גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התגבשות החלבון, כגון נקודת זמן של גרעין, מנגנון צמיחת גבישים או כיצד להכין ננו/מיקרו-גבישים, כפי שנחקר על ידי מרכז המבורג להדמיה אולטרה-מהירה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ניטור התפתחות הדגימה בזמן אמת, המאפשר רכישת מידע בעל ערך, כגון התפלגות רדיאלית של חלקיקים בתמיסה בשלבי התגבשות שונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה של מיקרו-התגבשות חלבונים, היא יכולה לשמש גם לחלבונים המשמשים לקריסטלוגרפיה קלאסית או לגידול של גבישי חלבון גדולים המשמשים לעקיפה של נויטרונים.

הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה, מכיוון שהיא מציגה את עקרון העבודה של מכשיר התגבשות ייחודי. כדי להתחיל, סנן 16 מיליליטר של תמיסת נתרן טרטרט 1.2 מולרית ו -16 מיליליטר מים מזוקקים, באמצעות פילטר מזרק סטרילי של 2 מיקרון. מלאו את המשקעים ובקבוקי המים בחמישה מיליליטר מהתמיסות המסוננות.

לאחר מכן הרכיבו את הבקבוקים במחזיקי המשאבה של תא הניסוי. בחלון התוכנה, הגדר את הפרמטרים הניסיוניים עם טמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 20 ומים כממס. פתח את דלת הכניסה של תא הניסוי והסר את מנשא הכיסוי.

הנח כיסוי נקי וסיליקון על המנשא והנח אותו בחזרה במכשיר. סגור את תא הניסוי כדי לאבטח את התנאים הסביבתיים. הפעל את Pump Zero, באמצעות מאפייני המשאבה העיקריים שנמצאים בפרוטוקול הטקסט וצור זרם מים.

כוונן את זרם המים, כוון את המיקום לכיוון מרכז החלקת הכיסוי על ידי הפעלה ידנית של בורג הכוונון המיועד לו. כבו את Pump Zero, ולאחר מכן הפעילו את Pump One וצרו זרם נוזלים, כמו קודם. כוונן את מיקום הזרם של משאבה אחת לכיוון המיקום הקבוע עבור משאבה אפס.

לאחר כיבוי המשאבה הראשונה, החלף את הכיסוי המשומש בכיסוי חדש ונקי לניסוי ההתגבשות. צור קובץ ניסיוני חדש באמצעות חבילת התוכנה. בקובץ הניסוי, הזן את החלבון כ-Thaumatin, מ-Thaumatococcus daniellii; ריכוז החלבון כ-14 מיליגרם למיליליטר, המשקע כנתרן טרטרט וריכוז המשקעים כ-1.2 מולר.

לאחר טעינת קובץ הניסוי החדש להפעלת מידע זה, סמן את המיקום על טיפת החלבון על ידי הוספת טיפת מים קטנה, באמצעות Pump Zero. לחץ על כפתור Tara כדי לאפס את המיקרו-איזון. פתח את המכסה העליון של תא הניסוי ופיפטה 8 מיקרוליטר של תמיסת Thaumatin על ציון הדרך של המים.

כדי לרשום את ה-Thaumatin החדש, לחץ תחילה על New Drop'כדי לייחס את התנאים הראשוניים מקובץ הניסוי. לאחר מכן לחץ על כפתור קבוע כדי לפצות על האידוי הטבעי של מים מהטיפה. השתמש במצלמת ה-CCD כדי לבדוק אם Pump Zero מכוון לטיפת החלבון.

כוונן מחדש את המיקום של משאבה אפס אם זרם המים מכוון מחוץ לטיפה. הפעל את לייזר DLS והנח את קרן הלייזר בטיפת החלבון על ידי שימוש ידני בברגי הכוונון. הזן את פרמטרי ה-DLS עם משך מדידה של 60 שניות, זמן המתנה בין שתי מדידות של 10 שניות ומספר מדידות כ-300.

לחץ על כפתור התחל כדי להתחיל את מדידות ה-DLS. בדוק את איכות המדגם על-ידי בחירה באחד מהייצוגים הגרפיים של DLS. הזן את התנאים לשלב האידוי בטבלת לוח הזמנים, כפי שמוצג בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן הפעל את שלב האידוי לדוגמה על ידי לחיצה על כפתור האוטומציה. לחץ על כפתור עצור לאחר סיום שלב האידוי לדוגמה. הפעל את כפתור הקבוע כדי לשמור על משקל הטיפה קבוע.

תכונה זו תפצה על האפשרות של אידוי דגימה טבעי ותבטיח שלא יתרחשו שינויי ריכוז עד לנקיטת פעולה נוספת. לאחר מכן, הזן את התנאים עבור שלב הוספת המשקעים בטבלת לוח הזמנים, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. הפעל את שלב הוספת המשקעים על ידי לחיצה על כפתור האוטומציה.

כדי לעקוב אחר התפתחות טיפת ההתגבשות לאורך זמן, בדוק את המראה של גבישי Thaumatin באמצעות מצלמת CCD. בדוק את התפלגות גודל החלקיקים באמצעות הייצוגים הגרפיים של DLS. בדוק גם את התפתחות המשקל והפרמטרים הניסיוניים באמצעות חלון התצוגה.

כל המידע המוצג בחלון זה מחושב ומוצג בזמן אמת, על סמך שינויי המשקל במהלך ההתגבשות, הנרשמים באופן מקוון על ידי האיזון האולטרה-רגיש. מצפים צלחת טרסאקי סטנדרטית נקייה על ידי הוספת 3 מיליליטר שמן פרפין לצלחת. הוציאו את שמן הפרפין על בארות הצלחת על ידי הזזה עדינה של הצלחת בזוויות שונות כך שהשמן יכסה את כל 72 הבארות.

הסר את עודפי שמן הפרפין על ידי שפיכת כל שמן שצף על הצלחת. לחץ על כפתור עצור כדי לסיים את ניסוי ההתגבשות. הוצא בזהירות את מנשא הדגימה המכיל את טיפת ההתגבשות.

בעזרת פיפטה, הניחו שני אלוקוטים של מיקרוליטר של טיפת ההתגבשות בבארות של צלחת טרסאקי. על ידי שחזור ירידת ההתגבשות בצלחת מתחת לשמן, ניתן לבדוק מעת לעת את הדגימה ליציבות בצמיחת הגביש באמצעות מיקרוסקופ או טכניקות דיוליסטיות אחרות העובדות עם לוחות טרסאקי. מוצגת כאן התפלגות תרשים רדיוס המציגה את צמיחת גודל החלקיקים בירידה של החלבון במהלך כל תהליך ההתגבשות מחלבון מונומרי לקראת היווצרות גרעינים, ננו-גבישים ומיקרו-גבישים.

כאן, תרשימים מייצגים את ההתפתחות לאורך זמן למשקל טיפת החלבון, יחד עם ריכוז החלבון המחושב וריכוז המשקעים. מוצג כאן תצלום מוקלט של מיקרו-גבישי Thaumatin בסוף הניסוי. הטיפה מראה כמות שופעת מאוד של מיקרו-גבישים קטנים רוויים בתמיסת חלבון.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה ו-30 דקות, אם היא נעשית כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להתאים את לייזר ה-DLS במערכות המיקרו-מינון לתוך טיפת החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטפל בקלות במכשיר ההתגבשות הזה על מנת לגבש בהצלחה דגימת חלבון.

שיטה זו אפשרית בשל פיזור האור הדינמי באתרו המחובר ישירות לטיפה ההתגבשות. זה מאפשר לנו לעקוב אחר כל השינויים בהתפלגות הרדיוס ולכן, אנו יכולים לאתר דפוסי התפלגות מסוימים להתגבשות או למשקעי חלבון. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים קריו או עקיפה אלקטרונית כדי לענות על שאלות נוספות ולאמת את המצב הגבישי של חלקיקים בגודל תת-מיקרומטר בתמיסה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לעבר התיאוריה הדו-שלבית של גרעין, שכן מפות DLS מציגות דפוס ברור של התפלגות בגודל כפול של חלקיקים בתמיסה, הנמצאים לפני צמיחת הגביש.