דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

המטרה הכוללת של הליך זה היא בידוד ואפיון על ידי PCR דיגיטלי טיפתי של חומצה ריבונוקלאית שמקורה בגידול מדגימות דם מלאות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האבחון האונקולוגי. כגון כיצד לזהות טרנספיסטים של היתוך גנים שמקורם בגידול מדגימות RNA ודם במחזור הדם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות מותאמות ביותר לייצוב, מיצוי וזיהוי של וריאנטים של RNA הקיימים בתדירות נמוכה ובדגימות דם. בדיקות מבוססות דם הן השלמה לביופסיות רקמות מסורתיות עם היתרון של שימוש בטכניקה זעיר פולשנית שיכולה לספק תוצאות מהירות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מוטציות משמעותיות מבחינה קלינית, ו-NSCLC, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות שבהן יש צורך בזיהוי נגיש ומהיר של מולקולות RNA במחזור בדם מלא.

RNA במחזור עבור תגובת השעתוק ההפוך מבודד מדגימות דם מתורמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. המר את דגימת ה-RNA המרוכזת במחזור ל-cDNA באמצעות ערכת תגובת שעתוק הפוך זמינה מסחרית, כולל פריימרים אקראיים. כלול דגימת בקרה ללא טרנסציפטאז הפוך ודגימת בקרת ללא RNA.

לאחר השלמת תגובת השעתוק ההפוך, בודד cDNA מתערובת התגובה, באמצעות עמודת ספין של רכז DNA זמין מסחרית. שלב זה מקל על הסרת אנזימים, פריימרים וטריפוספטים חופשיים של דאוקסינוקלאוטיד. אם ה-cDNA לא ישמש מיד בתגובות PCR, יש לאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

ללבוש מעיל מעבדה לסילוק וכפפות ניטריל בזמן ביצוע הליך זה ואזור הכנת ריאגנטים ייעודי. כסו את הבדיקות כדי להגן עליהן מפני אור, מכיוון שאור עוקב יכול להלבין את הצבע הפלואורסצנטי המחובר לבדיקה. ראשית הכינו את תערובות ה-PCR לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר כפי שמצוין בטבלה זו, אך עדיין מבלי להוסיף את ה-cDNA.

לאחר מכן, העבירו את התערובות, מכוסות ומוגנות מפני אור לקולט אדים נקי PCR, הממוקם באזור הגברה מקדים נפרד. מחלקים את התערובות לצלחת PCR. הוסף את ה-cDNA לבדיקה לתערובת ה-PCR.

מכסים את הצלחת באיטום צלחת נשלף. צנטריפוגה קצרה של הצלחות כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הבארות. מערבבים על שייקר צלחת, על טמפרטורה נמוכה למשך 10 שניות.

צנטריפוגה את הצלחות שוב לזמן קצר כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הבאר. הסר את אוטם הצלחת לפני ביצוע ייצור טיפות ידני. חשוב למזער בועות בקצה הפיפטה בעת טעינת הדגימות ובהמשך להעביר את הטיפות לאט מהמחסנית לצלחת כדי למנוע נזק לטיפות.

העבירו בזהירות 20 מיקרוליטר מתערובת ה-PCR לבארות הדגימה במחסנית יצירת הטיפות. הוסף 70 מיקרוליטר שמן ליצירת טיפות. מכסים באטם גומי ומעבירים את המחסנית למחולל טיפות ידני כדי להתחיל ביצירת טיפות.

לאחר יצירת טיפות, השתמש בטיפים המומלצים על ידי היצרן להעברת טיפות ללוחית PCR טרייה. שאפו והוציאו את הטיפות לאט, במשך 5 עד 6 שניות כל אחת, מבלי לגעת בקצה הקצה למחסנית הטיפה או לצלחת. אוטמים את הצלחת בעזרת אוטם צלחת נייר כסף.

בצע PCR במחזור התרמי באמצעות ההגדרות הבאות. לאחר השלמת ריצת המחזור התרמי, קרא את הצלחת באמצעות קורא טיפות. צור פריסת לוח עבור תוכנת קורא המזהה את מיקום הפקדים והדוגמאות וטען לתוכנה כדי להתחיל את הקריאה.

תוצאות קריאת הלוחות מנותחות באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. התחל בניווט לתפריט הניתוח כדי להציג עלילות משרעת דו-ממדיות או דו-ממדיות. העריכו את האיכות הכוללת של הנתונים על ידי בחינת נתוני הטיפות.

באמצעות תפריט האירועים, הערך את הנתונים עבור מספרי האירועים הכוללים שהתקבלו. צריכים להיות יותר מ-10,000 אירועים לבאר. אם לא, יש להעריך בזהירות את הנתונים לאיתור בעיות נוספות.

לאחר מכן, בדוק את הנתונים עבור משרעות פלואורסצנטיות מתועבות. הבדלי משרעת משמעותיים והבדלי ריכוז בין דגימות משוכפלות מצביעים על טיפול לקוי או ערבוב של דגימות. שימו לב לאשכולות טיפות עם דפוסי ריסוס על ציר של 45 מעלות, מה שמעיד על טיפות באיכות ירודה או דגימות בעייתיות.

בדוק תחילה את הנתונים עבור הבקרה החיובית, ללא בקרת טרנסקריפטאז הפוך וללא בקרת RNA. בחר את כל דגימות הבקרה ובדוק את איכות האשכול לפי תרשים דו-ממדי לסף מתאים, צריכה להיות הפרדה ברורה בין אשכול הטיפות. עבור כל גרסת בדיקה, הגדר את הסף על סמך בארות בקרה.

הגדר סף על חלקות דו-ממדיות באמצעות כלי הצלב כדי להפריד את אוכלוסיית הטיפות השליליות הכפולות מאוכלוסיית הגנים הבקרה על ציר ה-x, ואוכלוסיית הגנים המשתנים, אם קיימת, על ציר ה-y. כמה עותקים מכל רפליקנט היטב עבור דגימה בודדת. לבסוף, בטא את תוצאות הבדיקה כמספר עותקי הגרסאות שזוהו.

שימוש בקווי תאים, המבטאים היתוך SDC4-ROS1 והיתוך CCDC6-RET, מדולל ברקע של סך כל ה-RNA האנושי מסוג הבר, גבול הזיהוי כפי שנקבע בתדירות של 0.2 אחוז וריאנט עם כל וריאנט היתוך. לא זוהה תכשיר של 5 אחוזים מ-RNA שמקורו בקו תאי המטרה, מה שמדגים את ספציפיות הבדיקה. תקני RNA מולטיפלקס אנליטי נמדדו בריכוזים גבוהים, בינוניים ונמוכים במשך שלוש ריצות באותו יום.

שלוש ריצות בשלושה ימים רצופים, ועם שני מפעילים עצמאיים. התוצאות מדגימות זיהוי מדויק הן של תעתיק ההיתוך המעניין והן של גן בקרה פנימי GUSB. כל באך של דגימות קליניות הופעל גם עם בקרה חיובית, בקרת ללא טרנסקריפטאז הפוך וללא בקרת תבנית RNA.

גרסאות היתוך מיוצגות לאורך ציר ה-y בעוד ש-GUSB נמצא על ציר ה-x. כאשר בקרות האצווה הוערכו במהלך 21 יום, נצפו טיפות חיוביות לאיחוי וטיפות גן בקרת GUSB עבור ROS1 ו-RET בכל הריצות. תוצאות לא אופטימליות מוצגות כאשר יש זיהום בתוך בקרת ללא טרנסקריפטאז הפוך, זיהום בתוך בקרת ללא RNA, שיתוף והתלכדות של טיפות, ותנאי PCR אופטימליים או עיכוב PCR.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את כל הפרוטוקול הזה תוך כ-12 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בשיטות עבודה מומלצות לטיפול ב-RNA ובדגימות דם אנושיות. לאחר בידוד ה-RNA, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי וריאנטים חדשים של היתוך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד RNA במחזור מדם מלא ופלזמה ולאחר מכן לעבד את ה-RNA המשוחזר על מנת לזהות וריאנטים נדירים במחזור כגון RET ו-ROS1. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לאיתור מוטציות הניתנות לפעולה קלינית מדם מלא. והרחבנו את השיטות הללו כדי לבחון תעתיקים מבוטאים במחזור.