודם אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, חלוק מעבדה ועבודה מתחת למכסה מנוע סטרילי בעת ביצוע הליך זה.

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

<em&gt; במבחנה</em&gt; שיתוף זיהום דגם ללמוד<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 אינטראקציות אדם מונוציטים הנגזרות תאים ראשוניים החיסון

שיטה זו חוקרת את הפנוטיפ הצטברויות טסיות דם בתיווך...

פרוטוקול פשוט לclumping טסיות דם בתיווך של<em&gt; Plasmodium falciparum</emאריתרוציטים&gt; נגועים בסביבה מסכנה משאבים

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

פולש טפיל המלריה והמשכפל בתוך תאי דם אדומים. ההערכה מדויקת של פלישת merozoite וparasitemia לכן חיונית בהערכה במהלך הידבקות במלריה. כאן אנו מתארים זרימה cytometry פרוטוקול מבוסס למדידת הפרמטרים הללו במודל עכבר של מלריה.

בVivo ההערכה של מכרסמים Plasmodium Parasitemia וMerozoite פלישה על ידי cytometry הזרימה

קשה לשכפל הדבקה משותפת בבני אדם במבחנה. עם זאת, טפילי מלריה אנושיים ניתנים לתרבית בקלות במבחנה, כמו גם תאים חד-גרעיניים מבודדים מדם היקפי אנושי שנדבקו באופן טבעי ב-HIV. זה מספק מודל מצוין לחקר תגובות חיסוניות מוקדמות לטפילי מלריה בהקשר של הדבקה משותפת ב-HIV.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל למדידה של מערכת חיסונית למלריה בהקשר של HIV Co-זיהום

מיקרו-רנ"א אנושי עובר מאריתרוציטים מאריח לטפילי פלסמודיום פלציפרום. כאן מתוארות הטכניקות המשמשות להעברת מיקרו-רנ"א סינתטיים לאריתרוציטים מארחים ולבידוד כל ה-RNA מ-P. falciparum.  בנוסף, מאמר זה יפרט שיטה לבידוד פוליזומים ב-P. falciparum כדי לקבוע את התפוסה הריבוזומלית ואת פוטנציאל התרגום של תעתיקי טפילים.

שיטות כדי לחקור את תפקיד הרגולציה של RNA הקטן וריבוזומלי תפוסה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em

אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד תאים מיאלואידים מעור העכבר וניקוז בלוטות הלימפה לאחר הזרקה תוך עורית של Plasmodium sporozoites. ציטומטריית זרימה של תאים שנאספו מספקת בדיקה אמינה לאפיון העור וניקוז התגובה הדלקתית של בלוטות הלימפה לטפיל.

בידוד תא מיאלואידית מעור העכבר וניקוז הלימפה הצומת בעקבות החיסון תוך-עורית עם נחלש חי<em&gt; Plasmodium</em&gt; Sporozoites

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

כאן אנו מתארים שיטה חדשה כדי לעזור להבהיר את מנגנוני החסינות התאית פלסמודיום בשלב הדם של זיהום. זוהי בדיקת מבחנה המודדת הרג תאי דם אדומים נגועים על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים.

במבחנה בדיקה של הרג תאי דם אדומים נגועים בפלסמודיום על ידי לימפוציטים ציטוטוקסיים

חקור את תפקוד השלפוחיות החוץ-תאיות המופרשות מתאי דם אדומים נגועים בטפיל המלריה Plasmodium falciparum. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על תקשורת טפיל-מארח ואת תפקיד ה-RNA הווזיקולרי ברגולציה של תאי אנדותל.

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

גלה סרטונים נוספים