Name: Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: למד שיטת פרקציונציה להפרדת מיני Huntingtin מסיסים ולא מסיסים ממוח עכבר ותרביות תאים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של זרימת חלבונים והבנת הומאוסטזיס חלבונית במחלת הנטינגטון ובמחלות נוירודגנרטיביות נוספות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (RO1-NS090390). כן נרצה להודות דיון במהלך פיתוח assay זה וסיוע טכני ד ר ג'ואן Steffanfor.

דוח אתיקה בעלי חיים - ניסויים בוצעו בהתאמה קפדנית עם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים, פרוטוקול מחקר בבעלי חיים שאושרו על-ידי (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש IACUC) ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין, מוכר AAALAC המוסד. כל המאמצים נעשו כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
1. הכנה של פירוק מאגרי
<ol><li>להכין "מסיסים" פירוק מאגר (10 מ מ טריס pH 7.4, 1% טריטון-X 100, 150 מ מ NaCl, 10% גליצרול) וסינון סטרילי דרך מסנן מיקרומטר 0.22.<ol>
<li>עבור עבודה "מסיסים" מאגר פירוק, N-Ethylmaleimide (NEM) וכולן ביסודיות להמיס 100 מ מ phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) מומס 100% EtOH. הערה: פירוק מאגר מעכבי: (i) 20 מ מ N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 מ מ PMSF; (iii) 1 מ"מ orthovanadate נתרן (Na3VO4); (iv) leupeptin µg/mL 1; (v) aprotinin µg/mL 1; (vi) 20 מ מ סודיום פלואוריד (NaF). התראה: תלבש מסיכת פנים בעת עבודה עם NEM לאורך כל הפרוטוקול. עובד פירוק מאגר להתבצע טריים כדי להבטיח מעכבי פעיל.</li>
		<li>עבור מאגר פירוק מסיס עם מעכבי פרוטאז, הוסף מעכבי לפי הסדר הבא: סודיום פלואוריד (NaF), עד נפח עם מאגר פירוק קר, orthovanadate נתרן (Na3VO4), Aprotinin Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור מאגר פירוק "מסיסים", מוסף 4% מרחביות על-ידי הוספת µL 500 למען חברה דמוקרטית 20% 2 מ של מאגר פירוק "Soluble". יוצאים בטמפרטורת החדר. הערה: למען חברה דמוקרטית לזרז את כאשר שמרו ב 4 ° C; . לשמור את זה אווריריות. קומפוזיציה פירוק מאגר הסופי: 10 מ מ טריס (pH 7.4); 1% טריטון X-100; 150 מ מ NaCl; 10% גליצרול; 4% מרחביות (לא מסיס בלבד).</li>
</ol>2. מסיסים/לא מסיס Fractionation פרוטוקול
הערה: ראה איור 1 מפרטים טכניים.
<ol><li>תווית שתי ערכות של צינורות עבור כל דגימה: "Soluble" ו- "לא מסיסים."</li>
	<li>להוסיף X-µL קר כקרח מאגר פירוק מסיסים לעבוד עם מעכבי פרוטאז (ראה 1.1.1) לרקמה. הערה: X = אמצעי האחסון משתנה בהתאם כמות רקמת; ראה טבלה 1.</li>
	<li>עבור העכבר רקמת מוח (קרי, סטריאטום), דאונס לאט 30 פעמים זכוכית 1 מ"ל douncer ו pipet לתוך"לא מסיס"הנקרא צינור (לשמור בקירור). הערה: יש להיזהר לא לשבור את פני השטח של הנוזל לאחר הפעלת douncing, כמו בועות יהיה טופס תניב המגון לא שלם.</li>
	<li>עבור תאים (קרי, הלה, HEK293T), לשטוף תאים פעם אחת עם קר, 1 x PBS. להסיר PBS חלות נפח מינימלי של מאגר פירוק תאים, תרים עם תא המגרד. הערה: עבור מעל שורות תאים, התאים היו מצופה ב 5 x 105 תאים לכל צלחת טוב 6, גדל ליד confluency. אחד טוב הוא דומה לאמצעי אחסון המשמש סטריאטום העכבר.</li>
	<li>העברת homogenate או lysate לתוך התא הנקרא, צינורות "מסיסים" ואת lyse על קרח 1 h (התחל שעון לאחר עיבוד סופי צינור). הערה: עבור תא lysates, triturate מספר פעמים כדי לשבור את התא הגושים לפני מתחיל אינקובציה. למנוע היווצרות בועות. בקצרה מערבולת דופק כל דגימה עבור 1 s בחצי הדרך lysing.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 20 דקות.</li>
	<li>לשחזר תגובת שיקוע כמו השבר "Soluble".<ol>
<li>להסיר עם pipet, להיזהר שלא להפריע שכבה גלולה/מעונן כמו זה לזהם את השבר. Pipet שבר מסיסים לתוך "Soluble" תוויות שפופרת. לשמור על הקרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לרחוץ גלולה עם 500 µL של פירוק מאגר (x2), צנטריפוגה ב 4 ° C-g x 15,000 עבור 5 דקות אחרי זה לשטוף; זה בסדר אם חלק השכבה מעונן הוא pipetted.</li>
	<li>לאחר השטיפה הסופית להסיר כל מאגר שטיפת הנותרים עוזב רק בגדר רקמות. הערה: מנקודה זו, דגימות לא מסיסים יש עכשיו לשמור בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Resuspend גלולה עם מאגר פירוק X-µL בתוספת 4% מרחביות (אמצעי אחסון ניתן להתאים בהתאם לגודל צניפה; ראה טבלה 1).</li>
	<li>Sonicate כל דגימה ל 30 s בטמפרטורת החדר עם sonicator המכשיר (125 וואט, 20 kHz, הדופק, משרעת ב-40%, ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להרתיח דגימות (מתגלגל לרתיחה) במשך 30 דקות; צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לא לאבד את דוגמה.</li>
	<li>לבצע DC (דטרגנט תואם) חלבון assay (ראה טבלה של חומרים) או שיטת לאורי למדידת ריכוז חלבון (מומלץ דילולים התחיל של 1/5 מדגם במאגר פירוק בהתאמה לתרבות תא, 10/1 lysates רקמות). הערה: ריכוז חלבון יהיה ניתן לקריאה באמצעות וזמינותו של DC או לאורי בשל ריכוז גבוה של דטרגנט.</li>
	<li>דוגמאות aliquot 50 µL אצוות כדי למנוע בעיות ההקפאה-הפשרה. הערה: פרוטוקול ניתן להשהות כאן לפני ניתוח ביוכימי נוסף על-ידי אחסון שני שברים ב-20 ° C.</li>
</ol>3. תספיג חלבון ו כמת
<ol><li>לבצע שהכלים המערבי כפי שדווח במקום1,13 על ידי המדללת 30 µg מדגם 1:1 בקופסא טעינת מאגר (1.6 x בטעינת צבע, 1 x הפחתת). הערה: 30 µg של חלבון ליום שבר מספיקה, אך ניתן לכוונן את רזולוציה מיטבית. 3 - 8% טריס-אצטט פולי-אקרילאמיד ג'לים אמור לשמש את השבר לא מסיסים. 4 - 12% bis-טריס ג'לים מומלץ עבור השבר מסיסים.</li>
	<li>מרתיחים דגימות (בהרתחה מתגלגל) 5 דק צנטריפוגה בקצרה (15 s) ב 6,000 g x כדי לאסוף דוגמה.</li>
	<li>לנתח שברים על ידי עמודים מרחביות, תספיג חלבון על פי הפרוטוקול של היצרן עבור דגימות מופחת. הערה: שבר לא מסיסים פותר הטוב ביותר כאשר העבירו על גבי הממברנה ניטרוצלולוזה מיקרומטר 0.45. 0.45 או 0.2 µM ניטרוצלולוזה יכול לשמש עבור השבר מסיסים, בהתאם לגודל של החלבון עניין. אופטימיזציה מסוימים עשוי להידרש להעברה הטוב ביותר של חומרים HMW.</li>
	<li>כתם קרום עם חלבון כל כתם (למשל, MEMcode, ראה הטבלה של חומרים) לדמיין חלבון נצילות ההטענה. הערה: ניתן לנתח שהכלים המערבי באינטנסיביות פיקסל רע. אפשרות לנרמל את השברים מסיסים כדי חלבון משק בית הכי מתאים עבור מערכת ניסויית. שבר לא מסיסים כמו חלבון יחסית שפע אומתה על ידי חלבון הפיך להכתים או 3 היסטון נורמליזציה על כתם נפרדים.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כמה אמצעי זהירות נדרשים עבור הפרוטוקולים לעיל להבטיח תוצאות עקביות, תפוקה. ראשית, mHTT שני שברים באופן ספונטני יהוו אגרגטים לאורך זמן על מחזורי הפשרת ההקפאה מרובים, במיוחד כאשר אתה נמצא ריכוז גבוה. לפיכך חיוני כדי להקפיא aliquots של חלבון preps, ולאחר להפשיר רק את אמצעי האחסון הדרושים לפני הפעלת וזמינותו כמתואר לעיל בפרוטוקול. עוד, אם השבר לא מסיסים התשואות precipitant לבן עם מפשיר, שיחזור ייתכן שיהיה צורך מאת נוספים הדופק sonication s 5, 5 דקות לרתיחה, כימות מחדש לפני ניתוח באמצעות מבחני הביוכימי.
<p class="jove_con...

שיבוש רשתות בקרת איכות חלבון להבטיח קיפול נאות והשפלות של החלבונים הוא מרכזי סביר פתולוגיה מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), אחרים "חלבון misfolding" והפרעות2,3. הבנה מפורטת של רכיבי הרשת פרוטוסטאזיס ותרומתם פתולוגיה ולכן הם חיוניים לפיתוח התערבויות טיפוליות משופרת. HD נגרמת על ידי הרחבת חריג שידור חוזר חטיבתי בתוך הגן HD וכתוצאה מכך רצועת המורחב של polyglutamines (polyQ) חלבון huntingtin (HTT)4. תכונה פתולוגית עקבית של פתוגנזה HD היא וכתוצאה מכך misfolding, הצטברות, צבירה של HTT באזורים של המוח, ברקמות היקפיים, אשר הוכח להתערב במספר דרכים עם תאים נורמליים הומאוסטזיס ותפקוד 5 , 6. HTT בזמן מבוטא ubiquitously, בינוני קוצני נוירונים בסטריאטום פגיע באופן סלקטיבי, המושפע ביותר בגלוי עם ניוון קליפתי הבולטים המשויכים גם HD פתוגנזה.
היווצרות של אגרגטים של HTT במוח של חולים HD ומודלים בעלי חיים שימש בדרך כלל proxy סמן התקדמות המחלה ולהשיג דומיננטה-שלילי של פונקציה mHTT7. למרות המנגנון המדויק על ידי שבו חלבון misfolding, צבירת עשוי לתרום רעילות הנגרמת mHTT אינן ברורות, היווצרות של אלה תכלילים במוח של חולי HD, מודלים שונים היא תכונה קבוע ובלתי נמנע. תכלילים מופיעות כמורכבת במידה רבה של קטעים HTT שהצטברו המכיל N-מסוף מורחבת polyQ, המציין את proteolysis, וכן עיבוד של HTT באורך מלא, כמו גם אלטרנטיבה שחבור8,9 עשוי לשחק תפקיד חשוב בפתוגנזה של שברי HD. N-מסוף HTT עלולה להוות צורה פיפטות של HTT יכול לצבור במהירות, nucleate, ו להאיץ או להפיץ את תהליך של צבירת10.
עם זאת, הנוכחות של תכלילים אלה לא בהכרח לתאם עם רעילות HTT-induced או מוות תא11. HTT הוצע לעבור תהליך צבירת מ מונומר מסיסים דרך מינים oligomeric מסיסים ו β-גיליון הסיבים לא מסיסים אגרגטים, תכלילים12. פתרון אלה מינים שונים של חלבון באמצעות מבחני הביוכימי רגיל כבר אתגר בשטח עקב יציבות שלהם במאגר נמוך חומרי פירוק ולקשיי להמחיש באמצעות מבחני הביוכימי סטנדרטי. לפיכך, שיקולים מתודולוגי הם קריטיים באיתור את התואר ואת התבנית של mHTT המצטבר של צבור.
פרוטוקול המובאת כאן מספק שיטה כדי להמחיש כמה intermediates של HTT, במיוחד היווצרות של זן HMW HTT לא מסיסים המופיע לעקוב מקרוב אחר עם HD בפתוגנזה של המחלה התקדמות1,13 ,14. היכולת לזהות ולעקוב אחר מספר מינים של mHTT מספק חוקרים כלי הביוכימי ללמוד בפתוגנזה של המחלה ואף להעריך את פוטנציאל התערבויות טיפוליות דרך שלהם אפנון ואת ההשפעה על המחלה פתוגנזה.

<table><tbody><tr><td>מסנן סטרילי</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>מכסה בורג, מסנן ואקום סטרילי</td></tr><tr><td>1 מ"ל מטחנת רקמות, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>דגם Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>דומה לבדיקת Lowry</td></tr><tr><td>Tris 1M תמיסת חיץ</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M תמיסת</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% תמיסת SDS</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfony פלואוריד</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>ליצור תמיסת מלאי של 100 מ"מ ב-100% EtOH, חנות ב-4&deg; C</td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט</td><td>סיגמא</td><td>S6508</td><td>צור תמיסת מלאי 0.5M במים</td></tr><tr><td>לופפטין</td><td>סיגמא</td><td>L2884</td><td>צור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל במים</td></tr><tr><td>אפרוטינין</td><td>סיגמא</td><td>A1153</td><td>צור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל במים</td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>סיגמא</td><td>S4504</td><td>צור תמיסת מלאי של 500 מ"מ במים</td></tr><tr><td>אנטי HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>השתמש ב-1:1000 עבור כתם מערבי, 1:500 עבור בדיקת פיגור מסנן</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>השתמש ב-1:1000 עבור כתם מערבי מסיס</td></tr></tbody></table>

fractionation רזולוציה של מינים huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

ההצטברות של חלבונים misfolded הוא מרכזי פתולוגיה של מחלת הנטינגטון (HD), רבים הפרעות ניווניות אחרות. באופן ספציפי, מפתח תכונה פתולוגית של HD הוא הצטברות חריגה של מוטציה בחלבון HTT (mHTT) לתוך מתחמי משקל מולקולרי גבוה, גופים הכללה תאיים המורכב מקטעי וחלבונים אחרים. שיטות קונבנציונליות כדי למדוד ולהבין שהתרומות של צורות שונות של אגרגטים המכילות mHTT כוללים קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, ניתוח תספיג מסנן השמנה מבחני.
עם זאת, רוב השיטות האלה הן קונפורמציה ספציפיים, ולכן לא יכול לפתור המדינה מלאה של mHTT השטף חלבון בשל האופי המורכב של צבירה מסיסות והרזולוציה.
לצורך זיהוי mHTT צבורים שונים צורות ששונה ואת מתחמי, ההפרדה ואת solubilization של אגרגטים הסלולר ואת שברי הוא חובה. כאן אנו מתארים שיטה כדי לבודד והמחש mHTT מסיסים מונומרים, oligomers, שברים, משקל מולקולרי גבוה (HMW) לא מסיסים שנצבר mHTT מינים. HMW mHTT שירים עם התקדמות המחלה, מתכתב עם העכבר התנהגות הקריאות הבאות, יש כבר מווסת לטובה על ידי התערבויות טיפוליות מסוימת1. גישה זו יכולה לשמש עם מוח העכבר רקמות היקפיים, תרבית תאים אבל שעשוי להיות מותאם דגם מערכות או מחלת בהקשרים אחרים.

רזולוציה של lysates תא מסיסים ובחלקם לא מסיסים בעקבות fractionation ניתן להבחין באמצעות המערבי ניתוח ומסנן פיגור מבחני (איור 2). לדוגמה, תאים HEK293T היו transfected באמצעות ריאגנט תרביות תאים (למשל, lipofectamine 2000), עם HTT אקסון 1 cDNA קידוד המכילים גלוטמין 97 חוזר15 ואחריו האזור עשיר של פרולין פוליפוני, תאים אלה הורשו אקספרס עבור תאים ה 44 טופלו עם גם 5 מיקרומטר MG132 כדי לחסום את פרוטאוזום או דימתיל סולפוקסיד כפקד 18 h ...

שיטה מתוארת עבור fractionation של מינים huntingtin מוטציה לא מסיסים ולא מסיסים מתרבות המוח ותא העכבר. השיטה המתוארת שימושית עבור כימות של huntingtin חלבון השטף ועזרי בניתוח הומאוסטזיס חלבון בפתוגנזה של המחלה, בנוכחות לפליטת ואפיון

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כלי שימושי להדמיה, אפיון וכימות של שטף חלבון הנטינגטין לניתוח הומאוסטזיס חלבון במערכות מודל מחלת הנטינגטון. שיטה זו יכולה לעזור לנו להבין שאלות בהומאוסטזיס חלבונים ובתחומים של מחלות נוירודגנרטיביות, כגון הבנת ההשפעה של התערבויות טיפוליות מסוימות על פתוגנזה של מחלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לבודד ולפתור מיני חלבונים בלתי מסיסים לניתוח כמותני.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי שינויים ביוכימיים במהלך הפתוגנזה של מחלת הנטינגטון, ניתן ליישם אותה גם על מחלות אחרות של קיפול שגוי של חלבונים כגון פרקינסון ומחלת אלצהיימר. כדי להתחיל בהליך זה, סמן שתי קבוצות של צינורות עבור כל דגימה כמסיסות ובלתי מסיסות. הכן מאגר ליזה מיד לפני דגימת ליזה בצינור המסיס על ידי הוספת הכמות המתאימה של מעכבים.לאחר מכן, הוסף לרקמה מאגר ליזיס מסיס קר כקרח בתוספת מעכבי פרוטאז. עבור רקמת מוח של עכבר, יש לטבול לאט 30 פעמים בזכוכית של מיליליטר אחד. היזהר לא לשבור את פני הנוזל מכיוון שייווצרו בועות ועלולות להניב הומוגניזציה לא מלאה.לאחר מכן הכניסו אותו לתוך הצינור הבלתי מסיס על קרח. עבור קווי תאים, התאים צופו בחמש פעמים 10 עד לתאים החמישיים בכל צלחת של שש בארות וגדלו לכמעט מפגש. לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS 1X קר והסר אותו.לאחר מכן החל נפח מינימלי של מאגר ליזה על התאים והרם אותם בעזרת מגרד תאים. לאחר מכן, העבירו הומוגנט או ליזאט תאים לתוך הצינור הבלתי מסיס המסומן וליזה על קרח למשך שעה. עבור ליזאטים של תאים, יש לשלש מספר פעמים כדי לפרק גושי תאים לפני תחילת הדגירה ולהימנע מהיווצרות בועות.מערבולת דופק קצרה כל דגימה למשך שנייה אחת באמצע הליסינג. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס ב-15,000 x גרם למשך 20 דקות. ואז הסר את הסופרנטנט.היזהר לא להפריע לגלולה או לשכבה העכורה מכיוון שהדבר יזהם את השבר. הכניסו את הסופרנטנט כחלק מסיס לתוך השפופרת המסומנת עם תווית מסיסה, ושמרו אותה על קרח. מעקב אחר מאגרי הליזיס המסיסים והבלתי מסיסים הוא המפתח.החלפת המאגרים או הנחת המאגר הבלתי מסיס או הדגימות על קרח יפגעו בתוצאות הפרוטוקול. שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה וצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס ב-15,000 x גרם למשך חמש דקות. חזור על הכביסה פעם נוספת.לאחר מכן, הסר את כל מאגר הכביסה שנותר והשאיר רק את כדור הרקמה. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה עם מאגר ליזה בתוספת 4% SDS. סוניקטור כל דגימה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר בעזרת סוניקטור בדיקה.סוניקציה של נפחים קטנים לתקופה ארוכה היא מאתגרת מבחינה טכנית. היזהר לא לאבד דגימה על ידי תחליב או ריסוס בעת השלמת שלב זה. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות למשך 30 דקות.ואז צנטריפוגה אותם לזמן קצר ב 6, 000 x גרם. לאחר מכן, בצע בדיקת חלבון תואמת דטרגנט או בדיקת חלבון Lowry כדי למדוד את ריכוז החלבון. לאחר מכן, יש לצטט את הדגימות לקבוצות של 50 מיקרוליטר כדי למנוע בעיות הקפאה/הפשרה.בשלב זה, בצע כתמים מערביים על ידי דילול 30 מיקרוגרם של דגימה ביחס של אחד לאחד במאגר הטעינה. מרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות וצנטריפוגות אותן לזמן קצר בחום של 6, 000 x גרם. לאחר מכן, נתח את השברים לפי דף SDS וכתם מערבי.צבעו את הממברנה בכתם חלבון שלם כדי להמחיש את יעילות העמסת החלבון. להלן השברים המסיסים והבלתי מסיסים מליזטים של תאי HEK 293T שנפתרו על ג'ל עמוד 4-12% Bis-Tris ו-3-8%Tris-Acetate בהתאמה. חלק מסיס מנורמל לבקרת העמסה של GAPDH מראה תנודות של מונומר מסיס הנטינגטין אקסון 1 מוטנטי בהתבסס על חשיפה למעכב פרוטאז MG132.חלק בלתי מסיס מראה כי מינים מצטברים במשקל מולקולרי גבוה של הנטינגטין מוטנטי מווסתים גם על ידי טיפול MG132. והנה הדגימות של שברים מסיסים ובלתי מסיסים מליזטים של תאי HeLA באמצעות ניתוח פיגור של כתמים מערביים ומסננים. הנתונים מראים כי נוכחות של איזופורם SUMO מבוטא יתר על המידה מגדילה הן מוטציה במשקל מולקולרי גבוה והן מוטנטי בלתי מסיס סיבי הנטינגטין בחלק הבלתי מסיס.איור זה מציג את הוויסות של הצטברות הנטינגטין מוטנטית במשקל מולקולרי גבוה לאחר אפנון טיפול פוטנציאלי בהפרדה הבלתי מסיסה מתאי HeLa על פני ביטוי 97Q הנטינגטין אקסון 1. המטרה הטיפולית PIAS1 הושתקה עם siRNA כלפי PIAS1 או התבטאת יתר על המידה. שברים בלתי מסיסים מסטריאטה של עכבר שטופלו במיקרו-RNA כנגד PIAS1 ונפתרו על ג'ל עמוד 3-8%Tris-Acetate מראים אפנון של הנטינגטין בלתי מסיס במשקל מולקולרי גבוה.אל תשכח שעבודה עם NEM עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון חבישת מסכת פנים בעת ביצוע פרוטוקול זה. לאחר שליטה, טכניקה זו מליזאט ועד סוף הפיצול יכולה להיעשות תוך כשלוש עד ארבע שעות בהתאם למספר הדגימות. יש לאפשר שעה נוספת לכימות חלבון ולציטוט.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז או עיכוב מסנן על מנת לזהות אוליגומרים מסיסים או סיבים בלתי מסיסים בהתאמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבודד ולפתור חלבונים מקופלים לא מסיסים לניתוח כמותי.

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

סרטון זה מדגים את הפרוטוקול לבידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת מוח של עכבר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ועיכול של חלבונים שאינם עמילואידים.

בידוד סיבי עמילואיד מתמצית רקמת המוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

ביטוי וטיהור של הידרוקלז בתחום ההידרולז-מחשבים המכילים חלבונים מתוארים עם דוגמאות (ביטוי ב -E. coli, fplc). חלבונים מטוהרים משמשים התגבשות והפקת נוגדנים מועסקים עבור assays האנזים. התצוגה הנפתחת הנבחרת מוצגת כדי להציג את הפונקציונליות הרב של FAHD1 כמו הידרולואצטט decarboxylase ו acylpy, ההידרולז.

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

אנו מספקים פרוטוקולים מדרגיים המכסים תכנון מבנה, טרנספקציה חולפת, וביטוי וטיהור של גרסאות של חלבון ציד אנושי באורך מלא בתאי HEK293.

ייצור יעיל וניתן להרחבה של גרסאות ציד אנושיות באורך מלא בתאי יונקים באמצעות מערכת ביטוי חולפת

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחלץ את החלבון 1 המכיל הידרולאז 1 (FAHD1) מכליות החזירים ומכבד העכברים. השיטות המפורטות עשויות להיות מותאמות לחלבונים אחרים בעלי עניין ולשנות אותן עבור רקמות אחרות.

מיצוי וטיהור של חלבון FAHD1 מכבד כליות ועכבר חזירים

פרוטוקול זה מציג שיטה חזקה ומפורטת להשגת סינפטוזומים טהורים ביותר, שלפוחיות סינפטיות ושברים סינפטיים אחרים ממוח העכבר. שיטה זו מאפשרת הערכה של תהליכים סינפטיים, כולל ניתוח ביוכימי של לוקליזציה ותפקוד חלבונים ברזולוציה מדורית.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

למד שיטת פרקציונציה להפרדת מיני Huntingtin מסיסים ולא מסיסים ממוח עכבר ותרביות תאים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של זרימת חלבונים והבנת הומאוסטזיס חלבונית במחלת הנטינגטון ובמחלות נוירודגנרטיביות נוספות.

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

גלה סרטונים נוספים