פיתוח חומרים לטיפול בכאב כרוני

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לייצר חלבון היתוך של הציטוקינים האנטי דלקתיים IL4 ו-IL10, לשלוט באיכותו ולהעריך את פעילותו התפקודית ותכונותיו משככות הכאבים בשיקוף מודלים של כאב דלקתי כרוני. שיטות מפורטות אלה מסייעות בפיתוח תרופות ביולוגיות חדשות ובודקות את איכותן ופונקציונליותן. היתרון של טכניקות אלו הוא שניתן לייצר כמות מספקת של חלבוני היתוך רקומביננטיים, המאפשרים להעריך את תכונותיו משככות הכאבים in vivo.

כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של חלבון ההיתוך החדש שפותח, חשוב שתהיה אצווה מאופיינת היטב ולהשתמש במגוון בדיקות התנהגותיות. המשמעות של שיטות אלה היא שהן מספקות תובנות בטיפולים חדשים נחוצים מאוד לכאב כרוני, אך גם מרחיבות את הפוטנציאל למחלות דלקתיות אחרות. בדרך כלל, מדענים חדשים בשיטות אלה יתקשו להיות מסוגלים לבצע את כל ההליכים המוצגים כאן, מכיוון שנדרשת מומחיות בתחומים שונים.

לאחר תת-תרבית של 100 מיליליטר של תאי HEK 293F בצלוחיות ארלנמאייר של 500 מיליליטר על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף 6.6 מיליליטר של תערובת ריאגנטים של טרנספקציה של DNA לכל בקבוק תאים. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס, 8% CO2 ו-95% לחות על שייקר מסלולי המסתובב ב-125 סל"ד למשך שלושה ימים. לאחר מכן, קצרו את התרבית המכילה חלבון היתוך IL4-10 מופרש

כדי לבצע טיהור חלבון, העבירו 100 מיליליטר של תרבית תאים מרוכזת פי 10 דרך עמוד חרוז ספרוז שהוכן בעבר, מצומד IL4 בקצב זרימה של מיליליטר לדקה. השתמש ב -50 מיליליטר PBS כדי לשטוף את העמוד. לאחר מכן, יש למרוח 12.5 מיליליטר של 0.1 מאגר גליצין מולארי כדי לחסל את חלבון ההיתוך הקשור IL4-10 לשברים של 2.5 מיליליטר בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה.

לאחר מכן, הוסף 350 מיקרוליטר של מאגר טריס טוחנת אחת, pH 9, לכל שבר כדי להביא את ה-pH ל-7. השתמש בצינורות דיאליזה בקוטר יבש של 16 מילימטר וחתך במשקל מולקולרי של 3.5K כדי לבצע דיאליזה של השברים המנוטרלים כנגד שני ליטר PBS בן לילה. לאחר מכן, השתמש במסננים חד פעמיים בקוטר נקבוביות של 0.45 מיקרומטר כדי לסנן את השברים הדיאליזה.

הציגו את תמיסת חלבון ההיתוך הסטרילית IL4-10 ואחסנו אותה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. העריכו את הטוהר של חלבון היתוך IL4-10 על ידי הפעלת דגימה על ג'ל 12%SDS-PAGE וצביעו את הג'ל בכחול Coomassie. לאחר מכן, בצע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל בלחץ גבוה על ידי העמסת 40 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר חלבון על העמודה.

קבע את הריכוז של כל אצווה של חלבון היתוך IL4-10 מטוהר באמצעות IL10 ELISA וערכת בדיקת חלבון BCA בהתאם לפרוטוקולי היצרן. השתמש במדיום RPMI כדי להכין דילולים סדרתיים פי שלושה של חלבון ההיתוך המטוהר IL4-10 בטווח ריכוזים של חמישה עד 1, 215 ננוגרם למיליליטר. לבארות של צלחת של 48 בארות, הוסיפו 50 מיקרוליטר של חלבון היתוך IL4-10, 75 מיקרוליטר מדיום RPMI, 25 מיקרוליטר LPS ו -100 מיקרוליטר דם אנושי.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 8% CO2 ו-95% לחות למשך 18 שעות. לאחר מכן, השתמשו ב-TNF-alpha ELISA בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי להעריך את הריכוז של TNF-alpha בתרבית-על. שמור על תמיסות קרגינן או CFA מוכנות במזרקים עם מחטים בגודל 30 בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות לפני ההזרקה.

לאחר מכן, לאגודל הכפה האחורית של עכבר שאינו מורדם, הכנס את המחט כ- 0.5 סנטימטרים, כוון אותה לכיוון העקב והזריק 20 מיקרוליטר מהתרכובת. כדי לבצע מדידות כאב באמצעות מבחן פון פריי, הנח בעל חיים בכלוב אקרילי על מעמד רשת תיל ואפשר לעכבר להתאקלם למשך 15 דקות לפחות. החל את חוטי פון פריי הנעים בין 0.02 לארבעה גרם בניצב על משטח הכפה בכוח מספיק כדי לגרום לכיפוף קל כנגד העור והחזק אותם למשך כשלוש שניות.

מדוד את סף נסיגת הכפות בתגובה לכל שערה, תוך התחשבות בכל תנועה של הכפה הרחק מהשיער המיושם כתגובת נסיגה חיובית. הכניסו את בעלי החיים לכלובים על צלחת זכוכית מחוממת מראש ואפשרו לעכברים להתאקלם לפחות 15 דקות לפני המדידות. קבע את זמני חביון נסיגת החום על ידי שימוש במנגנון Hargreaves כדי לחמם את כף החיות עם קרן אור נראית ממוקדת.

לפני מבחן נשיאת המשקל הדינמי, מדוד את משקל הגוף של כל בעל חיים. הנח בעל חיים במערכת נושאת משקל דינמית המורכבת על כיסוי התומך במצלמה שתתעד את תנועות העכבר. אפשר לבעל החיים להתאקלם במשך 0.5 עד דקה לפני רישום תנועות העכבר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, בצע ניתוח של כל סרטון, וודא שכל איבר מזוהה כהלכה על ידי התוכנה במסגרת הזמן המצוינת על ידי התוכנה. מלא מחדש את התרכובות הניתנות להזרקה למזרק המילטון זכוכית נקי של 25 מיקרוליטר המחובר למחט בגודל 27. הנח את העכבר על השולחן כשראשו מונח באף המנגנון ושמור על טשטוש העכבר עם 1.5 עד 2% איזופלורן עם קצב זרימת חמצן של שני ליטר לדקה.

בדוק שהעכבר מורדם כהלכה על ידי צביטה של הכפה ווידוא שהיא אינה מגיבה. החזק את העכבר בחוזקה על ידי עמוד השדרה האחורי לצלעות. מקם את המחט אנכית בין החוליות המותניות L5 ו-L6 והכנס אותה בזהירות דרך העור לחלל הבין חולייתי.

אשר את המיקוד הנכון על-ידי אימות שהתרחשה תנועת זנב. אם נצפתה רק תנועת כפה אחת, סביר להניח שהמחט אינה ממוקמת כהלכה. לאחר מכן, הזרקו לאט חמישה מיקרוליטרים מהתרכובת, המתינו מספר שניות וחזרו לאט לאט את המחט.

תמונה מייצגת של ג'ל SDS-PAGE המכיל שברי כרומטוגרפיה של זיקה מוצגת כאן. שתי רצועות של 35 ו-37 קילודלטון נצפות במקטע הפליטה המתאים לשני גליקופורמים שונים של חלבון היתוך IL4-10. איור זה ממחיש את התוצאות של בדיקת עוצמה בבדיקת דם מלא של שתי קבוצות שונות של חלבון היתוך IL4-10.

נצפתה עיכוב תלוי מינון של שחרור TNF-אלפא המושרה על ידי LPS, המראה פעילות ביולוגית דומה עבור שתי קבוצות חלבון ההיתוך IL4-10. בניסויים אלה, כאב דלקתי מתמשך נגרם על ידי הזרקה תוך-פלנטרית של 2% קרגינן. ביום השישי לאחר הזירוז, העכברים הוזרקו תוך תא עם חלבון היתוך IL4-10.

IL4-10 פתר באופן משמעותי היפרלגזיה מכנית ותרמית והגיע לאפקט המקסימלי שלו 24 שעות לאחר ההזרקה. כאן, כאב דלקתי נגרם על ידי הזרקה תוך-פלנטרית של 20 מיקרוליטר CFA. נשיאת המשקל על כל כפה נמדדה באמצעות מכשיר נשיאת המשקל הדינמי.

תוצאות אלה מראות כי הזרקת CFA תוך-פלנטרית הפחיתה את נשיאת המשקל של הכף הפגועה. שבעה ימים לאחר הזרקת CFA תוך-פלנטרית, בוצעה הזרקה תוך-תקלית של חלבון היתוך IL4-10. יומיים לאחר מכן, הירידה בנשיאת המשקל של הכף הפגועה הוחלשה בהשוואה לעכברים שהוזרקו ברכב.

לאחר השליטה, באמצעות הליכים אלה, ניתן להשיג שלושה מיליגרם של חלבון היתוך מכל ליטר תאים מתורבתים. כדאי לזכור לבחור מערכת ביטוי התואמת לייצור GMP עתידי של חלבוני היתוך. כדי לבחון את הפוטנציאל המשכך כאבים של חלבון היתוך חדשני זה, ניתן להשתמש במודלים אחרים של כאב כרוני, כמו פגיעה עצבית או נוירופתיה הנגרמת על ידי כימותרפיה.

מגוון מבחנים התנהגותיים מוצגים בסרטון זה, אך מבחני כאב אחרים מצביעים על כך שניתן לבצע גם העדפת מקום מותנית. אל תשכח שהזרקות תוך-תקליות דורשות צוות מיומן היטב וכי נפח ההזרקה מוגבל למדי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר חלבון היתוך ולבדוק את יעילותו in vivo במודלים שונים של כאב.