Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא ליצור מטריצה חוץ-תאית ex vivo הידועה בשם מערכת תרבות הממברנה של ברוך, המתבוננת בהשפעת הממברנה של ברוך על תאי אפיתל פיגמנטליים ברשתית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתת-ביולוגיה של RPE בתחום האטיולוגיה של AMD, כגון האם השינויים בממברנות של ברוך המזדקנות תורמים לתקלות בתאי ה-RPE המונחים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לבודד את הממברנה של ברוך מעין תורם אנושי בגילאים שונים ולהשתמש בהם למחקר פרוטאומיקה בתרביות תאי RPE.

בידוד הממברנה של ברוך ויצירת מערכת תרבית vivo אמיתית עם מינימום נזק לקרום של ברוך המקומי הוא מאתגר, אבל אני אראה לך איך בסרטון הזה. כדי להתחיל, הניחו גזה בגודל 1.5 אינץ' רבוע ספוגה ב-DMEM שאינו תלוי ב-CO2 לתוך צלחת של 100 מילימטר. לאחר מכן טען את כדור העין על הגזה.

לאחר מכן, השתמש בלהב כירורגי כדי לבצע חתך דרך הסקלרה שלושה מילימטרים אחורי הלימבוס. לאחר מכן, השתמש במספריים בעלי להב דק כדי לבצע חתך בעובי מלא ולהאריך את החתך בהיקף לכל כיוון סביב העין. לאחר מכן, הסר והשליך את החלק הקדמי כולל הקרנית, העדשה והקשתית.

כמו כן, השליכו את הזגוגית והרשתית. לאחר מכן, קלף בזהירות את קומפלקס הכורואיד הממברנה של RPE Bruch מהסקלרה מהפריפריה לעצב הראייה באמצעות מרית מצופה טפלון. יש לעשות זאת בזהירות רבה כדי לא לקרוע את קומפלקס הממברנה.

כעת, השתמש במספריים כירורגיות עדינות כדי לבצע ארבעה חתכים רדיאליים בסקלרה ולקלף את הסקלרה. לאחר מכן, חתכו את צמח הכורואיד הממברנה של ברוך מהעצב האופטי והעבירו את האקספלנט הזה לצלחת של 60 מילימטר המכילה 0.02 אמוניום הידרוקסיד טוחנת ב-DPBS. כדי להסיר את תאי ה-RPE המקוריים, דגרו על צמח זה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, שטפו את האקספלנט שלוש פעמים באמצעות DPBS על ידי אבטחת אתר העצב האופטי על קרום הברוך עם מלקחיים מצופים טפלון תוך הזרמת תמיסה סביב הרקמה. לאחר מכן, צף את הצד החיצוני, הלמינין פונה כלפי מעלה במדיה נטולת פחמן דו חמצני. בצע ארבעה חתכים על הממברנה של ברוך ואז העביר קרום PTFE הידרופובי לא למינציה בעובי 65 מיקרון עם נקבוביות של 0.2 מיקרון מעל האקספלנט.

הגדר זאת עם הלמינה הבסיסית כנגד קרום ה-PTFE. הסר נוזלים מיותרים בכלי, ולאחר מכן העביר את המכלול למערכת מחזיק מסנן ואקום מיקרואנליזה מזכוכית, שם הוא אמור לשבת על תומך זכוכית פריטית. לאחר מכן, תוך הימנעות זהירה ממגע עם למינה בסיסית, יש לשטח את הקצוות המסולסלים של הצד הכורואידלי באמצעות מלקחיים מצופים טפלון.

כעת, נוזלו 15 מיליליטר של 4% אגרוז ב-DPBS וקררו אותו ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו לאט את האגרוז על הצד הכורואידלי של האקספלנט תוך הפעלת יניקה עדינה כדי לשמור עליו שטוח. ברגע שהג'ל מתחיל להתמצק, העבירו אותו עם הממברנה לכלי של 60 מילימטר על קרח.

הניחו לג'ל להתמצק במשך שתיים-שלוש דקות, ולאחר מכן קלפו את קרום ה-PTFE. לאחר מכן, טבלו את האקספלנט ב-DPBS ואחסנו אותו בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. כאשר מטפחים את האקספלנט על צלחת 60 מילימטר מרופדת באגרוז נוזלי של 4%, הפוך את קרום הברוך כלפי מעלה.

בעת תרבית באמצעות צלחת 96 בארות מרופדת פוליסטירן, הניחו את צמח הממברנה של ברוך עטוף בג'ל על יריעת טפלון שטוחה כשצד הלמינין פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, בעזרת טרפין, חותכים שישה עד שמונה כפתורים של שישה מילימטר מהאקספלנט ומעבירים את כפתורי הרקמה לבארות עמוסות באגרוז נוזלי. כדי להתחיל, הגדר את גלובוס העין על גזה ספוגה ב-DPBS כמו קודם.

לאחר מכן, בצע חתך היקפי חמישה מילימטרים מתחת לנקודת המגע של הקשתית-סקלרה, ה-pars plana, לתוך החלל התת-רשתית. השליכו את הקטע הפנימי, הזגוגית והרשתית. לאחר מכן, בעזרת פיפטת העברה, שטפו את העין בשניים עד שלושה מיליליטר DPBS קרים.

בסך הכל, שטפו את גביעונית העיניים שלוש פעמים. לאחר מכן, כדי לנתק את תאי ה-RPE, יש לטפל בכוס העין בטריפסין למשך עד 10 דקות. לאחר מכן, העבירו תאי RPE טריפסינים לצינור של 50 מיליליטר, וכדי להרוות את התגובה, הוסיפו 25 מיליליטר של מדיום עם FBS ב-37 מעלות צלזיוס.

כעת, צנטריפוגה את הרקמה והתמיסה ב-200 גרם למשך 10 דקות ב-24 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום שלם DMEM עם 15% FBS. כעת, ספרו את התאים והושיבו 15,000 תאי RPE ברי קיימא ב-200 מיקרוליטר של חומר חיוני מינימלי ללא סרום המכיל אנטיביוטיקה על כל כפתור של הממברנה של ברוך בצלחת של 96 בארות.

תרבית התאים למשך 24 שעות לפחות לצורך התקשרות. מאוחר יותר, שנה בעדינות את ה-DMEM המלא של המדיום לחם והמשיך לגדל את התאים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לחקור ממברנות ברוך אנושיות מזדקנות וחולים על ידי גידול תאי RPE עליהן.

בדרך כלל, צמחים מיושנים מפחיתים את החיבור מחדש של תאי RPE. תאי RPE שגודלו על קרום ברוך אנושי מבוגר גם מסוגלים פחות לפגוציטים של מקטעים חיצוניים של מוט, פונקציית RPE קריטית. באמצעות מיקרו-מערכים, נמצא כי ביטוי הגנים של תאי RPE שונה כאשר התאים מתורבתים על הממברנה של ברוך מאנשים מבוגרים בהשוואה לתאים שגודלו על ממברנה מאנשים צעירים יותר.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד את הממברנה של ברוך מעיני תורם אנושי וליצור אקספלנטים שבהם ניתן לגדל תאי RPE. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לגעת בצד הלמינין של הממברנה של ברוך בכלי ניתוח כדי למנוע פגיעה במשטח.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פגוציטוזיס RPE ומחקרי ביטוי גנים של תאי RPE על מנת לענות על שאלות נוספות כגון האם קרום ברוך מתורם בגיל משתנה או מתורמים עם ניוון מקולרי הקשור לגיל ישפיע על תפקודי תאי RPE. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הניוון המקולרי הקשור לגיל לחקור את המנגנון באטיולוגיה של AMD במערכת מודל ex vivo של ממברנה של ברוך.