Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה

המטרה הכוללת של פרוטוקול חיסון כרומטין זה היא לקבוע את השפע והלוקליזציה של שינויים בהיסטון באזורים מוגדרים ברחבי גנום השמרים המתהווה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בוויסות כרומטין, כגון כיצד שינויים בהיסטון קשורים לבקרת ביטוי גנים וכיצד שינויים אלה משתנים בתגובה לתנאי סביבה שונים. פרוטוקול רב תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שינויים רבים ושונים בהיסטון וזני E מרובים בו זמנית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים בהיסטון, ניתן ליישם אותה גם לחקירת חלבוני קשר כרומטין אחרים באמצעות תגי אפיטופ או נוגדנים זמינים. התחל את ההליך הזה על ידי גידול תאי השמרים לחסן 10 מיליליטר של מדיום YPD עם מושבה אחת של כל זן מתאים, ולגדל אותו ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-220 סל"ד בן לילה. למחרת לאחר מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר או OD600 של התרבית, יש לדלל את התרבית ל-OD600 של 0.2 ב-100 מ"ל של YPD בבקבוק חדש.

לגדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-220 סל"ד עד שהם מגיעים לשלב אמצע העץ. כאשר התרביות הגיעו לשלב היומן, הוסף 2.7 מיליליטר של 37% פורמלדהיד ישירות למדיום בכל בקבוק לריכוז סופי של 1% פורמלדהיד. מעבירים את הצלוחיות לשייקר בטמפרטורת החדר, ומנערים בחום של 50 סל"ד למשך 15 דקות.

הוסיפו חמישה מיליליטר של 2.5 גליצין מולרי למדיום והמשיכו לנער ב-50 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי להרוות את הפורמלדהיד. לאחר מכן, סובב את התאים ושטוף אותם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הסר את הסופרנטנט לאחר הסיבוב האחרון והמשך להכנת ליזטות שמרים.

השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של משקעי אמינו כרומטין קרים או מאגר ChIP Lysis עם PMSF של 1 מילי-מולרית ודילול של 1:1000 של קוקטייל מעכב פרוטאז שמרים. העבירו את המתלה לצינור מכסה בורג של 2.0 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר חרוזי זכוכית. העבירו את התאים למנגנון הכאת חרוזים לתסיסה במהירות גבוהה בארבע מעלות צלזיוס.

מקציפים חרוזים למשך 30 שניות וקרח למשך דקה. מכים חרוזים בסך הכל שש פעמים, ושומרים על התאים על הקרח לפחות דקה אחת בין כל פעימה של 30 שניות. בעזרת קצה טעינת ג'ל, העבירו את הליזאט לצינור של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הליזאט ב -15, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-250 מיקרוליטר של מאגר עיכול נוקלאז מיקרוקוקלי על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. הוסף 2.5 מיקרוליטר של מיקרוקוק נוקלאז לכל תגובה.

מערבבים בעדינות על ידי היפוך ארבע עד שש פעמים ומיד מדגרים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, עצור את התגובה על ידי הנחת הצינורות על קרח, הוספת חמישה מיליליטר של 0.5 EDTA מולרי לריכוז סופי של 10 מילי-מולרי EDTA וערבוב עדין על ידי היפוך. צנטריפוגה ב 15, 500 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, העבירו כל סופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. לקבלת התוצאות העקביות ביותר, חיוני לוודא שנעשה שימוש באותו ריכוז חלבון בכל משקעי אמינו. בהתאם למספר משקעי האמינו או תגובות ה-IP, הכינו תערובת מאסטר של כל מיקרוקוק נוקלאז ששוחרר כרומטין ומאגר ליזה ChIP והקצו מיליליטר אחד המכיל 50 מיקרוגרם של חלבון כולל לצינורות בודדים.

הסר 100 מיקרוליטר מכל תערובת IP לעיבוד כדגימת הקלט. הקפיאו את דגימות הקלט ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. חשוב גם לוודא שאותה כמות של חרוזים הקשורים לנוגדנים משמשת לכל משקע חיסוני.

בעזרת קצה פיפטה רחב, הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי חלבון מגנטי AG, קשורים מראש בנוגדנים לכל דגימת IP. סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. בסיום ה-IP, הנח את הצינורות במעמד מגנטי ותן לחרוזים להצטבר בצד הצינור.

השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של מאגר ליזה ChIP לחרוזים וסובב בשמונה סל"ד בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על המעמד המגנטי והסירו את הסופרנטנט.

באופן זה, שטפו את החרוזים ברציפות עם המאגרים הבאים למספר הפעמים שצוינו. מאגר ליזה ChIP, מאגר שטיפת מלח גבוה, מאגר שטיפת LiCl/חומרי ניקוי ו-TE. עם שטיפת ה-TE האחרונה, השתמש ב-0.5 מיליליטר TE כדי להעביר את רוב החרוזים לצינור חדש, ולאחר מכן השתמש בעוד 0.5 מיליליטר TE כדי לשטוף את הצינור ולהעביר את החרוזים הנותרים. הוסף 250 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP טרי לכל צינור ומערבל את התמיסה לזמן קצר.

סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הנח את הצינורות במעמד המגנטי. העבירו בזהירות את הסופרנטנט לצינור חדש והימנעו מהחרוזים.

הוסף עוד 250 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP לחרוזים. סובב את הדגימות בשמונה סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בזהירות ומבלי להפריע לחרוזים, העבירו את הסופרנטנט לצינור המכיל את הפליטה הראשונה.

הפשירו את דגימות הקלט שנאספו קודם לכן והוסיפו 400 מיקרוליטר של מאגר פליטת ChIP לכל דגימת קלט. כדי להפוך קישורים צולבים של DNA חלבון, הוסף לדגימות קלט ו-IP, 20 מיקרוליטר של נתרן כלורי מולארי, חמישה מיקרוליטר גליקוגן ו-12.5 מיקרוליטר של Proteinase K.Mix היטב על ידי היפוך או הזזה של הצינורות. דגרו את הדגימות באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תערובת מאסטר QPCR עבור כל סט פריימרים על ידי שילוב הנפחים המתאימים של תערובת QPCR, הפריימר הקדמי והפריימר ההפוך. הכינו תערובות מאסטר DNA עבור כל דגימת DNA כאשר תגובה אחת מכילה 0.5 מיקרוליטר DNA ו-4.0 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז הוסף 5.5 מיקרוליטר מתערובת הפריימר המתאימה לכל באר בצלחת QPCR של 384 בארות. סובב את הצלחת בחום של 200 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה.

לאחר מכן, הוסף 4.5 מיקרוליטר מתערובת מאסטר ה-DNA המתאימה לכל באר. אוטמים את הצלחת ומסובבים בחום של 200 גרם בטמפרטורת החדר למשך דקה. בצע QPCR באמצעות מערכת QPCR בזמן אמת עם התנאים הבאים, 95 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ו-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ועקומת התכה של 65 מעלות צלזיוס עד 95 מעלות צלזיוס עם מרווחים של 0.5 מעלות צלזיוס למשך חמש שניות.

מרכיב מרכזי אחד בפרוטוקול זה הוא אופטימיזציה של ריכוז הנוקלאז המיקרוקוקלי המשמש לעיכול הכרומטין למקטעים מסיסים. דוגמה זו נובעת מאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של DNA שבודד לאחר עיכול גלולת הכרומטין עם כמויות משתנות של נוקלאז מיקרוקוקלי מראה כי 2.5 מיקרוליטר של אנזים ב-20 יחידות למיקרוליטר ייצרו בעיקר מונונוקלאוזומים. ניסוי ChIP מייצג זה השתמש בנוגדנים כנגד סמן מתיל היסטון H3K4me2 והיסטון H3 בתאי נוקאאוט מסוג בר ו-set1.

תאי נוקאאוט Set1 חסרים את המתיל טרנספראז המזרז את הסימן הפסים מציינים את ההעשרה היחסית של H3K4me2 במדע הנמוך המצוין. הזן מסוג הבר הראה העשרה ברורה ל-H3K4me2 בחמשת הקצה הראשוני של שני גנים הידועים כמטרות ישירות של set1, PMA1 ו-ERG11 בעוד שלא נצפה אות בתאי נוקאאוט של set1. כצפוי, לא הייתה העשרה של סימן H3K4me2 ב-TEL07L, הביטוי של SPR3 דווח גם כמווסת על ידי set1 אך תוצאות אלה מצביעות על כך שסביר להניח שהוויסות יתרחש על ידי מנגנון שונה מאשר ב-PMA1 או ERG11.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק היטב את הנוגדן המשמש לספציפיות עם הבקרות המתאימות. אם זמין, יש לחקור אזורי בקרה חיוביים ושליליים ב-QPCR.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף GP על מנת לקבוע את הגנום על ידי התפלגות שינויים בהיסטון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות באופן עקבי את הרמות של שינויים שונים בהיסטון באזורים גנומיים ייחודיים באמצעות ניסויים מבוקרים היטב.