Name: Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: למדו פרוטוקול ChIP לניתוח שינויים בהיסטונים ב-Saccharomyces cerevisiae. השיטה מאפשרת לקבוע את שפע השינויים ואת מיקומם באזורים גנומיים ספציפיים, ולחקור את הקשר ביניהם לבקרת תביעת גנים בתנאי סביבה שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ירוק לדיונים מועיל. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים NIH R03AG052018 ו- R01GM124342 כדי E.M.G.

1. מראש לאגד נוגדנים כדי Beads מגנטי
<ol>
	<li>מערבבים היטב את חלבון A/G beads מגנטי ולהעביר µL 20 של beads מגנטי לכל אחד immunoprecipitation (IP) מדגם צינור 1.5 מ. הערה: כאשר pipetting חרוזים, השתמש בעצות נשא רחב, נמוך-השמירה.</li>
	<li>למקם את הצינור עם חרוזים עמדה מגנטי ולאפשר חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים 3 פעמים עם 1 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה טריס (TBS) (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl).</li>
	<li>להוסיף 200 µL של TBS חרוזים, הכמות המתאימה של נוגדן. סובב ב rpm 8 בן לילה ב 4 º C. הערה: עבור רבים היסטון PTM נוגדנים, 1-3 µg של נוגדנים לכל IP מספיקה. עם זאת, ניסויים טיטור מומלצים לקביעת ריכוזים המתאים. ריכוזי המומלצת עבור מסחר, מאופיין היטב היסטון PTM נוגדנים לעיתים קרובות מדויק, ניתן למצוא דיווחים שפורסמו או מסמכי מוצרים.</li>
	<li>הכנס את החרוזים עמדה מגנטי ולהסיר את תגובת שיקוע. לשטוף אותם עם 1 מ"ל של TBS.</li>
	<li>Resuspend את החרוזים µL 20 של TBS IP לדגימה בתוספת של µL 5 נוספים (במקרה של שגיאה pipetting) של TBS. הערה: החרוזים ניתן לאחסן לטווח קצר ב 4 ° C עד השימוש.</li>
</ol>
2. לגדל תאי שמרים.
<ol>
	<li>לחסן 10 מ"ל של YPD (תמצית שמרים 10%, 20% peptone ו- 20% דקסטרוז) עם מושבה בודדת של המתח המתאים, לגדל את זה ב 30 מעלות צלזיוס לילה ב חממה חזק-220 סל"ד.</li>
	<li>מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של התרבות שמרים באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תרבות יתר600 = 0.2 ב- 100 מ ל בקבוקון חדש YPD.</li>
	<li>לגדל את התאים ב- 30 מעלות צלזיוס חממה חזק-220 סל"ד עד שיגיעו יומן באמצע שלב (OD600 = 0.6-0.8).</li>
</ol>
3. in Vivo Crosslinking של חלבונים ל- DNA
<ol>
	<li>כאשר תרבויות מגיעים יומן באמצע שלב, להוסיף מ 2.7 ל 37% פורמלדהיד ישירות אל המדיום, עבור ריכוז סופי של 1% פורמלדהיד. להעביר את הבקבוקון מטרף-25 ° C (או בטמפרטורת החדר), לנער את זה ב-50 סל ד למשך 15 דקות.</li>
	<li>הוסף 5 מ של 2.5 מטר גליצין למדיום ולהמשיך רועד ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להרוות את הפורמלדהייד.</li>
	<li>העבר את התאים כדי צנטריפוגה בקבוקים, לסובב את התאים ב 5800 g x עבור 5 דקות ב 4 º C. Decant תגובת שיקוע.
	<ol>
		<li>לשטוף את התאים על ידי resuspending אותם ב- 45 מ של TBS קר ולהעביר את המתלים לתוך צינור חרוטי 50 מ. לסובב את הצינור ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>שטיפת שהתאים 10 מ"ל של קור צ'יפ פירוק מאגר (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 150 מ מ NaCl, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), nonidet 1% תמצית phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), המאוחסנים ב 4 ° C).</li>
		<li>לסובב את התאים ב 2800 g x עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע. הערה: התאים יכולים להיות קפוא עם חנקן נוזלי, המאוחסנים ב- 80 ° C עד עיבוד נוסף.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. הפוך שמרים Lysates
<ol>
	<li>Resuspend התאים 1 מ"ל קר מאגר פירוק שבב עם 1 מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF), 1:1,000 דילול של מעכב פרוטאז שמרים קוקטייל. להעביר את המתלים צינור פקקי בורג 2.0 mL המכיל 200 µL של חרוזי זכוכית.</li>
	<li>העבר את התאים חרוז להכות מכשירי עצבנות במהירות גבוהה ב 4 ° C והיכו חרוז 6 פעמים במשך 30 s כל. שמור את התאים על קרח לפחות 1 דקות בין כל חרוז פועם.</li>
	<li>להעביר את lysate אל צינור 1.5 mL באמצעות ג'ל טעינת טיפים. Centrifuge lysate-g x 15,500 עבור 20 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב µL 250 MNase עיכול מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, 21 מ מ CaCl2, 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C) על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להוסיף 2.5 µL של MNase התגובות. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה אותו באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות. הערה: תקציר תנאים צריך להיות מותאם כאשר מלאי חדש של MNase משמש. ראה שלב 10 לפרוטוקול.</li>
	<li>מיד במקום הצינורות על קרח כדי לעצור את התגובה ולהוסיף 5 µL של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ EDTA. מערבבים בעדינות אותם על-ידי היפוך.</li>
	<li>Centrifuge את התגובה ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ. הערה: מסיסים כרומטין (מתעכל) יהיה תגובת שיקוע. בגדר מכיל שאריות תאים מעוכל משהו ואני לא מסיסים.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) שונו שינויים היסטוניים
<ol>
	<li>לקבוע ריכוז חלבון של כל שבר כרומטין שפורסמו MNase שימוש assay ברדפורד. להוסיף 1 מ"ל של ברדפורד מגיב אחד של וואקום חד פעמיות 8 בתוספת 1 cuvette נוספים עבור כל דגימה חלבון להיבדק.
	<ol>
		<li>להכין פתרון מניות של 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA).</li>
		<li>הוסף את אמצעי האחסון המתאים כדי להשיג את ריכוזי BSA. הבאים ב- 1 מ"ל של ריאגנט ברדפורד: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL, μg/מ"ל. להוסיף 2 μL של השבר כרומטין שפורסמו MNase כימיקלים נוספים.</li>
		<li>לכסות את החלק העליון של כל cuvette עם חתיכה קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים, היפוך וואקום של 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה של וואקום בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>באמצעות ספקטרופוטומטרים אור, גלוי למדוד את ספיגת-595 nm עבור עיקול רגיל ודגימות ניסיוני. הערה: השתמש את cuvette ללא BSA (0 μg/mL) כדי בלנק את ספקטרופוטומטרים לפני נטילת המדידה הראשונה.</li>
		<li>להתוות עקומה רגיל באמצעות הערכים ספיגת ריכוזים שונים של BSA בתוכנה המקושרת את ספקטרופוטומטרים או תוכנת הגיליון האלקטרוני. בהתבסס על העקומה סטנדרטי, הגורם דילול בשימוש (שבערך), להשתמש בערכים ספיגת לחישוב ריכוז חלבון עבור כל אחת הדגימות שבר כרומטין.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>עבור כל IP, להוסיף 50 µg של חלבון הכולל השבר כרומטין שפורסמו MNase למאגר פירוק שבב להגיע נפח סופי של 1 מ"ל. הערה: אם הגדרת IP אחד או יותר לכל lysate, להפוך את תערובת הבסיס של lysate, צ'יפ פירוק מאגר ו- aliquot 1 מ"ל עד צינורות בודדים עבור ה-IP.</li>
	<li>הסר 100 µL המיקס IP כדי התהליך כמו הדוגמה קלט. להקפיא את הדגימה קלט ב-20 ° C עד שלב 7.1. הערה: דוגמה כרומטין הנותרים יכולים גם להיות קפוא ב-20 ° C, המשמש IP הבאים במקרה הצורך.</li>
	<li>הוסף 20 µL של חלבון A/G beads מגנטי מראש קשורים נוגדנים כדי כל מדגם ה-IP.</li></ol>לסובב דגימת ה-rpm 8 עבור 3 h (סטנדרטי) או למשך הלילה (אם מועדפת) ב 4 º C.

6. לשטוף את כתובות ה-Ip ואת Elute מתחמי היסטון-DNA
<ol>
	<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי ותנו חרוזים לאסוף בצד של הצינור. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה. לשטוף את החרוזים במרוכז עם 1 מ"ל של כל אחד המאגרים להלן.
	<ol>
		<li>לבצע כל כביסה על-ידי מסתובב ב rpm 8 עבור 5 דקות ב 4 ° C, הצבת חרוזים עמדה מגנטי, הסרת תגובת שיקוע והוספת מאגר הבא: 2 x - מאגר פירוק שבב, 2x - מאגר שטיפת מלח גבוהה (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 500 מ מ NaCl, 1 מ"מ EDTA 1% NP-40, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - LiCl/סבון שטיפת מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 250 מ מ LiCl, 1 מ"מ EDTA, 1% NP-40, deoxycholate 1% נתרן, המאוחסנים ב 4 ° C), 1 x - TE (10 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 1 מ"מ EDTA, המאוחסנים ב 4 ° C), ו- x 1 - טה.</li>
		<li>עם שטיפת טה האחרון, העברת חרוזי צינור באמצעות 0.5 מ של טה להעברת רוב החרוזים, ואז עוד 0.5 מ"ל של טה שטוף הצינורית ולהעביר החרוזים הנותרים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להוסיף 250 µL צ'יפס טרי • תנאי מאגר (1% מרחביות, 1 מ NaHCO3). מערבולת הפתרון בקצרה. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>למקם את צינור עמדה מגנטי ולאסוף את החרוזים. בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור ולהימנע החרוזים. הערה: eluate מכיל חלבונים immunoprecipitated אנ-איי.</li>
	<li>להוסיף עוד 250 µL שבב • תנאי מאגר חרוזים. לסובב את הדגימות-סל ד 8 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להעביר בזהירות את תגובת שיקוע הצינור המכיל את • תנאי הראשון. במידת הצורך, הסר אמצעי אחסון קטן יותר (240 µL) עבור כל כתובות ה-Ip שלא להפריע למטופלים את החרוזים.</li>
</ol>
7. הפוך חלבון-DNA Crosslinks
<ol>
	<li>להפשיר את דגימות קלט ולהוסיף 400 µL שבב • תנאי מאגר כל קלט.</li>
	<li>הקלט והן דגימות ה-IP, להוסיף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של 20 מ"ג/מ"ל גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase ק. לערבב היטב על ידי היפוך או מצליף צינורות. דגירה בדגימות באמבט מים 65 ° C בין לילה.</li>
</ol>
8. לטהר ולרכז את הדנ א
<ol>
	<li>להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל RNase A קלט ודוגמאות IP. דגירה בדגימות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף µL 600 של פנול: chlorofrom:isoamyl אלכוהול (25:24:1 PCI) לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. לסובב אותם ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>להסיר את שכבת מימית כדי צינור חדש. להוסיף µL 600 של PCI ומערבבים אותם היטב. לסובב את הצינור ב- g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את השכבה המימית צינור חדש. התראה: לעבוד בשכונה fume, ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כאשר עובדים עם PCI. השלך פסולת נוזלי ומוצק שהומלץ על ידי המוסדיים הנחיות.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים לערבב הפתרון טוב. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
	<ol>
		<li>לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>לשטוף את צניפה ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. לסובב אותו ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>מילה נהדרת כדורי בשכונה במשך כ 20 דקות (עד יבש לחלוטין). Resuspend דגימות ה-IP ב- 50 µL של נוקלאז ללא מים, resuspend דגימות קלט ב 100 µL של נוקלאז ללא מים. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד ביצוע qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. כמותיים PCR (qPCR) כדי לזהות מועשר אזורים גנומית
<ol>
	<li>להפוך את תערובת הבסיס qPCR עבור כל ערכה של צבעי יסוד. תגובה אחת מכילה 5 µL של תערובת x qPCR 2, µL 0.25 של 20 מיקרומטר פריימר לפנים ו 0.25 µL של 20 מיקרומטר פריימר הפוכה. הערה: פריימר מתאים לעיצוב ובדיקה עבור ניסויים qPCR הם תיארו במקום14,15,16.</li>
	<li>להפוך תערובות מאסטר הדנ א כל מדגם ה-DNA. תגובה אחת מכיל 0.5 µL של ה-DNA µL 4.0 של נוקלאז ללא מים.</li>
	<li>להוסיף µL 5.5 של המיקס מאסטר פריימר מתאים ו- 4.5 µL של המיקס הבסיס המתאים DNA מכל קידוח על צלחת qPCR 384-. טוב. הערה: להתחיל עם הוספת 5.5 µL של המיקס תחל בכל טוב. לסובב את הצלחת ב g x 200 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 4.5 µL של המיקס הדנ א.</li>
	<li>דבקים החותם צלחת, ספין-200 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבצע qPCR באמצעות מערכת qPCR בזמן אמת עם התנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 40 מחזורי 95 ° C עבור 10 s, 55 ° C ל 30 s; עקומת ההיתוך 65 ° C עד 95 ° C עם גידול של 0.5 ° C, 5 s.</li>
	<li>עבור כל זוג פריימר, לחשב את הקלט אחוז של המדגם IP ביחס המדגם קלט 5% בשימוש qPCR. השתמש אמצעי triplicates ה-PCR טכנית לבצע את החישובים. הערה: אם ניכר וריאציה הוא ציין את triplicates ה-PCR, מומלץ לחזור על qPCR עם תשומת לב מיקס מאסטר קומפוזיציה, pipetting שגיאות של זיהום צולב בין בארות בצלחת 384-. טוב.<ol>
		<li>התאם את הערכים סי על המידע ל- 100% על-ידי הפחתת מספר מחזורים המייצג את הגורם לדילול מתוך הערכים סי raw. הערה: חמישה אחוזים קלט מייצג גורם לדילול של 20-fold, אשר שווה ל 4.32 מחזורים (כניסה2 20 = 4.32).</li>
		<li>לחשב את אחוז קלט כ- 2 ^ (סיקלט - סיIP) מוכפלים ב- 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. לקבוע תנאים תקציר MNase (מומלץ מראש הראשון מלא שבב ניסוי)
<ol>
	<li>בצע את שלבים 2.1 דרך 4.4 של הפרוטוקול הקודם. קנה המידה של פרוטוקול לייצר מספיק lysate עבור מספר דוגמאות MNase עיכול בגדר המכילות כרומטין. שלב 4.4, resuspend כדורי ב- mL 1.25 MNase עיכול המאגר. Aliquot הדגימות 5 מנורות אז כי כל אחד מכיל 250 µL של בגדר כרומטין resuspended במאגר עיכול MNase.</li>
	<li>להוסיף 0, 1.5, 2.5 או 5 µL של MNase על כל שפופרת. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך 4 - 6 פעמים מיד דגירה הצינורות בתוך אמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.</li>
	<li>להפסיק תגובות על-ידי הנחת צינורות על הקרח מיד והוספת µL 5 של EDTA 0.5 M עבור ריכוז סופי של 10 מ מ.</li></ol>מערבבים בעדינות את הפתרון על-ידי היפוך.
	<li>Centrifuge הצינורות ב g x 15,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C, להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ.</li>
	<li>להוסיף מרחביות 1% ריכוז סופי (25 µL של 10% הפתרון מניות) ו- NaHCO3 כדי ריכוז סופי 0.1 M (25 µL של פתרון מניות 1 מ') הדגימות בתוך הצינורות 1.5 mL.</li>
	<li>הוסף 20 µL של NaCl 5 מ', µL 5 של גליקוגן ו 12.5 µL של 20 מ"ג/מ"ל proteinase K הדגימות בתוך הצינורות 1.5mL. תדגור אותם ב 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה</li>
	<li>להוסיף 10 µL של RNaseA 10 מ"ג/מ"ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>להוסיף 300 µL של PCI לתמיסה מימית ומערבבים אותם היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
	<ol>
		<li>להסיר שכבה מימית כדי צינור חדש. להוסיף 300 µL של PCI ומערבבים היטב. ספין-g x 15,500 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר שכבה מימית צינור חדש.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>הוסף 0.1 x נפח של 3 מ' סודיום אצטט (בדרך כלל µL ~ 30) 1 מ"ל אתנול 100% קר, כדי לזרז את ה-DNA. היפוך הצינור 4 - 6 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה בן לילה את הצינור ב- 80 ° C 1 h או-20 ° C.
	<ol>
		<li>לסובב את הצינור ב g x 15,500 כעשרים דקות ב 4 º C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע עם פיפטה.</li>
		<li>לשטוף את כדורי ב 1 מ"ל אתנול 70% קר. ספין ב 15,500 g x 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>תן שכדורי מילה נהדרת. את הוד כ 20 דקות (או עד יבש לחלוטין). Resuspend כדורי ב 30 µL של נוקלאז ללא מים.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>להוסיף את ה-DNA בטעינת צבע, להפעיל 20 µL agarose 2% ג'ל להמחיש מתעכל הדנ א.</li>

<ol><li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+Your+Own+Adventure%3A+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li>
<li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Lefrançois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+yeast+ChIP-Seq+using+multiplex+short-read+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 37(2009).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAP-MS%3A+a+method+for+identification+of+proteins+and+histone+posttranslational+modifications+at+a+single+genomic+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li>
<li>Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+systems+approaches+for+the+analysis+of+histone+modification+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout.</a> Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li>
<li>Meluh, P. B., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+analysis+of+yeast+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunological analysis of yeast chromatin.</a> Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).</li>
<li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).</li>
<li>Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li>
<li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li>
<li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p%3A+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li>
<li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li>
<li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3%27-end+antisense+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).</li>
<li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li>
<li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li>
<li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעיל של DNA המשויכים ששונה שינויים היסטוניים בתאים שמרים על-ידי immunoprecipitation. זה מלווה qPCR באמצעות תחל אשר להגביר את האזורים עניין לקבוע העשרה המקומיים או דלדול של שינויים ספציפיים היסטון. למרות מפותח כשיטה לפני כמעט 20 שנה, שבב עדיין וזמינותו המכונן על חקירת מצב שינוי היסטון אזורים שונים גנומית, בתנאים מגוונים. למרות שבב מצמידים הדור הבא טכנולוגיות רצף שניתן לחקור היסטון שינויים ברמת הגנום בקנה מידה6,7, עלויות וניתוח הנתונ...

השינוי post-translational דינמי (PTM) של שינויים היסטוניים הוא מנגנון רגולטורי מפתח עבור תהליכים תבניות DNA רבים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2. היכולת לקבוע את השפע ואת לוקליזציה מדויק של שינויים היסטוניים ששונה והמצוות בתהליכים אלה ולכן קריטי להבנת שלהם תקנה בתנאים שונים בתא. הפיתוח של כרומטין immunoprecipitation (chIP) כשיטה בעיקר נבעה מחקרים ביוכימיים של האינטראקציות של חלבונים עם ה-DNA, במיוחד במבחנה שיטות שימוש crosslinkers כימיים, בשילוב עם הצורך להעריך באופי הדינמי של חלבון-DNA אינטראקציות ויוו ועל אזורים ספציפיים של גנום3,4,5. קידום של ה-PCR כמותי (qPCR), טכנולוגיות רצף התרחב גם את היכולת לבצע ניסויים שבב עם השוואות כמותיים ועל -פני כל הגנום, שהופך אותו לכלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות חלבון-דנ א- רמות מרובות.
כיום, השבב הוא שיטה נדרש עבור כל קבוצת המחקר מתעניין בתיווך כרומטין רגולציה של הגנום כפי ישנן שיטות דומות לא ישירות חוקר את הקשר הפיזי בין של היסטון ששונה מסוים גנומית לוקוס ב ויוו. למרות וריאציות של שיטה זו באמצעות רצף הדור הבא כדי למפות היסטון שינויים בכל רחבי הגנום6,7 זמינים, גישות אלה רשאי לפנות שאלות מדעיות שונות, קנה המידה שלהם, עלות והגבלת משאבים טכניים עלולה להיות לכמה קבוצות מחקר. בנוסף, יישוב שבב-qPCR יש צורך להשלים את אלה גישות על-ידי מתן שתי שיטות לייעל את פרוטוקול שבב לפני רצף וכדי לאמת תוצאות epigenomic datasets. ספקטרומטר מסה גישות מבוססות על זיהוי מגוון היסטון סימנים הקשורים עם אזורים גנומית יש גם הופיעו8,9,10,11, עם זאת, אלה גישות יש כמה מגבלות לגבי אשר אזורים בגנום פתור והן דורשות מומחיות טכנית ומכשור לא יהיה זמין כל קבוצות מחקר. לכן, שבב נשאר שיטה למעין לניתוח את השפע ואת ההפצה של היסטון שינויים בתנאים מגוונים עבור כל קבוצות מחקר אפיגנטיקה, כרומטין, ברגולציה של פונקציות גנומית.
כאן, אנו מתארים שיטה עבור השבב באמצעות שמרים ניצני דגם האפייה (cerevisiae ס) לחקור את ההפצה של היסטון PTMs-כרומטין. גישה זו נסמכת על מספר רכיבים מרכזיים של פרוטוקולים השבב פותח שמרים וחלים גם מודל מגוון מערכות12,13. אינטראקציות בין שינויים היסטוניים שונה ל- DNA בתא נשמרים על ידי crosslinking עם פורמלין. בעקבות הכנה lysate, שברי כרומטין solubilized לחלקים בגודל אחיד על ידי עיכול עם נוקלאז micrococcal. Immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מתבצע באמצעות נוגדנים או מסחרי או שנוצרו על-ידי מעבדה, אנ-איי הוא מבודד וניתח העשרה על אזורים מסוימים גנומית באמצעות qPCR (איור 1). עבור שינויים רבים היסטון, כמות ה-DNA המתקבל פרוטוקול זה מספיקה לבדיקה יותר מ 25 לוקוסים גנומית שונים על ידי qPCR.
שיטה זו שבב היא רב תכליתי עבור ניטור ההתפלגות של שינוי היסטון יחיד על-פני מספר זנים מוטציה או תנאים סביבתיים, או לבדיקת שינויים מרובים היסטון בתאים wildtype במספר רב של לוקוסים גנומית. יתר על כן, רכיבים רבים של הפרוטוקול הם מתכוונן בקלות כדי למטב את זיהוי סימני מאוד - או נחות-בשפע גם היסטון. בסופו של דבר, מבצע שבב של שינויים היסטוניים ששונה ניצני שמרים מספק את ההזדמנות לשימוש בפקדים מפתח נוגדנים ירידה לפרטים שאינם זמינים בעיקר במערכות אחרות. כלומר, זני שמרים ניתן להפיק שנושאים מוטציות נקודה ב שאריות היסטון זה מיועדים להחלת השינוי, במקרים מסוימים, יש רק אנזים יחיד זה מזרז את השינוי על משקע היסטון מסוים (למשל-היסטון ליזין methyltransferases). לכן, שבב יכול להתבצע גם היסטון מוטציה או אנזים מחיקה זנים כדי assay במידה שאליו שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן עשוי להיות המתרחשים ותפיק תוצאות חיוביות שגויות. פקד זה חשובה במיוחד עבור פיתח נוגדנים, אפילו יכול לשמש כדי לאמת ירידה לפרטים נוגדנים עבור השינויים שנשמרת היסטון לפני השימוש במערכות אחרות. גישה זו משלימה שיטות אחרות כדי לבדוק נוגדנים ירידה לפרטים להבחין בין מדינות שונות שינוי (כגון מונו-, די - tri-מתילציה), לרבות חקירת מערכים של פפטידים ששונה וביצוע שהכלים המערבי של שינויים היסטוניים או נוקליאוזומים עם שינויים מוגדר. בסך הכל, לשבב ניצני שמרים היא שיטה חזקה עבור הערכת את הדינמיקה של היסטון PTMs ברחבי הגנום, לנתח את המנגנונים השולטים שלהם.

<table><tbody><tr>מוצרי מחקר <td>תמצית שמרים</td><td>בינלאומי (RPI)</td> <td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr>מוצרי מחקר<td>פפטונים</td><td>בינלאומיים (RPI)</td> <td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-נונילפניל-פוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>74385</td><td>שווה ערך ל-NP-40</td></tr><tr><td></td><td>MgCl ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>אמרסקו</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שמרים</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 פנול: 24 כלורופורם: 1 אלכוהול איזואמיל</td><td>VWR מדעי החיים</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא גרעין</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאז</td> <td>מיקרוקוקלוורת'ינגטון ביוכימיה</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ריאגנט מבחן ברדפורד</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BSA סטנדרטי 2 מ"ג/מ"ל</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&אלפא; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; מוטיב פעיל H3K4me2</td><td></td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; High Rox qPCR Mix</td><td>Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A/G חרוזים מגנטיים</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי לצינורות 1.5 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית שטופים בחומצה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microtube Homogenizer</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>2.0 מ"ל צינורות מכסה בורג עם טבעות איטום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384 בארות PCR צלחת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; שייקר רצפה ג'ירטורי</td><td>ניו ברונסוויק דגם מדעי</td><td>G10</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; מערכת זיהוי PCR בזמן אמת</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitation כרומטין (chip) של היסטון שינויים של האפייה

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

היסטון שינויים post-translational (PTMs), כגון acetylation, מתילציה זרחון, מוסדרים באופן דינאמי על ידי סדרה של אנזימים להוסיף או להסיר את הסימנים האלו בתגובה לאותות שהתקבלו על-ידי התא. PTMS אלה אנו רותמים את ויסות תהליכים כגון בקרת ביטוי גנים ותיקון דנ א. Immunoprecipitation כרומטין (chIP) כבר גישה אינסטרומנטלית ניקוד את השפע ואת לוקליזציה של PTMs היסטון רבים ברחבי הגנום בתגובה לפליטת מגוונים אל התא. . הנה, מתוארת שיטה רב-תכליתי לביצוע שבב של שינויים היסטוניים post-translationally ששונה מ שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) . שיטה זו מתבססת על crosslinking של חלבונים ודנ א באמצעות טיפול פורמלדהיד שמרים תרבויות, דור של שמרים lysates מאת חרוז מכות, solubilization של כרומטין קטעים על ידי נוקלאז micrococcal, immunoprecipitation של היסטון-DNA מתחמי. DNA הקשורים עם הסימן היסטון עניין מטוהרים, שעבר ניתוח ה-PCR כמותי כדי להעריך את העשרת ב לוקוסים מרובות ברחבי הגנום. נציג ניסויים חיטוט הלוקליזציה של הסימנים היסטון H3K4me2, H4K16ac wildtype, שמרים מוטציה נידונות להפגין ניתוח נתונים ופרשנות. שיטה זו מתאימה למגוון רחב של היסטון PTMs ואת יכולה להתבצע עם זנים מוטציה או בנוכחות לחצים סביבתיים מגוונים, שהופך אותו כלי מצוין עבור חוקרים לשינויים כרומטין dynamics בתנאים שונים.

מרכיב מפתח אחד של פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של הריכוז של נוקלאז micrococcal (MNase) נעשה שימוש כדי לעכל את כרומטין לחלקים מסיסים, כפי שמתואר בשלב 10. . זה קריטי עבור קבלת נתונים ברזולוציה גבוהה ביחס להתפלגות שינויים היסטון-גנומית אזורים מעניינים רבים. טיטור MNase צריכה להתבצע כדי לקבוע ריכוז המתאימים ביותר כדי להשיג בעיקר מונו-נוקליאוזומים עם כמות קטנה יותר של די-נוקליאוזומים ב השבר כרומטין מסיסים. זה ניתן לאבחן על ידי חילוץ ה-DNA בעקבות עיכול MNase בגדר המכילות כרומטין וביצוע agarose ג...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול חיסון כרומטין זה היא לקבוע את השפע והלוקליזציה של שינויים בהיסטון באזורים מוגדרים ברחבי גנום השמרים המתהווה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות כרומטין, כגון כיצד שינויים בהיסטון קשורים לבקרת ביטוי גנים וכיצד שינויים אלה משתנים בתגובה לתנאי סביבה שונים. פרוטוקול רב תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שינויים רבים ושונים בהיסטון וזני E מרובים בו זמנית.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים בהיסטון, ניתן ליישם אותה גם לחקירת חלבוני קשר כרומטין אחרים באמצעות תגי אפיטופ או נוגדנים זמינים. התחל את ההליך הזה על ידי גידול תאי השמרים לחסן 10 מיליליטר של מדיום YPD עם מושבה אחת של כל זן מתאים, ולגדל אותו ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-220 סל"ד בן לילה. למחרת לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD600 של התרבית, יש לדלל את התרבית ל-OD600 של 0.2 ב-100 מ"ל של YPD בבקבוק חדש.לגדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-220 סל"ד עד שהם מגיעים לשלב אמצע העץ. כאשר התרביות הגיעו לשלב היומן, הוסף 2.7 מיליליטר של 37% פורמלדהיד ישירות למדיום בכל בקבוק לריכוז סופי של 1% פורמלדהיד. מעבירים את הצלוחיות לשייקר בטמפרטורת החדר, ומנערים בחום של 50 סל"ד למשך 15 דקות.הוסיפו חמישה מיליליטר של 2.5 גליצין מולרי למדיום והמשיכו לנער ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי להרוות את הפורמלדהיד. לאחר מכן, סובב את התאים ושטוף אותם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הסר את הסופרנטנט לאחר הסיבוב האחרון והמשך להכנת ליזטות שמרים.השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של משקעי אמינו כרומטין קרים או מאגר ChIP Lysis עם PMSF של 1 מילי-מולרית ודילול של 1:1000 של קוקטייל מעכב פרוטאז שמרים. העבירו את המתלה לצינור מכסה בורג של 2.0 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית. העבירו את התאים למנגנון הכאת חרוזים לתסיסה במהירות גבוהה בארבע מעלות צלזיוס.מקציפים חרוזים למשך 30 שניות וקרח למשך דקה. מכים חרוזים בסך הכל שש פעמים, ושומרים על התאים על הקרח לפחות דקה אחת בין כל פעימה של 30 שניות. בעזרת קצה טעינת ג'ל, העבירו את הליזאט לצינור של 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה את הליזאט ב -15, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של מאגר עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. הוסף 2.5 מיקרוליטר של מיקרוקוק נוקלאז לכל תגובה.מערבבים בעדינות על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים ומיד מדגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, עצור את התגובה על ידי הנחת הצינורות על קרח, הוספת חמישה מיליליטר של 0.5 EDTA מולרי לריכוז סופי של 10 מילי-מולרי EDTA וערבוב עדין על ידי היפוך. צנטריפוגה ב 15, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.לאחר מכן, העבירו כל סופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, חיוני לוודא שנעשה שימוש באותו ריכוז חלבון בכל משקעי אמינו. בהתאם למספר משקעי האמינו או תגובות ה-IP, הכינו תערובת מאסטר של כל מיקרוקוק נוקלאז ששוחרר כרומטין ומאגר ליזה ChIP והקצו מיליליטר אחד המכיל 50 מיקרוגרם של חלבון כולל לצינורות בודדים.הסר 100 מיקרוליטר מכל תערובת IP לעיבוד כדגימת הקלט. הקפיאו את דגימות הקלט ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. חשוב גם לוודא שאותה כמות של חרוזים הקשורים לנוגדנים משמשת לכל משקע חיסוני.בעזרת קצה פיפטה רחב, הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי חלבון מגנטי AG, קשורים מראש בנוגדנים לכל דגימת IP. סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. בסיום ה-IP, הנח את הצינורות במעמד מגנטי ותן לחרוזים להצטבר בצד הצינור.השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה ChIP לחרוזים וסובב בשמונה סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על המעמד המגנטי והסירו את הסופרנטנט.באופן זה, שטפו את החרוזים ברציפות עם המאגרים הבאים למספר הפעמים שצוינו. מאגר ליזה ChIP, מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת LiCl/חומרי ניקוי ו-TE. עם שטיפת ה-TE האחרונה, השתמש ב-0.5 מיליליטר TE כדי להעביר את רוב החרוזים לצינור חדש, ולאחר מכן השתמש בעוד 0.5 מיליליטר TE כדי לשטוף את הצינור ולהעביר את החרוזים הנותרים. הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP טרי לכל צינור ומערבל את התמיסה לזמן קצר.סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הנח את הצינורות במעמד המגנטי. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש והימנעו מהחרוזים.הוסף עוד 250 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP לחרוזים. סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בזהירות ומבלי להפריע לחרוזים, העבירו את הסופרנטנט לצינור המכיל את הפליטה הראשונה.הפשירו את דגימות הקלט שנאספו קודם לכן והוסיפו 400 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP לכל דגימת קלט. כדי להפוך קישורים צולבים של DNA חלבון, הוסף לדגימות קלט ו-IP, 20 מיקרוליטר של נתרן כלורי מולארי, חמישה מיקרוליטר גליקוגן ו-12.5 מיקרוליטר של Proteinase K.Mix היטב על ידי היפוך או הזזה של הצינורות. דגרו את הדגימות באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תערובת מאסטר QPCR עבור כל סט פריימרים על ידי שילוב הנפחים המתאימים של תערובת QPCR, הפריימר הקדמי והפריימר ההפוך. הכינו תערובות מאסטר DNA עבור כל דגימת DNA כאשר תגובה אחת מכילה 0.5 מיקרוליטר DNA ו-4.0 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז הוסף 5.5 מיקרוליטר מתערובת הפריימר המתאימה לכל באר בצלחת QPCR של 384 בארות. סובב את הצלחת בחום של 200 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה.לאחר מכן, הוסף 4.5 מיקרוליטר מתערובת מאסטר ה-DNA המתאימה לכל באר. אוטמים את הצלחת ומסובבים בחום של 200 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה. בצע QPCR באמצעות מערכת QPCR בזמן אמת עם התנאים הבאים, 95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ועקומת התכה של 65 מעלות צלזיוס עד 95 מעלות צלזיוס עם מרווחים של 0.5 מעלות צלזיוס למשך חמש שניות.מרכיב מרכזי אחד בפרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של ריכוז הנוקלאז המיקרוקוקלי המשמש לעיכול הכרומטין למקטעים מסיסים. דוגמה זו נובעת מאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של DNA שבודד לאחר עיכול גלולת הכרומטין עם כמויות משתנות של נוקלאז מיקרוקוקלי מראה כי 2.5 מיקרוליטר של אנזים ב-20 יחידות למיקרוליטר ייצרו בעיקר מונונוקלאוזומים. ניסוי ChIP מייצג זה השתמש בנוגדנים כנגד סמן מתיל היסטון H3K4me2 והיסטון H3 בתאי נוקאאוט מסוג בר ו-set1.תאי נוקאאוט Set1 חסרים את המתיל טרנספראז המזרז את הסימן הפסים מציינים את ההעשרה היחסית של H3K4me2 במדע הנמוך המצוין. הזן מסוג הבר הראה העשרה ברורה ל-H3K4me2 בחמשת הקצה הראשוני של שני גנים הידועים כמטרות ישירות של set1, PMA1 ו-ERG11 בעוד שלא נצפה אות בתאי נוקאאוט של set1. כצפוי, לא הייתה העשרה של סימן H3K4me2 ב-TEL07L, הביטוי של SPR3 דווח גם כמווסת על ידי set1 אך תוצאות אלה מצביעות על כך שסביר להניח שהוויסות יתרחש על ידי מנגנון שונה מאשר ב-PMA1 או ERG11.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק היטב את הנוגדן המשמש לספציפיות עם הבקרות המתאימות. אם זמין, יש לחקור אזורי בקרה חיוביים ושליליים ב-QPCR.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף GP על מנת לקבוע את הגנום על ידי התפלגות שינויים בהיסטון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות באופן עקבי את הרמות של שינויים שונים בהיסטון באזורים גנומיים ייחודיים באמצעות ניסויים מבוקרים היטב.

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

אנו מציגים שיטה לשחזור ויעילים כדי לבודד את תרבות ובתאים עצבית של רקמת מוח עובריים ופוסט עבור immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון 3 ליזין 79 dimethylation (H3K79me2) - סימן היסטון ממוקם במרחק תחום הכדוריים של היסטון 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

רגולציה של הסביבה כרומטין הוא תהליך חיוני הדרוש עבור ביטוי נאות גנים. כאן, אנו מתארים שיטה לפיקוח על ביטוי גנים דרך הגיוס של שינוי כרומטין מכונות באופן ספציפי ג'ין הפיך.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.

ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין במגנפורטה אוריזה

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

למדו פרוטוקול ChIP לניתוח שינויים בהיסטונים ב-Saccharomyces cerevisiae. השיטה מאפשרת לקבוע את שפע השינויים ואת מיקומם באזורים גנומיים ספציפיים, ולחקור את הקשר ביניהם לבקרת תביעת גנים בתנאי סביבה שונים.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

גלה סרטונים נוספים