Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כלי שימושי להדמיה, אפיון וכימות של שטף חלבון הנטינגטין לניתוח הומאוסטזיס חלבון במערכות מודל מחלת הנטינגטון. שיטה זו יכולה לעזור לנו להבין שאלות בהומאוסטזיס חלבונים ובתחומים של מחלות נוירודגנרטיביות, כגון הבנת ההשפעה של התערבויות טיפוליות מסוימות על פתוגנזה של מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לבודד ולפתור מיני חלבונים בלתי מסיסים לניתוח כמותני.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים ביוכימיים במהלך הפתוגנזה של מחלת הנטינגטון, ניתן ליישם אותה גם על מחלות אחרות של קיפול שגוי של חלבונים כגון פרקינסון ומחלת אלצהיימר. כדי להתחיל בהליך זה, סמן שתי קבוצות של צינורות עבור כל דגימה כמסיסות ובלתי מסיסות. הכן מאגר ליזה מיד לפני דגימת ליזה בצינור המסיס על ידי הוספת הכמות המתאימה של מעכבים.

לאחר מכן, הוסף לרקמה מאגר ליזיס מסיס קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז. עבור רקמת מוח של עכבר, יש לטבול לאט 30 פעמים בזכוכית של מיליליטר אחד. היזהר לא לשבור את פני הנוזל מכיוון שייווצרו בועות ועלולות להניב הומוגניזציה לא מלאה.

אותו לתוך הצינור הבלתי מסיס על קרח. עבור קווי תאים, התאים צופו בחמש פעמים 10 עד לתאים החמישיים בכל צלחת של שש בארות וגדלו לכמעט מפגש. לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS 1X קר והסר אותו.

לאחר מכן החל נפח מינימלי של מאגר ליזה על התאים והרם אותם בעזרת מגרד תאים. לאחר מכן, העבירו הומוגנט או ליזאט תאים לתוך הצינור הבלתי מסיס המסומן וליזה על קרח למשך שעה. עבור ליזאטים של תאים, יש לשלש מספר פעמים כדי לפרק גושי תאים לפני תחילת הדגירה ולהימנע מהיווצרות בועות.

מערבולת דופק קצרה כל דגימה למשך שנייה אחת באמצע הליסינג. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ב-15,000 x גרם למשך 20 דקות. ואז הסר את הסופרנטנט.

היזהר לא להפריע לגלולה או לשכבה העכורה מכיוון שהדבר יזהם את השבר. הכניסו את הסופרנטנט כחלק מסיס לתוך השפופרת המסומנת עם תווית מסיסה, ושמרו אותה על קרח. מעקב אחר מאגרי הליזיס המסיסים והבלתי מסיסים הוא המפתח.

החלפת המאגרים או הנחת המאגר הבלתי מסיס או הדגימות על קרח יפגעו בתוצאות הפרוטוקול. שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב-15,000 x גרם למשך חמש דקות. חזור על הכביסה פעם נוספת.

לאחר מכן, הסר את כל מאגר הכביסה שנותר והשאיר רק את כדור הרקמה. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה עם מאגר ליזה בתוספת 4% SDS. סוניקטור כל דגימה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר בעזרת סוניקטור בדיקה.

סוניקציה של נפחים קטנים לתקופה ארוכה היא מאתגרת מבחינה טכנית. היזהר לא לאבד דגימה על ידי תחליב או ריסוס בעת השלמת שלב זה. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות למשך 30 דקות.

ואז צנטריפוגה אותם לזמן קצר ב 6, 000 x גרם. לאחר מכן, בצע בדיקת חלבון תואמת דטרגנט או בדיקת חלבון Lowry כדי למדוד את ריכוז החלבון. לאחר מכן, יש לצטט את הדגימות לקבוצות של 50 מיקרוליטר כדי למנוע בעיות הקפאה/הפשרה.

בשלב זה, בצע כתמים מערביים על ידי דילול 30 מיקרוגרם של דגימה ביחס של אחד לאחד במאגר הטעינה. מרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות וצנטריפוגות אותן לזמן קצר בחום של 6, 000 x גרם. לאחר מכן, נתח את השברים לפי דף SDS וכתם מערבי.

צבעו את הממברנה בכתם חלבון שלם כדי להמחיש את יעילות העמסת החלבון. להלן השברים המסיסים והבלתי מסיסים מליזטים של תאי HEK 293T שנפתרו על ג'ל עמוד 4-12% Bis-Tris ו-3-8%Tris-Acetate בהתאמה. חלק מסיס מנורמל לבקרת העמסה של GAPDH מראה תנודות של מונומר מסיס הנטינגטין אקסון 1 מוטנטי בהתבסס על חשיפה למעכב פרוטאז MG132.

חלק בלתי מסיס מראה כי מינים מצטברים במשקל מולקולרי גבוה של הנטינגטין מוטנטי מווסתים גם על ידי טיפול MG132. והנה הדגימות של שברים מסיסים ובלתי מסיסים מליזטים של תאי HeLA באמצעות ניתוח פיגור של כתמים מערביים ומסננים. הנתונים מראים כי נוכחות של איזופורם SUMO מבוטא יתר על המידה מגדילה הן מוטציה במשקל מולקולרי גבוה והן מוטנטי בלתי מסיס סיבי הנטינגטין בחלק הבלתי מסיס.

איור זה מציג את הוויסות של הצטברות הנטינגטין מוטנטית במשקל מולקולרי גבוה לאחר אפנון טיפול פוטנציאלי בהפרדה הבלתי מסיסה מתאי HeLa על פני ביטוי 97Q הנטינגטין אקסון 1. המטרה הטיפולית PIAS1 הושתקה עם siRNA כלפי PIAS1 או התבטאת יתר על המידה. שברים בלתי מסיסים מסטריאטה של עכבר שטופלו במיקרו-RNA כנגד PIAS1 ונפתרו על ג'ל עמוד 3-8%Tris-Acetate מראים אפנון של הנטינגטין בלתי מסיס במשקל מולקולרי גבוה.

אל תשכח שעבודה עם NEM עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישת מסכת פנים בעת ביצוע פרוטוקול זה. לאחר שליטה, טכניקה זו מליזאט ועד סוף הפיצול יכולה להיעשות תוך כשלוש עד ארבע שעות בהתאם למספר הדגימות. יש לאפשר שעה נוספת לכימות חלבון ולציטוט.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז או עיכוב מסנן על מנת לזהות אוליגומרים מסיסים או סיבים בלתי מסיסים בהתאמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבודד ולפתור חלבונים מקופלים לא מסיסים לניתוח כמותי.