החילוץ של Hemocytes של הזחלים דרוזופילה melanogaster זיהום מיקרוביאלי וניתוח

טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הזיהום התאי והמיקרוביולוגיה, כגון כיצד המוציטים תורמים לתגובה החיסונית הכוללת בזבובי פירות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה במעבדה, באמצעות זחלים שנדבקו בעבר. לחלופין, ניתן להשתמש בהמוציטים מזחלים לא נגועים לזיהום ex vivo.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההדמיה בגלל המורכבות של המיקרוסקופ הקונפוקלי והאפשרויות לשחזור מודל תלת מימד. כדי להתחיל את הפרוטוקול, שכבו שתיים עד שלוש חתיכות של סרט פרפין של עשרה סנטימטר על עשרה סנטימטר מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, הכינו את נימי הזכוכית על ידי הגדרת תנור החימום הקוטבי הנימי ל-55% מהמקסימום.

מוט את צינור הנימים לנקודה חדה של כעשרה מיקרומטרים. מלאו את הנימים בשמן מינרלי. הרכיבו את צינור הנימים המלא על הננו-מזרק.

ופתח את קצה הצינור הנימי המאוחה על ידי ניתוק הקצה בעזרת מלקחיים. הוציאו כמה שיותר שמן מקצה הצינור הנימים, ולאחר מכן מלאו את הצינור במדיום מבודד המוציטים של דרוזופילה, או DHIM. להדמיה קלה של גבול שמן המולימפן, כלול בועת אוויר בין השמן ל-DHIM.

בעזרת מלקחיים, בחרו בעדינות עשרה זחלי דרוזופילה בדרגה שלישית מהדופן הפנימית של בקבוקוני המזון, והניחו אותם במסננת של 100 מיקרומטר. שופכים חמישה מיליליטר מים סטריליים על הזחלים, ומנערים את המסננת למשך חמש שניות. הנח את המסננת על מגבון משימות כדי להסיר את עודפי המים.

העבירו את הזחלים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הרדימו אותם בגז CO2 למשך חמש שניות. לאחר מכן, הניחו את הזחלים על סרט פרפין מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, כשהצד הגבי פונה כלפי מעלה. הניחו את נימי הזכוכית קלות על הגוף האחורי של הזחל כדי להחזיק אותו במקומו, ושבשו את פתיחת הקוטיקולה האחורית באמצעות מלקחיים מחודדים.

אפשר להמולימפה לזרום על סרט הפרפין. הכינו בריכה של המולימפה, כולל המוציטים, בין 20 ל -50 זחלים בכל פעם, על סרט הפרפין. השתמש בנימי הזכוכית על הננו-מזרק כדי לקחת את ההמולימפה המאוחדת.

הוצא את המולימפה לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר DHIM. מניחים רסק שמרים על צלחת אגר מיץ ענבים. בצע חתך דק באגר שבו הזחלים יכולים לנדוד כדי למנוע התייבשות.

הרכיבו מחט טונגסטן מחודדת 0.001 מילימטר עם מלקחיים אחיזה באמצעות סרט פרפין. פיפטה 50 מיקרוליטר של C.Burnetii עם טיטר גבוה, מבטא דובדבן על סרט הפרפין מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, והנח את הזחלים בבריכת החיידקים. דוקרים את הזחלים בעזרת מחט טונגסטן.

מעבירים את הזחלים לצלחת אגר. העבירו את מדיום הפתוגן שנותר לצלחת האגר, ואטמו את הצלחת בניילון פרפין. שמור את הזחלים על הצלחת באוויר לח עד לזמן הרצוי לאחר ההדבקה.

השאירו את הזחלים הנגועים ב-C.Burnetii על הצלחת למשך 24 שעות. מניחים כיסוי עגולה של 12 מילימטר בבאר של צלחת 24 בארות. פיפטה 500 מיקרוליטר של DHIM לבאר.

חלץ וקח המולימפה מזחלים שנדבקו בעבר, ואז פלט את המולימפה לבאר. צנטריפוגה את הצלחת בחום של 1000 גרם למשך חמש דקות. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להדמיה תלת צבעונית של DAPI, EGFP ו-mCherry.

הנח את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקד בדגימה באמצעות יעד צמצם מספרי של 63x 1.4. אתר את ההמוציטים הרצויים בשדה הראייה להדמיה. לאחר מכן, כוונן את עוצמת הלייזר ואת רווחי הגלאי כדי להשיג את החשיפה המתאימה של הדגימה.

בדוק מספר מישורי Z כדי לוודא שרמת החשיפה מתאימה לכל עובי הדגימה. לאחר מכן, מצא את המיקום העליון והתחתון על ציר Z של המוציט שלם. הגדר מיקומים אלה כעמדות ההתחלה והסיום עבור חתך Z.

השתמש בזום סריקה כדי לדמות את האזור המכיל את ההמוציט. אסוף את סדרת התמונות ברזולוציה המתאימה, כגון 1024 על 1024 פיקסלים במישור X Y, וריווח של 0.3 מיקרומטר בממד Z. ייבא את קובץ סדרת התמונות המחולק Z לתוכנה המשויכת למיקרוסקופ הקונפוקלי לשחזור מודל תלת מימד.

בחר לוקליזציה משותפת של תאים של גרעינים צבועים ב-DAPI ו-C.Burnetii המבטא mCherry בהמוציט המבטא EGFP. חתוך את סדרת התמונות כך שתכלול את התא הבודד בלבד. בחר באפשרות מציג תלת-ממד, המשחזרת את מודל התלת-ממד באמצעות האלגוריתם הארוז מראש של התוכנה.

בחרו את סוג ההדמיה הרצוי לייצוג תלת-ממדי בין אפשרויות המיזוג, המשטח והמעורבות. בשיטה זו, המוציטים, גרעינים ו-C.Burnetii מוצגים באמצעות מודלים של פני השטח. התבונן בתא המשוחזר בתלת-ממד ממיקומי צפייה שונים על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן העכבר וגרירת הסמן סביב המסך.

התאם את כיוון התא והמיקום של מקור האור המעוצב כדי למטב את התמונה. לבסוף, קח חתכים דרך המודל באמצעות פקודות גזירה וחתך כדי לדמיין את התוכן הפנימי של ההמוציט. הדמיה של ההמוציטים החיים שחולצו המבטאים EGFP בשליטה של דוחף המולקטין מתמונות מרובות מראה שרוב התאים החיוביים ל-DAPI הם גם חיוביים ל-EGFP.

חתכים של המוציטים נגועים בקוקסיאלה בורנטי מאשרים את נוכחותם של חיידקים המבטאים mCherry בחלק הפנימי של התא. התמונות שוחזרו למודלים תלת מימדיים וראינו כי המוציטים הנגועים in vivo הראו הרחבות ציטופלזמיות גדולות יותר והיו שטוחים יותר באופיים. בעוד שההמוציטים הנגועים ex vivo היו כדוריים יותר.

חתכים רוחביים של כל אחד מהדגמים מאשרים את נוכחותה של קוקסיאלה המבטאת mCherry בחלק הפנימי של התא. המוציטים שחולצו נדבקו ב-IIV6 והוחלו על ניתוח qRT PCR, שהראה רמות גבוהות משמעותית של תעתיק IIV6-193R בין תאים מדומים לתאים נגועים ב-IIV6. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין את כל המדיה מבעוד מועד ולאזן אותה לטמפרטורת החדר כך שהתאים לא יהיו ללא החומרים המזינים המתאימים במשך זמן רב מדי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו חיפוש RNA של תא בודד, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו התגובה הכוללת של המארח לזיהום. לאחר פיתוחה, טכניקה זו מסייעת לחוקרים באימונולוגיה ובמיקרוביולוגיה לחקור פלישת פתוגנים ותגובות מארח בזבובי פירות, או בעלי חיים אחרים עם מערכת דם פתוחה.