Name: דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוזן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: למד לבודד ולזהות RNA מסתובב מדגמי דם של חולי NSCLC באמצעות ddPCR. שיטה זו מאפשרת איתור מהיר של שילובי גנים ROS1 ו-RET בתוך 72 שעות, ומספקת כלי אבחנתי לא פולשני לזיהוי מוטציות קליניות בסרטן הריאה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים השותפים שלנו, סטפן ג'ונס, ניה Charrington, ד ר דיאנה Maar, ד ר קופר. סמנתה מן המרכז ביולוגיה דיגיטלית (ביו-ראד בע מ CA) בזכות העיצוב assay תמיכה; Nezar Rghei, Moemen ד ר עבדאללה (Norgen Biotek, קנדה) עצה קריטית בשעת מיטוב פרוטוקול החילוץ RNA; ובדוק שאנון קמפבל, סקוט תרסטון, ג'ף Fensterer, שאנון Martello ו Joellyn אנוס לעזרה עם דרישות וניטור מסחרי.

היצרנים ההנחיות עבור ריאגנטים המפורטות להלן, אלא אם כן שתואר אחרת. מבחני ה-PCR הם מוצרים זמינים מסחרית תוכננה לאתר fusions ROS1 ו רט.
1. עבודה עם ה-RNA כהכנה שעתוק במהופך (RT)-dPCR: מעבדה מומלצות
<ol><li>ליצור סביבה נטולת RNase בעת עבודה עם ה-RNA.<ol>
<li>השתמש תרסיסים זמינים מסחרית שנועד להשבית RNases מזהמים.</li>
		<li>שימוש מוסמך RNase ללא ריאגנטים, טיפים, וצינורות. השתמש בעצות מכשול עבור ערכות-בדיקות ביוץ למניעת החדרת RNases או זיהום צולב של דגימות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמיד ללבוש מעיל מעבדה כדי למנוע נפילה בין בגדים לתוך דגימת חלקיקים. לייעד את המעיל מעבדה ספציפי לשימוש עם עיבוד RNA.</li>
	<li>ללבוש כפפות כדי למנוע זיהום הדגימה מ RNases בעור. משתנים לעתים קרובות כפפות. הערה: נניח מעבדה משטחים מזוהמים עם RNase מאז הם חשופים לסביבה. כפפות לפנות העור, השיער, ידיות, ידיות מקפיא, עטים/סמנים, וכו ' הם ההנחה תהיה כבר לא נטולת RNase.</li>
	<li>Decontaminate פיפטורים, benchtops, צנטריפוגות ומשטחי עבודה אחרים עם ספריי איון RNase לכהן להשתמש.</li>
	<li>במידת האפשר, לשמור על ערכה של ציוד לשימוש עם ה-RNA בלבד.</li>
	<li>למזער שיבושים של זרימת האוויר באזורים מעבדה בעת עבודה עם דגימות RNA כדי למנוע חלקיקים מנפילה לתוך דוגמאות או מזהם את משטח העבודה.</li>
	<li>חנות טהור RNA ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>הימנע ההקפאה-thaws מרובים של דגימות ה-RNA, כמו זה יכול לגרום השפלה.</li>
</ol>2. דור של חומר ה-RNA האנליטי עבור הפקדים חיובי
<ol><li>עיצוב באמצעות DNA סינטטיים לאור רצפי mRNA גרסאות פיוז'ן של ריבית10.<ol>
<li>פיוז'ן נתון משתנה, בחר מרצף פיוז'ן mRNA הכוללת את אתר פיוז'ן בתוספת אורך מספיק איגוף מכל צד כדי לכסות את אמפליקון PCR.</li>
		<li>בחר רצפי בין 50-250 nt כדי לחקות את הגודל של מחזורי RNA שנלכדה באמצעות פלסמה מועשרת טסיות.</li>
		<li>הוספת רצף יזם T7 (5'-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3') 5' בסוף הרצף היעד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סדר רצפים סינתטיים כמו חומצה deoxyribonucleic נטושים כפול (DNA) קטעים.</li>
	<li>לשקם דנ א סינתטי במאגר טריס-EDTA (TE) כדי ריכוז סופי של 10 ng/µL.</li>
	<li>להמיר 60 דנ א סינתטי ng באמצעות במבחנה שעתוק RNA.</li>
	<li>לטהר תעתיקים RNA באמצעות ריאגנט מבוססות-פנול/guanidine12.<ol>
<li>כוללים DNase אני, נטולת RNase כדי להסיר תבנית שרידי דנ א.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד ריכוז מטוהרים במבחנה RNA באמצעות fluorometer זמינים מסחרית עם צבעי RNA ספציפיים ותקנים. ודא שהרנ א נמצא בטווח מקובל בסטנדרטים שבחרת. דילול עשוי להידרש.</li>
	<li>לאשר תמלול מוצלחת על ידי אלקטרופורזה בג'ל באמצעות ג'ל agarose 2% מעורבב עם הכתם ג'ל RNA ומגוון גבוה בסולם הרנ א כולל 50-250 nt גודל.<ol>
<li>עומס 500 ננוגרם של כל במבחנה -RNA על גבי ג'ל.</li>
		<li>הפעל את הג'ל של 5 V/ס מ.</li>
		<li>דמיינו להקות יחיד באמצעות תאורה, ולתעד את התוצאות.</li>
		<li>אשר תעתיק הצפוי גודל עבור כל אחד גרסאות פיוז'ן (מבוסס על עיצוב בשלב 2.1.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאשר זיהוי של כל במבחנה רנ א על ידי שימוש assay PCR הספציפי משתנה בהתאמה RT-dPCR (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).</li>
	<li>אופציונלי: להכין תערובת equimolar של במבחנה RNA המכיל כל אחד על גרסאות פיוז'ן, הגן שליטה GUSB.</li>
	<li>אם מתבצע שלב 2.9: לאשר את זיהוי של כל אחד גרסאות פיוז'ן כלול את התערובת שליטה על-ידי dPCR באמצעות מבחני ה-PCR הספציפי משתנה (ראה שלבים 5-8 של פרוטוקול זה).</li>
	<li>לקבוע ריכוז קלט הרצוי עבור פקדים חיובי אנליטית על-ידי בדיקת ריכוזים ועד 0.25 2.5 fg10. לבחור ריכוז בהתבסס על פלט מספר העותק המבוקש.</li>
	<li>בעקבות אישור, להכין 10 µL aliquots לשימוש יחיד של RNA אנליטית לשימוש בקרה חיובית (שלב 4.4), חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
</ol>3. תורם דגימות
<ol><li>איסוף דגימות דם כל אדם 10 מ ל 10 מ ל דם אוסף צינורות (BCT) המכיל כחומר משמר RNA נטול תאים. הערה: כל התורמים האנושי יהיה מחקר שימוש ומאשר לא תורם ספציפי או פרטים מזהים יהיה להיות שנאספו בשימוש במהלך הבדיקה.</li>
	<li>תהליך דגימות דם בתוך מסגרת הזמן שצוין על-ידי היצרן BCT.</li>
	<li>במאגר לפלסמה אנושית רגילה ניתן לרכוש ממקור מסחרי לשימוש בתוך הפקד חיובי אנליטית. להכין לשימוש יחיד, aliquots 1 מ"ל של במאגר לפלסמה אנושית רגילה, חנות ב-80 הלעפה תרוטרפמט לשימוש עם הפקד חיובי (שלב 4.4).</li>
</ol>4. שחזור של מחזורי RNA של פלזמה
הערה: חשוב לעבוד במהירות במהלך הליך זה.
<ol><li>צנטריפוגה צינורות דם מלא-200 g x עבור 20 דקות.</li>
	<li>לאסוף עד 4 מ"ל של פלזמה דם centrifuged אוסף שפופרת באמצעות פיפטה סרולוגית. יש להיזהר לא להפריע או תשאף השכבה המעיל באפי.</li>
	<li>לבודד במחזור RNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית כי יכול ללכוד exosomes, טסיות דם, ללא תא RNA של פלזמה. לבודד RNA מהדגימה בקרה חיובית לצד כל אצווה.</li>
	<li>
להכין את הפקד חיובי כל אצווה של דגימות קליניות כדלקמן:
	<ol>
<li>הפשרת 1 מ"ל איחדו נורמלי לפלסמה אנושית aliquot (שלב 3.3).</li>
		<li>הפשרת 10 µL אנליטית RNA aliquot (שלב 2.12).</li>
		<li>להכין בקרה חיובית על-ידי הוספת 10 µL אנליטית RNA לתוך הדגימה לפלסמה אנושית רגילה, ברגע אתנול נוספה פלזמה lysate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elute דגימות מים נטולי נוקלאז µL 100. פנה מיד עם RNA להתנקות וריכוז.<ol>
<li>דוגמאות עשויים להיות מאוחסנים על קרח רטוב, מכוסה, במשך שעה אחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להתרכז RNA בשיטת עמודה מבוסס, elute ב µL 9 RNase ללא מים.<ol>
<li>מיד להמשיך בשלב 5, או לשמור דגימות על קרח רטוב במשך שעה אחת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. הפוך את שעתוק RNA ל cDNA
<ol><li>המר מרוכז מדגם ה-RNA במחזור cDNA באמצעות ערכת התגובה שעתוק במהופך זמינים מסחרית, לרבות תחל אקראי (ראה טבלה 1 עבור רכיבים). הערה: גנים ספציפיים תחל אופציונלי, ניתן לעצב עבור המבחן משתנים. תחל מעוצבים בהתבסס על המטרה רצף ה-RNA. השתמש פיוז'ן רצפים משתנה מ- 2.1 צעד.<ol>
<li>כוללים לדוגמה שליטה אין רוורס טרנסקריפטאז ודגימת שליטה אין RNA (ראה טבלה 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד cDNA מתגובה שעתוק במהופך באמצעות עמודה ספין זמינים מסחרית של רכז הדנ א. הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אנזימים, תחל deoxynucleotide חינם triphosphates (dNTPs).</li>
	<li>השתמש cDNA מיד ב- PCR תגובות או לאחסן ב-80 הלעפה תרוטרפמט.</li>
</ol>6. PCR דיגיטלי
הערה: זו PCR היא ספציפית droplet PCR דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>
PCR מערבבים אמצעי זהירות.
	<ol>
<li>ללבוש כפפות מעילו ואת nitrile המעבדה חד פעמיות.</li>
		<li>שימוש PCR מערבבים ריאגנטים באזור הכנה ריאגנט ייעודי. לא מסתדר עם cDNA באזור הכנה ריאגנט בלבד.</li>
		<li>מכסים הגששים תוך כדי עבודה כדי להגן עליהם מפני אור. אור מופרז יכול צילום להלבין את הפלורסנט מחובר המכשיר.</li>
		<li>תחבורה תערובות, מכוסה, מוגן מפני אור, לתוך אזור קדם הגברה נפרדת לפני cDNA שיתווספו.</li>
		<li>להוסיף cDNA להיבדק כדי לערבב PCR בשכונה נקי PCR ממוקם באזור קדם הגברה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>היכונו PCR mixes נפח התגובה האחרונה של 20 µL על פי בטבלה 2.</li>
	<li>להפיץ PCR mixes + cDNA ללוחות ה-PCR. הערה: שימוש במיתאר צלחת כמו מומלץ לקחת מדריך.</li>
	<li>מכסים את הצלחת באמצעות סילר לאיטום של צלחת נשלף.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות בקצרה לאסוף דגימות בתחתית הבארות.</li>
	<li>תערובת על צלחת שאכר על קביעת ערך נמוך מ-10 s.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחות בקצרה כדי לאסוף דגימת בתחתית הבאר.</li>
	<li>הסר את לוחית סילר לאיטום. לבצע יצירת droplet עבור ה-PCR-cDNA לערבב עם גם מערכת דור droplet ידנית או אוטומטית.<ol>
<li>לדור droplet ידנית, העברה מיקס PCR µL 20 דוגמת בארות על הדיו הדור ' droplet '. הוסף µL 70 של שמן דור droplet. מכסים עם גומי אטם והעברת מחסנית לגנרטור droplet ידנית ליזום דור droplet. בעקבות יצירת droplet, להעביר טיפות צלחת PCR טריים באמצעות טיפים מומלצים על ידי היצרן. האחות, לחלק את טיפות לאט, מעל 5 עד 6 s כל אחד, בלי לגעת הפתיחה של קצה droplet מחסנית או צלחת.</li>
		<li>לדור droplet אוטומטיות, חותם את הצלחת עם כשסרט האטימה, העברת הגנרטור droplet. להבטיח כל העצות, מחסניות, צלחות במקום לפני תחילת יצירת droplet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעקבות droplet בדור העברה של טיפות על צלחת PCR טריים, חותם עם סילר לאיטום צלחת עם רדיד אלומיניום, לוחות המחזור התרמי תוך שימוש בהגדרות בטבלה3.</li>
	<li>לאחר הצנטרפוגה תרמי בניהול הושלמה, לקרוא את הצלחת שימוש בקורא droplet. ליצור פריסה צלחת עבור תוכנת קורא שמזהה את המיקום של פקדים, דגימות, וכדומה, עומס לתוך תוכנת להתחיל לקרוא.</li>
</ol>7. נתוני ניתוח, סקירה של דור של תוצאות
<ol><li>לנתח את הצלחת לקרוא את התוצאות באמצעות תוכנה זמינים מסחרית.</li>
	<li>נווטו לתפריט Analyze כדי להציג מתווה דו מימדי משרעת (2D).</li>
	<li>להעריך את האיכות הכוללת של הנתונים על-ידי בדיקת הנתונים droplet.<ol>
<li>הערכת הנתונים עבור מספרים הכוללת אירוע מקובל שימוש בתפריט Events. אם ישנם אירועים פחות מ 10,000 לכל היטב, בקפידה להעריך את הנתונים עבור בעיות נוספות.</li>
		<li>בדוק נתונים עבור קרינה פלואורסצנטית סוטה amplitudes. הבדלים משמעותיים משרעת והבדלים ריכוז בין דגימות שכפל מצביעים על טיפול עניים או ערבוב של דגימות.</li>
		<li>ליצור הערות של droplet אשכולות עם דפוסים ספריי על ציר 45 מעלות, הרומז על מצבה העגום של טיפות באיכות ירודה או דגימות בעייתי.</li>
		<li>בדוק קודם בקרה חיובית, לא רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) ונתוני בקרה RNA לא (NRC). בחר כל שליטה דוגמאות ולבחון אשכול איכות על ידי מגרש 2D. על סף תקין, הפרדה ברורה בין אשכולות droplet בלאו הכי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור כל משתנה assay, להגדיר את הסף מבוסס על שליטה בארות.<ol>
<li>ספי קבע על מגרשים 2D באמצעות הכלי הכוונת כדי להפריד בין האוכלוסייה droplet כפול שלילי מן האוכלוסייה ג'ין שליטה (המסומנת phosphoramidite 5'-hexachloro-fluorescein-CE בדיקה), ציר ה-y, אוכלוסיית הגן variant, אם להציג ( עם תוויות fluorescein amidite או 6-carboxyfluorescein בדיקה), ציר ה-x.</li>
		<li>סכום עותקים מכל קידוח שכפל דגימה בודדת.</li>
		<li>מבטאים את תוצאות הבדיקה כמו מספר העותקים variant זוהה. הערה: כדי לקבוע את ערך הסף אנליטית שהתקשרת דגימה חיובית או שלילית, להפעיל רגיל מדגם תורם בריא קבע (לפחות 10 דוגמאות בודדות) בתהליך גיבוש ולהקים החיתוך מעל כל אות רקע לזיהוי בשביל המוטציה של ריבית. בנוסף, להקים את מספר העותקים ג'ין שליטה נדרש לקרוא תוצאה חיובית או שלילית. ניתוק ג'ין זה שליטה מתפקד בקרת איכות (QC) כדי להעריך את כמות ואיכות כל מדגם ה-RNA שמעובד פנימי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. אימות של תנאי ריאקציה RT-dPCR באמצעות שורות תאים (אופציונלי)
<ol><li>כדי לוודא זיהוי של גרסאות פיוז'ן, השתמש שורות תאים זמינים מסחרית לבטא את פיוז'ן ROS1 או רט mRNA של עניין. פעל כדלקמן:<ol>
<li>Homogenize קפואה תאים בפתרון מבוסס-guanidinium פירוק ישירות ממצב למצב קפואים. מפשיר אפילו קצרה לפני המגון יכול לגרום RNA השפלה ואובדן.</li>
		<li>לבודד RNA תוך שימוש בעמודות ספין סיליקה-הממברנה מיועד RNA.</li>
		<li>למדוד את הריכוז של דגימות RNA באמצעות fluorometer עם ריאגנטים ספציפיים RNA ותקנים.</li>
		<li>לדלל RNA מבודד לתוך רקע של RNA פראי-סוג פלזמה או ממקור מסחרי אחר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע צעדים מן הפוך שעתוק של רנ א cDNA, PCR דיגיטלי, ניתוח נתונים, סקירה, דור של תוצאות המופיעים בפרוטוקול זה כדי לאשר גילוי של הווריאציה הרצויה.</li>
</ol>

<ol><li>Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA%3A+Challenges+and+Opportunities+on+the+Path+to+Clinical+Utility%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility.</a> Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).</li>
<li>Alix-Panabieres, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Applications+of+Circulating+Tumor+Cells+and+Circulating+Tumor+DNA+as+Liquid+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy.</a> Cancer Discov. , (2016).</li>
<li>Paxton, A. <a target="_blank" href="http://www.captodayonline.com/molecular-ap-testing-sync-guidelines/">Is Molecular AP testing in sync with guidelines.</a> CAP Today. , (2014).</li>
<li>Sacher, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Validation+of+Rapid+Plasma+Genotyping+for+the+Detection+of+EGFR+and+KRAS+Mutations+in+Advanced+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li>
<li>Sozzi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+free+circulating+DNA+as+a+diagnostic+marker+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer.</a> J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).</li>
<li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+detection+of+response+and+resistance+in+EGFR-mutant+lung+cancer+using+quantitative+next-generation+genotyping+of+cell-free+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA.</a> Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).</li>
<li>Best, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+of+Tumor-Educated+Platelets+Enables+Blood-Based+Pan-Cancer%2C+Multiclass%2C+and+Molecular+Pathway+Cancer+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics.</a> Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).</li>
<li>Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+exosome+cargo+from+plasma%2Fbronchoalveolar+lavage+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer.</a> Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27035812">The biology and function of exosomes in cancer.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Mellert, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Clinical+Utility+of+a+Blood-Based+Test+Service+for+the+Rapid+Identification+of+Actionable+Mutations+in+Non-Small+Cell+Lung+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma.</a> J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).</li>
<li>Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+blood+collection+device+stabilizes+cell-free+RNA+in+blood+during+sample+shipping+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage.</a> BMC Res Notes. 6, 380(2013).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).</li>
<li>Kohno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+ALK-RET%2C+ROS1+and+other+oncogene+fusions+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer.</a> Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).</li>
<li>Takeuchi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22327623">ROS1 and ALK fusions in lung cancer.</a> Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).</li>
<li>Rimkunas, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+receptor+tyrosine+kinase+ROS1-positive+tumors+in+non-small+cell+lung+cancer%3A+identification+of+a+FIG-ROS1+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion.</a> Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).</li>
<li>Tsuta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RET-rearranged+non-small-cell+lung+carcinoma%3A+a+clinicopathological+and+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis.</a> Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27899578">COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).</li>
<li>Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+challenges+in+non-small-cell+lung+cancer%3A+an+integrated+medicine+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach.</a> Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).</li>
<li>Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Biomarkers+in+Personalized+Therapy+of+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC17763/">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Oxnard, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+Between+Plasma+Genotyping+and+Outcomes+of+Treatment+With+Osimertinib+%28AZD9291%29+in+Advanced+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).</li>
<li>Reckamp, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Sensitive+and+Quantitative+Test+Platform+for+Detection+of+NSCLC+EGFR+Mutations+in+Urine+and+Plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Oncol%22%5BJournal%5D)">A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma.</a> J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).</li>
<li>Yanagita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+evaluation+of+circulating+tumor+cells+and+cell-free+DNA+in+EGFR+mutant+non-small+cell+lung+cancer+patients+treated+with+erlotinib+on+a+phase+II+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial.</a> Clin Cancer Res. , (2016).</li>
<li>Abbosh, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28445469">Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution.</a> Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).</li>
<li>Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+single-step+simultaneous+isolation+of+RNA%2C+DNA+and+proteins+from+cell+and+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples.</a> BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).</li>
</ol>

H.M., אל. ג'יי, כ"ע ו G.A.P. עובדים של ולהחזיק מניות ב H.M. Biodesix, inc., אל. ג'יי, G.A.P. הם ממציאים על בקשה לרישום פטנט שהגיש Biodesix, המכסה אבחון מערכת איתור של מחזורי גרסאות גנטיים שאינם קטנים התא סרטן ריאות.

Rearrangements רט ו ROS1 ביחד יוצרים ~ 3% של מוטציות הנהג בתוך האוכלוסייה NSCLC18. למרות שזה נדיר, זיהוי שינויים גנטיים אלה היא חיונית. חולי NSCLC עם שינויים אלה עשויים להפיק תועלת הרפוי יישוב זה במיוחד לעכב את פעילות קינאז aberrant הנובעת onco-חלבון13. כמה טיפולים כאלה כבר המאושרים על ידי ה-FDA לשימוש ב NSCLC חיובית ROS1, בעוד אחרים הוכחו בתמימותה נגד רט ניסויים קליניים19.
טכנולוגיית ה-PCR דיגיטלית מספקת רגישות זה אידיאלי עבור יישומים ביופסיה נוזלי20. יש כבר אימוץ משמעותית של טכנולוגיה זו לשימוש עם מחזורי תא ללא ה-DNA של המדד של מוטציות הגידול בחולים עם NSCLC4,6,21,22,23 . בנוסף cfDNA, פיתחנו פרוטוקול המיועד למדידת חזקים גרסאות פיוז'ן הנפוצות ביותר בחולים עם NSCLC מלהסתובב הגידול RNA (איור 1א')10.
פרוטוקול הוקמה שלנו מאפשר לתחום האנליטי של זיהוי עד 0.2% (איור 2). בעוד RT-dPCR הוא ספציפי ורגיש במיוחד, מבחני מוגבלות הלוח של גרסאות פיוז'ן ידוע כי הם בחרו מרובב לצורך זיהוי ב- PCR וזמינותו. לפיכך, fusions תיכלל מבחני מרובבת יש לבחור בקפידה כדי להבטיח כיסוי הולם בתוך האוכלוסייה של חולים עם NSCLC. עיצבנו בהצלחה מבחני רט ו ROS1 בו זמנית לזהות שמונה תוצאות גרסאות פיוז'ן מן rearrangements של לוקוסים RET או ROS1, לכסות 99% 88% מן האוכלוסייה חיובי רט ו- ROS1, בהתאמה (איור 1בג )17.
המבחן האחרון זרימת העבודה כפי שמתואר במחקר זה כולל בקרת אצווה כדי להבטיח עקביות של תוצאות. פקדים אלה כוללות הן ברמה האנליטית חיוביים, כמו גם שני פקדים שלילי, המבטיחים ביחד אין זיהום או עיכוב PCR המתרחשים בתוך החבילה (איור 3). כדי להבטיח את היציבות של וזמינותו, בוצע מחקר באמצעות הפקדים אצווה במשך 21 יום (איור 3יח, ח). נתונים אלה מדגימים את העקביות של תהליך ה-RNA כפי שנקבעו במסגרת פרוטוקול זה.
שיטות מעבדה של הטיפול RNA הם מרכיבי המפתח של המבטיח תוצאות חזקות ומדויקות. שטח וציוד ייעודי לשימוש עם ה-RNA, ניקוי הציוד לאחר כל שימוש, בעזרת ריאגנטים RNase ללא חומרים מתכלים והחלת של ספריי איון RNase במרחב העבודה של כל לסייע בהפחתת RNases מזהמים. טיפול מצפוני של RNA דגימות על ידי טכנאים, כולל חלוק מעבדה ייעודית, תכופות שינויים הכפפות, עובדים במהירות על התהליך החילוץ RNA, והם לשמור דגימות על קרח בעל חשיבות עליונה לשמירה על שלמות הדגימה. ברגע RNA היה הפוך עיבד כדי cDNA, הדגימה היא בצורה יציבה יותר כי הוא נוטה פחות השפלה. בנוסף לשיטות העבודה התומכים RNA שלמות, רכיבי ה-PCR ודוגמאות צריך להישמר באזורים הפרדה כדי למנוע זיהום שעלול להוביל לתוצאות חיוביות כוזבות. ריאגנטים PCR מלאי והכנת mixes מאסטר PCR צריך להישמר נפרד מתבניות PCR, זהירות רבה יש לנקוט הפרדת תבנית מוגבר (post-PCR) של כל החומרים מראש מוגבר כולל ריאגנטים, רנ א cDNA דגימות. לבסוף, דור נכונה וטיפול mixes PCR emulsified לפני הגברה היא המרכזית לשמירה על תקינות droplet ותנאים אופטימליים dPCR. אמצעי זהירות כמו אלה הם קריטיים במהלך ביצוע של פרוטוקול זה כדי להשיג תוצאות עקבי ומדויק. כל הנתונים צריך להיבדק על ידי צוות מיומן לפני שחרורו של תוצאות כדי לוודא כי כל המדדים QC מולאו. במקרה של תוצאות שיוצרת (איור 4), האצווה חייב להיות נבדקו על ידי צוות טכני, מנהל המעבדה, עשוי לדרוש עיבוד מחדש.
RT-dPCR תוצאות יכול להיות מיוצר מוקדם ככל 24 שעות קבלת דגימות ו 95% של תוצאות המדגם בתוך המבחן לקבוע בשימוש במחקר זה (n = 984) דווחו לרופא ההזמנה תוך פחות מ- 72 שעות ממועד קבלת (איור 5). הפעם סיבוב מספקת לרופאים עם הרבה צריך מידע מולקולרית במסגרת זמן המאפשר חניכה של הטיפול המתאים. תוצאות אלו זמינים בדרך כלל מוקדם יותר מאלו שהושגו באמצעות ביופסיה רקמות קונבנציונלי. סמנים ביולוגיים נוספים NSCLC, סוגי סרטן אחרים ניתן לפתח באמצעות גישות מבוססות-RNA במחזור בדומה, ירוויחו באותו הזמן-כדי-תוצאות מהירות. לדוגמה, מדידה של תמליל mRNA מתוכנת מוות ליגנד 1 (PD-L1) באמצעות RT-dPCR יכול ליידע רופאים לגבי אפשרויות חיסוני. יש גם עניין הולך וגובר בכלי השירות של ביופסיה נוזלי dPCR בפיקוח על יעילות טיפולית. אינדיקציות קודמות של התחייה של הגידול באמצעות גנומית בדיקות עבור משתנים מסוימים עלולה לאפשר לרופאים להתאים משטרי הטיפול לפני המטופלים מפתחים סימפטומים על ידי תקן של אמצעי טיפול כגון הדמיה24. פרוטוקולים כמו האחד דיווחו במחקר זה הינם אידיאליים עבור ניטור שלהם הלא-invasiveness, רגישות, מהירה, סיבוב סביב הזמן וכתוצאה יחס עלות-תועלת. וזמינותו המתוארים בזאת מספק תוצאות תוך 72 שעות מעת קבלת דגימות, במחירים זיהוי חיובי-false מינימלי, אשר מקלה על החלטות לטיפול מהיר עוקף כמה מגבלות המנוסה המבוסס על רקמות ובדיקות4.
פרוטוקול ונתונים שלנו להפגין מערכת הבדיקה חזקים לזיהוי. גרסאות ה-RNA שפע נמוך, כמו גם את פוטנציאל מבוסס-דם מוטציה הבדיקה הקלינית. עבור אותם חולים אשר אין מנהל התקן שבידיך מוטציה מזוהה על ידי ביופסיה נוזלי יישוב מהיר גישות כמו זה, התוספת של הגנום מקיפה יותר, פרוטאום בדיקות רקמות והן דם עשויים לספק מידע קליני אפילו רחבה יותר כדי לתמוך תכנון טיפול.

עד 25% של סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC) חולים אולי לא יש זמינות לבדיקה בעת ביצוע אבחון מספיק רקמות. אפילו במקרים בהם רקמה זמין, זה לא מספיק כמות או איכות לביצוע המומלצים בדיקות מולקולריות1,2. במקרים שבהם יש מספיק רקמה של ביופסיה עבור פרופיל מולקולרית, חולים שיש לחכות מספר שבועות או יותר לקבלת תוצאות, או להתחיל טיפול ללא תוצאות מולקולרית3,4. עם זאת, קריטי כי אבחון מולקולרי אינפורמטיבי יהיו זמינים בהתחשב כניסתו של אפשרויות טיפול ממוקד עבור חולים שאובחנו עם NSCLC. בדיקה של מחזורי ללא תא הדנ א (cfDNA) ביופסיה נוזלי הוא פתרון לאתגרים של רקמה מסורתית בדיקות4,5,6. אפשרויות הבדיקה הנוכחית מוטציות שבידיך NSCLC באמצעות cfDNA ו זרימת עבודה המבוסס על dPCR דומה ' לדור תוצאה מהירה, כוללים את קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) sensitizing מוטציות ΔE746-A750, L858R, EGFR ההתנגדות מוטציה T790M , גרסאות קראס proto-oncogene (קראס), B-Raf proto-oncogene (BRAF) משתנה V600E. אמנם לא כמו בהרחבה אומצו על-ידי השדה במחזור הגידול-derived RNA שליח (mRNA) מבודד ביופסיה נוזלי יכול גם לספק מידע קליני חשוב7,8,9. יש קודם לכן פיתחה ואנו דיווחו על שיטות זיהוי מרובבת קווצי עור Microtubule הקשורים חלבון כמו 4-אנפלסטית לימפומה קולטן טירוזין קינאז (EML4-ALK) פיוז'ן וריאנטים פלזמה דם10. במחקר זה, אנחנו האריכו שיטות אלה לכלול יעדים RNA מרובבת מסדר גבוה עבור ROS1 ורט, המכסה שמונה גרסאות פיוז'ן בתוך כל assay. המטרה הייתה לפתח טכניקה מהירה, רגיש, ספציפית, לשחזור איתור אלה גרסאות פיוז'ן של הפלזמה של חולים שאובחנו בעבר עם NSCLC.
תהליך הבדיקה מאותחלת במשרד של רופא בעזרת RNA ייצוב צינורות איסוף דם11. צינורות אלה מכילים משמרים כמו גם מעכבי RNase תא. הדגימות עדיפות שנשלחה ונישלח מרכזי המכללה של קאפ פתולוגים אמריקאי מוכר/קלינית מעבדה שיפור התיקונים (CLIA)-מעבדה מוסמכת (קליני מעבדתי) לעיבוד על-ידי כוח אדם מוכשר. ברגע שהתקבלו על-ידי מעבדה קלינית, כל שלב של עיבוד מתנהל תחת נהלי שאושרו (SOP). דם מלא הוא centrifuged לשחזר את הפלזמה, אשר משמש לאחר מכן כדי לבודד במחזור ה-RNA זה הוא או חופשי בדם או בתוך לבצע moieties, כגון exosomes וטסיות7,8,9. כדי לבודד RNA של תאים אלה, בחרנו את המערכת להתאוששות RNA המבוסס על השוואות של מספר שיטות החילוץ. הרנ א מבודד הוא מרוכז, הפוכה עיבד כדי cDNA. מספר אנזימים רוורס טרנסקריפטאז, גנים ספציפיים תחל הוערכו בזמן אופטימיזציה של שיטת סינתזה cDNA להגדיל את ROS1 ואת רט היעד התעתיק ההמרה10. . זה קריטי עבור שפע נמוך במחזור תעתיקים, כגון גרסאות פיוז'ן נגזר הגידול. בסופו של דבר, אנחנו אופטימיזציה ריכוזים פריימר ולאחר בדיקה dPCR כדי לאפשר זיהוי מרובבת של גרסאות פיוז'ן רט או ROS1, הגן בקרה, glucuronidase-β (GUSB). אנחנו ואז לשלב את התנאים הטובים ביותר מכל המחקרים אופטימיזציה פרוטוקול נעול הסופי לפני ביצוע האימות אנליטית המחקרים שתוארו בדו ח זה. פרוטוקול זה ותוצאות אלה מספקים את הבסיס עבור זרימת עבודה מהיר ורגיש איתור שגרתית גרסאות פיוז'ן נדיר במחזור.

דם מבוסס מבחן איתור ros1 ואת ret פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

פיתחנו שיטות הרומן בידוד ואפיון של נגזר הגידול במחזור חומצה ריבונוקלאית (קרנה) לביופסיה נוזלי מבוסס-דם. זיהוי חזקים קרנה התאוששה דם מייצג פתרון צורך קריטי בתוכנית האבחון הקליני. הבדיקה מתחילה עם האוסף של דם לתוך צינורות איסוף דם המכילים חומרים משמרים זה לייצב את קרנה. ללא תא, exosomal, ו- RNA טסיות-הקשורים מנותקת פלזמה במערכת זו הבדיקה. קרנה היא הפוכה עיבד ל- DNA משלימים (cDNA) מוגבר באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). דוגמאות מוערכים הן את סמן יעד, כמו גם גן הבקרה. בדיקת אימות כלל מגבלה של זיהוי, דיוק חוסן מחקרים עם דגימות אנליטית. השיטה פותחה בעקבות מחקרים אלו reproducibly לזהות מספר גרסאות פיוז'ן ROS1 (C-Ros proto-oncogene גרסאות 1; 8), RET (לסידור מחדש במהלך תרביות תאים proto-oncogene; 8 גרסאות). זרימת העבודה לדוגמה עיבוד מוטבה כך ניתן להפיק תוצאות הבדיקה באופן עקבי בתוך 72 שעות מיום קבלת מדגם.

פרוטוקול זה מתאר מערכת הבדיקה שפותחה עבור הגילוי של RNA גרסאות פיוז'ן לשימוש בהמידה של מוטציות הנהג בתוך הפלזמה של חולי NSCLC (איור 1א'). פיוז'ן mRNA היו מוצרים מן הביטוי של rearrangements רט ו- ROS1 הנפוץ ביותר בקרב האוכלוסייה NSCLC מזוהה13,14,15,16,17. מבחני ה-PCR מרובבת תוכננו ואז לזהות על שמונה גרסאות התעתיק הנפוץ ביותר עבור כל מטרה NSCLC בתוך תגובה אחת. Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה ROS1 ליצור שיוכי בחלקים 5' של CD74, SDC4, SLC34A2, EZR או TPM3 גנים (איור 1B). Translocations הנפוץ ביותר-מיקומה רט להוביל הסמיכות עם KIF5B, שעבורו assay מכסה שישה צמתים אקסון. שותפים רט נוספים מכוסים כוללים את אלה עם CCDC6 ו- TRIM33 (איור 1C). בסך הכל, מבחני מכסה כ- 88% של ROS1 ו- 99% של RET. שינויים עלולה להתרחש בתוך האוכלוסייה המטופלת NSCLC17.
ייחודה של הרכיבים assay הוערך קודם באמצעות שמונה בודדים במבחנה RNAs מכילים את רצף ה-mRNA לפי התרשימים פיוז'ן מכוסה על ידי ROS1 או רט מרובב מבחני. לכל מין RNA נבחנה נגד כל assay variant בודדים שכוללת את הגירסה מרובבת. היה לא אשיג של מבחני אלה, ובכך הפגנת 100% ירידה לפרטים אנליטית בתוך תוכנן מרובב מבחני (נתונים לא מוצג). כדי לקבוע את הגבול התחתון של זיהוי של פרוטוקול הבדיקה, הכולל RNA נגזר שורות תאים ביטוי variant פיוז'ן הכלולים וזמינותו היו מעורבבות רקע של RNA נורמלי בריכוזים 5%, 1%, 0.2% ו- 0.04%. מרובבת רט ו ROS1 variant PCR מבחני זוהה רק 0.2% פיוז'ן variant (איור 2א-ב). בנוסף, הכנה של 5% הנחה-יעד שורת התאים נגזר RNA (ביטוי של התעתיק פיוז'ן EML4-ALK) לא זוהה עם מרובבת ROS1, RET מבחני, בהמשך מדגימים ירידה לפרטים (איור 2א-ב).
דיוק בדיקה של תהליך RT-dPCR בוצע עבור שני ROS1 ומעובדים מיל' אנליטית בקרת החומר מורכב equimolar במבחנה RNAs היה בריכוזים שלוש (גבוהה, בינונית, נמוכה) דרך שעתוק במהופך, dPCR על שלוש הזדמנויות שונות בתוך באותו היום (אינטרה-יום), על שלושה ימים רצופים (inter-יום), ועם שני אופרטורים (inter-מפעיל). תוצאות בדיקות הדיוק הפגינו זיהוי מדויקת של התעתיק פיוז'ן מעניינים, כמו גם בקרת גנים, GUSB, אשר נכלל בתור מדד QC פנימי (איור 2C-D).
בנוסף בקרה פנימית של GUSB, שכל אצווה של דגימות קליניות הופעלה עם קבוצה של פקדים אצווה. פקד חיובי פותחה מתערובת של אנליטית חוץ גופית ב RNA מיוצגים כל אחד גרסאות פיוז'ן נבדק ב- RT-dPCR, כמו גם אנליטית במבחנה RNA עבור GUSB. RNA הזה נמזג לפלסמה אנושית רגילה lysate במהלך החילוץ-RNA, עובדה לצד הדגימות קליניים לאורך כל הפרוטוקול. הפקד רוורס טרנסקריפטאז (לא RT) לא היה פקד שלילי כדי לאשר את העדר של חומרים מזהמים בתהליך מיצוי העבודה RNA ומדגימים יחודיות של תחל עבור ה-RNA. הפקד RT לא נוצר באמצעות מאותו חומר כמו הפקד חיובית, אך היא אינה כוללת אנזימים בתוך התגובה סינתזה cDNA. אין RNA הפקד (NRC) הוא פקד שלילי כדי לוודא העדר מזהמות תעתיקים ברכיבי התגובה של שעתוק במהופך. פקד זה הוכנס שזרימת העבודה בשלב סינתזת cDNA, מים נוספה בהתגובה במקום תבנית ה-RNA. הפקדים לא RT ו- NRC חייב להיות שלילי בשני ערוצים, אם תוצאות מדויקות כדי להיגאל. טבלה 1 מציגה את רכיבי התגובה שעתוק במהופך עבור כל פקד. דוגמאות של החלקות 2D עבור כל אחד מהפקדים הללו מוצגים עבור ROS1 (איור 3 A-C), מבחני מולטיפלקס RET (איור 3 E-G). גרסאות פיוז'ן אותרו באמצעות בדיקה amidite (FAM) fluorescein, מיוצגים לאורך ציר ה-y, ואילו הגן בקרה, GUSB, זוהתה באמצעות בדיקה 5'-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (הקסדצימאלי) והוא בציר ה-x. פקדים אצווה אלה היו העריכו במשך 21 ימים כדי לקבוע assay חוסן. טיפות חיובי fusion ו GUSB בקרת גנים טיפות נצפו עבור ROS1 ורט ב כל הרצפים 21 להורג במהלך המחקר (איור 3ד', H). כל הפקדים שלילית (לא RT ו- NRC) הניבו תוצאות שליליות על-פני כל 21 הימים (נתונים לא מוצג).
היכולת לפתור בעיות היא מרכיב קריטי בכל פרוטוקול הבדיקה כדי להפעיל את ההגדרה קליני מעבדתי. כאן, אנו מספקים דוגמאות מהעולם האמיתי של תוצאות תת אופטימלית באמצעות פרוטוקול RT-dPCR. הראשון הוא מגרש 2D לדוגמה הממחיש את חשיבות אין רוורס טרנסקריפטאז הפקד (איור 4א). בדוגמה זו, טיפות מוטציה חיובית נכחו למרות שלא היתה ללא המרה cDNA בשל חוסר אנזים. התוצאה הייתה ככל הנראה בגלל תחל dPCR הגברה דנ א גנומי את המטרה. במקרה זה, העיצוב של וזמינותו פורש-אינטרון תמנע הגברה של הדנ א. לחלופין, אנזים DNase נטולת RNase יכול לשמש כדי לחסל את ה-DNA מזהמים, אך זה לא מומלץ לצורך זיהוי של מטרות נדיר, כי קצת השפלה RNA עלולה להתרחש במהלך הדגירה עם האנזים. העלילה 2D הבא דוגמה היה NRC עם טיפות חיובי בשני ערוצים (איור 4B). זה הצביעו על זיהום בשלב מסוים בכיוונון RT-dPCR. במקרה זה, ההמלצה היא למחוק את כל ריאגנטים שעשויות להיות מזוהמים משמש בדיקות, ביסודיות decontaminate כל הציוד של בדיקה חוזרת עם רכיבי התגובה טריים. השלישי דוגמה 2D העלילה שהוצגו כמו תרסיס של טיפות לאורך קו 45° (איור 4C). זו נגרמת לעתים קרובות על ידי הטיית התגבשו של טיפות. זהירות droplet טיפול לפני רכיבה על אופניים תרמי חיוני, כמו טיפות הם נוטים לגרום נזק. אנו ממליצים על השימוש של דור droplet אוטומטית, כאשר היא זמינה. אם העברת ידנית שנוצר על ידי טיפות, להיות בטוח לבחור את הטיפים נשא רחב מומלץ ולהעסיק זהיר בטכניקה pipetting. העברת droplet דורש איטי והשאיפה ומקבלים, בכל מקום לקחת יותר מ 5-6 שניות, וזה חיוני כי הפתח עצה פיפטה לא לגעת הדיו droplet או טוב. כאשר מחלק, שמור על קצה פיפטה ברמת נוזלי, אעלה את זה לאט. כמו טיפות הם ויתרו (תצוגת וידאו להדגמה). הדוגמה מגרש 2D הסופי מדגים חוסר הפרדה בין האוכלוסיות droplet חיוביים ושליליים (איור 4D). זה יכול להיות מספר סיבות. מעכבי PCR חזקה, כגון דטרגנטים בשימוש פירוק מאגרי עודף של הדנ א פגום מאוד, יכול לגרום לאובדן של הפרדה. במקרה זה, שקול להוסיף צעד לנקות בין cDNA סינתזה dPCR (כגון המתוארות בתוך בשלב 5 של פרוטוקול זה). בסופו של דבר, חוסר ההפרדה ניתן גם בשל תנאי הגברה תת אופטימלית, אופטימיזציה של השלב ה-PCR צריך להיות גם נחשב.
נתונים בתוך איור 5 מייצגים 984 בעולם האמיתי החולה לטעום סיבוב פעמים ומדגים את אופי זרימת עבודה זו בדיקה מהירה. תוצאות דווחו על הרופא המטפל מוקדם כמו בתוך 48 שעות (79% מהמקרים) קבלת דגימות ו ב 95% מהמקרים, בתוך 72 שעות. לסיכום, השימוש התייצב במחזור ה-RNA דם אוסף צינורות, RNA ממוטבת מיצוי הליכים מן הדם, ו- RT-dPCR לפעול על-פי פרוטוקול ממוטבת עם המתאים פנימי ופקדי אצווה, יכול לספק מערכת בדיקה מהירה זיהוי מדויק של פיוז'ן RNA משתנים רלוונטיים ב NSCLC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2.jpg"> איור 1 : סקירה של דם דוגמת עיבוד השלבים לגילוי Variant היתוך באמצעות מבחני ספציפיים ביותר ונפוצים RET, גרסאות ROS1 ב NSCLC. (א) בדיקה של דגימות מתחילה כאשר דם משורטט, BCT נשלח בתוך ערכת איסוף הדגימה למעבדה קלינית. במחזור ה-RNA הוא התאושש ממקורות מרובים בתוך פלזמה מועשרת טסיות, הפוכה עיבד עם גנים ספציפיים לקרקע, מטוהרים לשימוש ב- dPCR. דוגמאות מעובדות באמצעות מערכת זמינים מסחרית, אשר מורכב של droplet דור (אמולסיה), הגברה וספירת droplet. ניתוח המידע באמצעות תוכנה זמינים מסחרית. תוצאות הבדיקה ואז מתועדים, דיווח על חזרה לרופא. מבקש בדיקה. התהליך מיועד לפעול בתוך פרק זמן של 72 שעות מעת קבלת דגימות למהדורה תוצאה. שמונה גרסאות עבור ROS1 (B) ו- (ג) RET מכוסים בתוך מבחני מרובבת. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig2.jpg"> איור 2 : אימות אנליטית. שורות תאים לבטא (א) SDC4-ROS1 פיוז'ן ופיוז'ן CCDC6 (B)-RET היו מעורבבת עם רקע של RNA פראי-סוג האדם הכולל (WT RNA). עם כל משתנה פיוז'ן, המגבלה של זיהוי הוקמה באמצעות קריטריונים מוגדרים מראש עבור כל assay משתנה תדר משתנה של 0.2%. כל הדגימות מעל הסף הזה הכיל גם עותקים לפחות 21 של בקרת גנים. תקן EML4-ALK (ALK) 5% על רקע של RNA פראי-סוג נבחנה להדגים ירידה לפרטים assay, אשר אושר ע י תוצאה שלילית. סטנדרטים אנליטיים RNA מרובבת נמדדו ב גבוהה, בינונית, ריכוזים נמוכים עבור ROS1 (ג) ו- (ד) מיל' דיוק הוערך מעל שלושה מסלולי באותו יום (אינטרה-יום), פועל שלוש על שלוש יממות (inter-יום), ועם מפעיל עצמאי שני (inter-מפעיל). אמצעי העתקה מספר ואת סטיות תקן מוצגים. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig3.jpg"> איור 3 : עיבוד שליטה דוגמאות ונתונים חוסן אצווה. 2D חלקת dPCR assay ROS1 מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (א), (B) אין רוורס טרנסקריפטאז ומערכת בקרת (C) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (D) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותק מספר + /-סטיות תקן ROS1 חיובי הבקרה היו 439 + /-141. אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, אלה היו כל שלילי (נתונים לא מוצג). 2D חלקת dPCR assay רט מרובב תוצאות עבור שליטה חיובית (E), (F) אין רוורס טרנסקריפטאז בקרה, (G) אין שליטה תבנית הרנ א. פקדים (H) היו להפעיל על 21 ימים רצופים (למעט בסופי שבוע ובחגים). התכוונתי עותקים + /-סטיות תקן רט חיובי הבקרה היו 586 + /-182. לא מוצגות אין רוורס טרנסקריפטאז ופקדים תבנית לא היו גם להפעיל בכל יום, היו שליליות. הותאם מהאתר Biodesix עם הרשאה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig4.jpg"> איור 4 : פתרון בעיות RT-dPCR. 2D מתווה וייצוג dPCR תת אופטימלית התוצאות המתקבלות כאשר יש זיהום () בתוך אין transcriptase הפוכה הפקד, זיהום (B) בתוך אין RNA הפקד, (ג) הטיה, התגבשו של טיפות, (D ) לקוי ממוטב PCR תנאים או עיכוב PCR. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57079/57079fig5.jpg"> איור 5 : משך העבודה (TAT). תאת (בשעות) נערך עבור בדיקות מבקש של variant RNA (n = 984). נתונים לא כולל סופי שבוע, חגים וימי דגימות הוחזק &gt; 24 שעות בשל מידע קליני לא שלם על טופסי בקשה בדיקת המעבדה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57079/57079fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57079/57079table1.jpg"> טבלה 1: הכנה של שעתוק במהופך ריאגנטים בקרות תהליכים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיב</td>
			<td>נפח</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x dPCR supermix על הגששים (לא 2'-deoxyuridine 5'-טריפוספט)</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x היעד משתנה תחל/רגשים להגדיר (450 nmol/L תחל 250 בדיקה FAM nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x ערכת הבקרה היעד תחל/בדיקה (450 nmol/L תחל 250 בדיקה HEX nmol/L)</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>נוקלאז ללא מים</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA</td>
			<td>7 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הכנה של המיקס מאסטר dPCR.
<table border="1" fo:display-align="center" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>רכיבה על אופניים שלב</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td># מחזורים</td>
			<td>כבש שער</td>
		</tr>
<tr>
<td>הפעלת אנזים</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="4">~ 2 oC/s</td>
		</tr>
<tr>
<td>דנטורציה</td>
			<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td rowspan="2">40</td>
		</tr>
<tr>
<td>חישול/הרחבה</td>
			<td>55 ° C</td>
			<td>1 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>ביטול הפעלה של האנזים</td>
			<td>98 ° C</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>החזק (אופציונלי)</td>
			<td>4 ° C</td>
			<td>אינסוף</td>
			<td>1</td>
			<td>~ 1 oC/s...</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: תנאי הרכיבה תרמי.

זיהוי של מחזורי חומצה ריבונוקלאית (קרנה) מהדם נמצא צורך בתוכנית האבחון הקליני. כאן נתאר שיטות המאפיינות את קרנה של חולי סרטן ריאות שאינם קטנים התא באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי רגיש וספציפי. הבדיקות בדרישות עיצוב לאתר גרסאות פיוז'ן בתוך 72 שעות.

דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

We have developed novel methods for the isolation and characterization of tumor-derived circulating ribonucleic acid (cRNA) for blood-based liquid biopsy. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא בידוד ואפיון על ידי PCR דיגיטלי טיפתי של חומצה ריבונוקלאית שמקורה בגידול מדגימות דם מלאות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האבחון האונקולוגי. כגון כיצד לזהות טרנספיסטים של היתוך גנים שמקורם בגידול מדגימות RNA ודם במחזור הדם.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בשיטות מותאמות ביותר לייצוב, מיצוי וזיהוי של וריאנטים של RNA הקיימים בתדירות נמוכה ובדגימות דם. בדיקות מבוססות דם הן השלמה לביופסיות רקמות מסורתיות עם היתרון של שימוש בטכניקה זעיר פולשנית שיכולה לספק תוצאות מהירות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מוטציות משמעותיות מבחינה קלינית, ו-NSCLC, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות שבהן יש צורך בזיהוי נגיש ומהיר של מולקולות RNA במחזור בדם מלא.RNA במחזור עבור תגובת השעתוק ההפוך מבודד מדגימות דם מתורמים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. המר את דגימת ה-RNA המרוכזת במחזור ל-cDNA באמצעות ערכת תגובת שעתוק הפוך זמינה מסחרית, כולל פריימרים אקראיים. כלול דגימת בקרה ללא טרנסציפטאז הפוך ודגימת בקרת ללא RNA.לאחר השלמת תגובת השעתוק ההפוך, בודד cDNA מתערובת התגובה, באמצעות עמודת ספין של רכז DNA זמין מסחרית. שלב זה מקל על הסרת אנזימים, פריימרים וטריפוספטים חופשיים של דאוקסינוקלאוטיד. אם ה-cDNA לא ישמש מיד בתגובות PCR, יש לאחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.ללבוש מעיל מעבדה לסילוק וכפפות ניטריל בזמן ביצוע הליך זה ואזור הכנת ריאגנטים ייעודי. כסו את הבדיקות כדי להגן עליהן מפני אור, מכיוון שאור עוקב יכול להלבין את הצבע הפלואורסצנטי המחובר לבדיקה. ראשית הכינו את תערובות ה-PCR לנפח תגובה סופי של 20 מיקרוליטר כפי שמצוין בטבלה זו, אך עדיין מבלי להוסיף את ה-cDNA.לאחר מכן, העבירו את התערובות, מכוסות ומוגנות מפני אור לקולט אדים נקי PCR, הממוקם באזור הגברה מקדים נפרד. מחלקים את התערובות לצלחת PCR. הוסף את ה-cDNA לבדיקה לתערובת ה-PCR.מכסים את הצלחת באיטום צלחת נשלף. צנטריפוגה קצרה של הצלחות כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הבארות. מערבבים על שייקר צלחת, על טמפרטורה נמוכה למשך 10 שניות.צנטריפוגה את הצלחות שוב לזמן קצר כדי לאסוף את הדגימות בתחתית הבאר. הסר את אוטם הצלחת לפני ביצוע ייצור טיפות ידני. חשוב למזער בועות בקצה הפיפטה בעת טעינת הדגימות ובהמשך להעביר את הטיפות לאט מהמחסנית לצלחת כדי למנוע נזק לטיפות.העבירו בזהירות 20 מיקרוליטר מתערובת ה-PCR לבארות הדגימה במחסנית יצירת הטיפות. הוסף 70 מיקרוליטר שמן ליצירת טיפות. מכסים באטם גומי ומעבירים את המחסנית למחולל טיפות ידני כדי להתחיל ביצירת טיפות.לאחר יצירת טיפות, השתמש בטיפים המומלצים על ידי היצרן להעברת טיפות ללוחית PCR טרייה. שאפו והוציאו את הטיפות לאט, במשך 5 עד 6 שניות כל אחת, מבלי לגעת בקצה הקצה למחסנית הטיפה או לצלחת. אוטמים את הצלחת בעזרת אוטם צלחת נייר כסף.בצע PCR במחזור התרמי באמצעות ההגדרות הבאות. לאחר השלמת ריצת המחזור התרמי, קרא את הצלחת באמצעות קורא טיפות. צור פריסת לוח עבור תוכנת קורא המזהה את מיקום הפקדים והדוגמאות וטען לתוכנה כדי להתחיל את הקריאה.תוצאות קריאת הלוחות מנותחות באמצעות תוכנה זמינה מסחרית. התחל בניווט לתפריט הניתוח כדי להציג עלילות משרעת דו-ממדיות או דו-ממדיות. העריכו את האיכות הכוללת של הנתונים על ידי בחינת נתוני הטיפות.באמצעות תפריט האירועים, הערך את הנתונים עבור מספרי האירועים הכוללים שהתקבלו. צריכים להיות יותר מ-10,000 אירועים לבאר. אם לא, יש להעריך בזהירות את הנתונים לאיתור בעיות נוספות.לאחר מכן, בדוק את הנתונים עבור משרעות פלואורסצנטיות מתועבות. הבדלי משרעת משמעותיים והבדלי ריכוז בין דגימות משוכפלות מצביעים על טיפול לקוי או ערבוב של דגימות. שימו לב לאשכולות טיפות עם דפוסי ריסוס על ציר של 45 מעלות, מה שמעיד על טיפות באיכות ירודה או דגימות בעייתיות.בדוק תחילה את הנתונים עבור הבקרה החיובית, ללא בקרת טרנסקריפטאז הפוך וללא בקרת RNA. בחר את כל דגימות הבקרה ובדוק את איכות האשכול לפי תרשים דו-ממדי לסף מתאים, צריכה להיות הפרדה ברורה בין אשכול הטיפות. עבור כל גרסת בדיקה, הגדר את הסף על סמך בארות בקרה.הגדר סף על חלקות דו-ממדיות באמצעות כלי הצלב כדי להפריד את אוכלוסיית הטיפות השליליות הכפולות מאוכלוסיית הגנים הבקרה על ציר ה-x, ואוכלוסיית הגנים המשתנים, אם קיימת, על ציר ה-y. כמה עותקים מכל רפליקנט היטב עבור דגימה בודדת. לבסוף, בטא את תוצאות הבדיקה כמספר עותקי הגרסאות שזוהו.שימוש בקווי תאים, המבטאים היתוך SDC4-ROS1 והיתוך CCDC6-RET, מדולל ברקע של סך כל ה-RNA האנושי מסוג הבר, גבול הזיהוי כפי שנקבע בתדירות של 0.2 אחוז וריאנט עם כל וריאנט היתוך. לא זוהה תכשיר של 5 אחוזים מ-RNA שמקורו בקו תאי המטרה, מה שמדגים את ספציפיות הבדיקה. תקני RNA מולטיפלקס אנליטי נמדדו בריכוזים גבוהים, בינוניים ונמוכים במשך שלוש ריצות באותו יום.שלוש ריצות בשלושה ימים רצופים, ועם שני מפעילים עצמאיים. התוצאות מדגימות זיהוי מדויק הן של תעתיק ההיתוך המעניין והן של גן בקרה פנימי GUSB. כל באך של דגימות קליניות הופעל גם עם בקרה חיובית, בקרת ללא טרנסקריפטאז הפוך וללא בקרת תבנית RNA.גרסאות היתוך מיוצגות לאורך ציר ה-y בעוד ש-GUSB נמצא על ציר ה-x. כאשר בקרות האצווה הוערכו במהלך 21 יום, נצפו טיפות חיוביות לאיחוי וטיפות גן בקרת GUSB עבור ROS1 ו-RET בכל הריצות. תוצאות לא אופטימליות מוצגות כאשר יש זיהום בתוך בקרת ללא טרנסקריפטאז הפוך, זיהום בתוך בקרת ללא RNA, שיתוף והתלכדות של טיפות, ותנאי PCR אופטימליים או עיכוב PCR.לאחר שליטה, ניתן לבצע את כל הפרוטוקול הזה תוך כ-12 שעות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בשיטות עבודה מומלצות לטיפול ב-RNA ובדגימות דם אנושיות. לאחר בידוד ה-RNA, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף הדור הבא על מנת לענות על שאלות נוספות כגון זיהוי וריאנטים חדשים של היתוך.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד RNA במחזור מדם מלא ופלזמה ולאחר מכן לעבד את ה-RNA המשוחזר על מנת לזהות וריאנטים נדירים במחזור כגון RET ו-ROS1. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לאיתור מוטציות הניתנות לפעולה קלינית מדם מלא. והרחבנו את השיטות הללו כדי לבחון תעתיקים מבוטאים במחזור.

a-blood-based-test-for-detection-ros1-ret-fusion-transcripts-from

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

בסרטון זה, אנו מציגים הליך שלב אחר שלב ליצירת ננו-טיפות מתחלבות לזיהוי חומצות גרעין מטרה על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית או dPCR.

תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית: שיטה ליצירת תגובות PCR ננו-טיפתיות לאיתור מוטציות סרטניות נדירות

סרטון זה מדגים PCR דיגיטלי מבוסס שבב — וריאציה של טכניקת ה-PCR הדיגיטלית השימושית בזיהוי גרסאות תמלול נדירות. תגובת ה- PCR מחולקת לחדרים של שבב ננופלואידי, שכל אחד מהם פועל כתגובה עצמאית. זיהוי אותות פלואורסצנטיים מהתאים עם מטרות מוגברות מאשר את נוכחותם של וריאנטים נדירים של תעתיק בדגימה.

PCR דיגיטלי מבוסס שבב לזיהוי וריאנטים נדירים של תעתיק באמצעות שבב ננופלואידי

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

מתוארת שיטה רגישה ומדויקת לכימות מיקרו-רנ"א נטול תאים באמצעות כימיה מבוססת צבע וטכנולוגיית PCR דיגיטלית טיפות.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

כתב היד מתאר מבוססי שבב דיגיטלי PCR assay לזהות נדיר CDH1 התעתיק variant (CDH1a) רגילה מוקפאות ורקמות הגידול המתקבל בחולים עם סרטן קיבה.

זיהוי של Variant התעתיק נדיר CDH1 ברקמות מוקפאות סרטן קיבה על ידי מבוססי שבב דיגיטלי PCR

מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.

PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את רמת הביטוי של מחזורי microRNA (miRNAs) בדגימות הפלסמה של חולי סרטן. בפרט, השתמשנו ערכת זמינים מסחרית עבור מחזור miRNA החילוץ, שעתוק במהופך. לבסוף, ניתחנו את פאנל של 24 miRNAs שנבחר באמצעות לוחות מותאמים אישית בדיקה מראש הבחין בזמן אמת.

זיהוי של לוח מותאם אישית MicroRNA במחזור בחולים עם סרטן המעי הגס גרורתי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחשת הבידוד של תאי סרטן נדירים מדגימה מלאכותית המכילה דם מלא ועם זיקוקים בתאי סרטן הריאות. הפרוטוקול עושה שימוש בפלטפורמת בידוד תאים חצי-אוטומטית וללא תוויות. תאים מועשרים נבדקים לאחר מכן לאיתור מוטציות בקולטני פקטור גדילה אפידרמלי באמצעות PCR דיגיטלי של טיפות.

פרופיל מוטציות DNA בקולטני גורם גדילה אפידרמלי בתאים נדירים במחזור באמצעות מערכת בידוד תאים ו-PCR דיגיטלי בטיפות

למד לבודד ולזהות RNA מסתובב מדגמי דם של חולי NSCLC באמצעות ddPCR. שיטה זו מאפשרת איתור מהיר של שילובי גנים ROS1 ו-RET בתוך 72 שעות, ומספקת כלי אבחנתי לא פולשני לזיהוי מוטציות קליניות בסרטן הריאה.

דם מבוסס מבחן איתור ROS1 ואת RET פיוז'ן תעתיקים מלהסתובב חומצה ריבונוקלאית באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי

גלה סרטונים נוספים