הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את תפקוד השלפוחיות החוץ-תאיות המשתחררות על ידי תאי הדם האדומים הנגועים בטפיל המלריה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי המלריה, כגון כיצד הטפילים מווסתים את התקשורת בין הטפיל למארח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה של ארביטאז' שלפוחית על ידי תאי אינדוטרוט תחת חקר התפקוד הרגולטורי של ה-RNA השלפוחית על ידי תאי אינדוטרו.

ידגימו את ההליך מיה אלונדז, סמרטין באגו ובאיו באבטונדה, כולם סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. בצינור מיקרו-צנטריפוגה מוסיפים 100 מיקרוגרם של שלפוחיות חוץ-תאיות ומיליליטר אחד של מי מלח חוצצים פוספט. לאחר מכן צנטריפוגה את השלפוחיות החוץ-תאיות במהירות מקסימלית של 20,000 פעמים גרם למשך שבע דקות ליצירת כדור.

לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן ממיסים את גלולת השלפוחית החוץ-תאית ב -100 מיקרוליטר דילומט C.To להבטיח ערבוב מלא של פיפטה מספר פעמים. לאחר מכן, בצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש, הוסף ארבעה מיקרוליטר של תמיסת הצבע האתנולית PKH67 ל -100 מיקרוליטר של דילמנט C. ואז מערבל היטב את התערובת.

הכן את תמיסת הצבע 40 מיקרומולר 2XPKH67 רגע לפני תהליך הצביעה. לאחר מכן שלב במהירות 100 מיקרוליטר של שני x תרחיף שלפוחית חוץ-תאית עם נפח שווה של תמיסת הצבע האתנולית PKH67. לאחר מכן פיפטה את התערובת 10 פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון.

לאחר ערבוב מלא, דגרו על תמיסת השלפוחית החוץ-תאית ותמיסת הצבע האתנולית PKH67 למשך חמש דקות הרחק מהאור. במהלך הדגירה, המשיכו לערבב את התערובת שלוש עד ארבע פעמים. כדי לעצור את תגובת הצביעה, הוסיפו לתערובת 200 מיקרוליטר סרום ודגרו למשך דקה כדי שעודפי הצבע ייקשרו.

לאחר מכן, שטפו את השלפוחיות החוץ-תאיות עם מי מלח עם פוספט שלוש פעמים. לאחר הכביסה, צנטריפוגה את הדגימה ב -20, 000 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן ממיסים את הגלולה השלפוחית החוץ-תאית ב-100 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר.

העבר את תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום גידול תאי אנדותל שלם לכיסוי מצופה פולי-אליטן. אפשר לתאים לגדל שכבה אחת על החלקת הכיסוי. לאחר היווצרות החד-שכבה, הסר את המדיום בזהירות והוסף מיליליטר אחד של מדיום טרי כדי לשטוף את התאים פעמיים.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוגרם של שלפוחיות חוץ-תאיות מוכתמות PKH67 להחלקת הכיסוי ודגירה למשך ארבע שעות. לאחר הדגירה יש לשאוב את המדיום. כדי להסיר את כל השלפוחיות החוץ-תאיות הלא קשורות, שטפו את התאים במי מלח חוצצים פוספט שלוש פעמים.

יש לנקוט בזהירות רבה במהלך מניפולציה מכתים של החלקות הכיסוי באמצעות מלקחיים עדינים כדי למנוע אובדן תאים ושבירת החלקת הכיסוי. לאחר הכביסה, השתמש בשלושה אחוזים של תמיסת פרפורמלדהיד במי מלח חוצצים פוספט כדי לתקן את התאים למשך 15 דקות. שוב, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים והוסיפו 250 מיקרוליטר של 0.1 אחוז טריטן x 100 במי מלח עם פוספט כדי לחלחל לתאים ולדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים והוסיפו 400 מיקרוליטר של חיץ חוסם לתאים. לאחר מכן דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שלושים דקות כדי למנוע קשירה לא ספציפית. לאחר החסימה יש לשטוף את התאים פעם אחת עם מי מלח עם פוספט.

לאחר מכן יש לדלל חמישה מיקרוליטר של תמיסת מלאי פאלואידן ב-200 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט עם אלבומין סרום בקר אחד כדי להכין את תמיסת הצביעה לכל החלקת כיסוי. לאחר מכן מוסיפים 200 מיקרוליטר מתמיסת הצביעה על החלקת הכיסוי ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר סיום הדגירה, שטפו את התאים במי מלח עם פוספט שלוש פעמים.

לאחר מכן השתמש בריכוז הסופי של שני מיקרוגרם למיליליטר של 3342 מחובר ב-200 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט כדי להכתים את ה-DNA למשך 30 שניות. לאחר הצביעה, הוסף 400 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט כדי לשטוף את החלקת הכיסוי פעמיים. לאחר מכן הרם בזהירות את החלקת הכיסוי בעזרת מלקחיים והפוך אותה על גבי טיפה של אמצעי הרכבה נגד דהייה על מגלשת זכוכית.

השתמש בממחטת נייר כדי להסיר בעדינות את כל החומר העודף ולאחר מכן אטום את הסביבה עם לק. כמו כן, יש להקפיד מאוד לא לחשוף את התאים ליותר מדי צבע במהלך המיקרוסקופיה כדי למנוע הלבנת תאים. בתוספת תרבית רקמה של 24 בארות עם גודל מזיגה של 0.4 מיקרו-מולרי, תאי אנדותל זרעים.

לאחר מכן הניחו לתאים לגדול בתרבית במשך חמישה ימים מבלי שיפריעו להם ליצור שכבה חד-שכבתית מובחנת. המשיכו להחליף את המדיום כל יומיים. לאחר שנוצרה השכבה החד-שכבתית, זרעו 50 מיקרוגרם במיליליטר אחד של שלפוחיות חוץ-תאיות בתא העליון.

לאחר מכן הוסיפו 20 מיליגרם למיליליטר של דקסטרן רוטומין לבאר העליונה ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. עקוב אחר נדידת הדקסטרן הפלואורסצנטי לתחתית הבאר על ידי מדידת משימת הפלואורסצנטיות מ-40 מיקרוליטר של תווך בינוני. לאחר מכן תכנת את אורך גל העירור ב-544 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ב-590 ננומטר עבור קורא מיקרו-צלחות מרובה תוויות.

השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים. לאחר מכן השעו מחדש את תאי האנדותל במדיום תרבית אנדותל שלם וזרעו את התאים בצלחת של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול תאי אנדותל. כדי להשיג ריכוז של 0.1 עד עשרה מיקרוגרם למיליליטר הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום המכיל אנטיביוטיקה.

עקוב אחר כדאיות התאים כל יומיים באמצעות מטרה פי 20 תחת מיקרוסקופ אור. המשיכו לתרבית התאים במשך 10 עד 14 ימים נוספים והחליפו את המדיום המכיל אנטיביוטיקה כל יומיים-שלושה, תלוי בגדילת התאים. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב MTS בכל באר וערבב את המגיב.

דגרו על צלחת 96 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מערבבים לזמן קצר את הצלחת על שייקר. לאחר מכן קרא את הסופגים של התאים המטופלים והלא מטופלים באמצעות קורא צלחות ב-490 ננומטר.

יום אחד לפני ההתמרה הלנטיויראלית, זרעו את תאי האנדותל במיליליטר אחד של מדיום שלם. המתן עד שהתאים יגיעו למפגש של 50 עד 80 אחוז עבור התמרה לנטי-ויראלית לפני פתיחת הצינור, סובב את התרחיף הלנטי-ויראלי ב-200 פעמים גרם למשך 30 שניות כדי למנוע זליכה. לאחר מכן הוסיפו את הקסידימתרין ברומיד לתאים כדי להתאים לריכוז סופי של שמונה מיקרוגרם למיליליטר וסובבו בעדינות את הצלחת.

הוסף את נגיף הלנטי לתאים ושוב סובב את הצלחת בעדינות למשך 30 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון. כדי להגביר את יעילות ההתמרה הלנטי-ויראלית, צנטריפוגה את תערובת התאים-ויראלית ב-300 פעמים גרם למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו על תערובת התאים-ויראלים ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה.

למחרת, השליכו את החלקיק הנגיפי המכיל מדיום והחליפו במדיום תרבית שלם ומחומם מראש. ביום השני, התחל בבחירת הפורומיצין. החלף את מדיום התרבות השלם במדיום המכיל פורומיצין.

לאחר בחירת הפורומיצין, קצרו את התאים. בהתאם להוראות היצרן, בודד RNA מהתאים באמצעות ערכת בידוד RNA. השתמש בערכת שעתוק הפוך כדי לבודד את ה-DNA המשלים עם המיקרו-RNA שנבחרו.

לאחר מכן הגדר את תגובת ה-PCR הכמותית. כדי לנטר את הפנמת השלפוחיות החוץ-תאיות על ידי תאי אנדותל, נותחו שלפוחיות ירוקות עם תווית PKH67 באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בבדיקה, פלודין והוקסט 33342, שהכתמים פועלים באדום ובכחול גרעין, בהתאמה, משמשים למעקב אחר טרנסלוקציה של השלפוחיות בתוך תאי האנדותל.

תמונות קונפוקליות שהתקבלו מראות קליטה מוכנה של השלפוחיות על ידי תאי האנדותל לאחר ארבע שעות. לאחר מכן, כדי לחקור את החדירות של יכולת הדיפוזיה החד-שכבתית של תאי האנדותל של רודמין b isothyosionadedextran. בדיקה זו מראה כי דגירה של תאי האנדותל עם 50 ו-100 מיקרוגרם למיליליטר של שלפוחיות חוץ-תאיות הגדילה את חדירות האנדותל לאחר שעתיים.

בתרשים, ציר ה-x מייצג את ריכוז השלפוחיות החוץ-תאיות וציר ה-y מייצג את שינויי הקפל בחדירות האנדותל הנקראים ב-590 ננומטר. לאחר מכן, כדי לקבוע את הרגישות של תאי האנדותל בטיפול בפורומיצין, שורטטה עקומת הריגה. עקומת ההרג מראה שפחות מ-0.15 מיקרוגרם למיליליטר של פורומיצין מספיק כדי להרוג את כל התאים.

יתר על כן, כדי לקבוע את רמת הביטוי של מיקרו-RNA451a שבודד מתאי האנדותל, בוצע PCR כמותי בזמן אמת. תרשימי העמודות מראים ביטוי יתר משמעותי של תעתיק מיקרו-RNA451a כנגד הגן U6 של עוזרת הבית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המחלות הזיהומיות לחקור את תפקידו של Evs באינטראקציה עם המארח ובתקשורת התאית באמצעות העברת חומר גנטי. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לדמיין קליטת EV על ידי תאים נמענים וכיצד לחקור תפקוד RNA קטן כולל בוויסות תאי אנדותל.

אל תשכח שעבודה עם טפילי המלריה ודם אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת כפפות, חלוק מעבדה ועבודה מתחת למכסה מנוע סטרילי בעת ביצוע הליך זה.