ויבתר חלבון רב מתחמי איתות על ידי טיהור זיקה קומפלמנטציה ריאקציה דו-מולקולרית (BiCAP)

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בביולוגיה ובביוכימיה של התא, כגון כיצד ההרכבה הדינמית של קומפלקסים של חלבונים וחלבונים שולטת במסלולי איתות ובהתנהגות התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבודד באופן ספציפי שני חלבונים הפועלים באינטראקציה, תוך אי הכללת חלבונים בודדים לא מורכבים, ושותפי קישור מתחרים. למרות שאנו משתמשים בשיטה זו כדי לספק תובנה לגבי דימריזציה קליטה של טירוזין קינאז בסרטן השד, ניתן ליישם אותה גם על כל סביבה או מחלה פיזיולוגית אחרת.

היה לנו רעיון לראשונה לשיטה הזו כשהבנו שננו-גוף GFP מזהה את האפיטופ התלת-ממדי של GFP וחלבונים פלואורסצנטיים אחרים. כדי להתחיל, הוסף 150 ננוגרם של וקטור כניסה, 150 ננוגרם של וקטור יעד ושמונה מיקרוליטר של מאגר TE, לצינור של 0.2 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטרים של רקומבינאז ו-ZiMex, וצנטריפוגה את השניים לזמן קצר.

דגרו את התגובה למשך שעה בטמפרטורת החדר, ואז הוסיפו מיקרוליטר אחד של תמיסת פרוטאינאז K, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, הפשירו תאים המסוגלים להלם חום על קרח. והעבירו 50 מיקרוליטר מהתאים לצינור פוליפרופילן עם תחתית עגולה של 14 מיליליטר.

הוסף מיקרוליטר אחד של תוצר תגובה לתאים, וערבב בעדינות. דגרו על התאים למשך 20 דקות על קרח. לאחר מכן מחשמלים את התאים באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות לפני החזרת התאים לקרח.

הוסף מיליליטר אחד של מדיית LB לתאים. ולדגור את הדגימה בניעור למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צלחו את הטרנספורמציה על צלחת אגר של 10 סנטימטר עם אמפיצילין, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי להתחיל בטיהור פלסמיד, הוסף אמפיצילין ו -100 מיליליטר של מדיה LB לבקבוק חרוטי גדול. לאחר מכן השתמש בלולאת חיסון כדי להסיר מושבה בודדת מצלחת האגר. טבלו את לולאת החיסון במדיה LB וערבבו קצרות, ואז כסו את החלק העליון של הבקבוק בנייר אלומיניום, ודגרו אותו למשך הלילה, בחום של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול.

מכאן יש לטהר את ה-DNA של הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור DNA פלסמיד סטנדרטית של Maxiprep, לפני שתמשיך בטרנספקציה. ראשית, זרע תאי HEK 293T בכלים של 10 סנטימטרים, המכילים 10 מיליליטר DMEM. לאחר מכן יש לדלל 2.5 מיקרוגרם מכל וקטור השלמה פלואורסצנטי דו-מולקולרי ב-500 מיקרוליטר של מאגר טרנספקציה.

מוסיפים 10 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה, ומערבלים את התערובת למשך 10 שניות. לאחר מכן צנטריפוגה קצרה של הדגימות, ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסף את תערובת טרנספקציית ה-DNA טיפתית למנה.

לאחר מכן דגרו על הדגימות למשך שמונה עד 24 שעות. הכן מאגר ליזה של תאים ומאגר ליזה של תאים משלים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים.

שאפו את ה-PBS והוסיפו מילימטר אחד של מאגר ליזה תאים בתוספת קר כקרח. לאחר מכן, הניחו את המנה על קרח ודגרו למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש במגרד תאים כדי להסיר את התאים, ולהעביר אותם לצינור מיקרו-צנטריפוגה מקורר.

צנטריפוגה של הצינור בכוח הכבידה פי 18,000 למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, כדי להסיר את הפסולת התאית, ואז להעביר את הסופרנטנט השקוף לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי. שטפו נפח מתאים של חרוזי אגרוז במיליליטר אחד של PBS, ואז צנטריפוגה את החרוזים בכוח משיכה פי 300, והסירו בזהירות את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של חרוזי אגרוז לכל דגימה.

ולדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים, עם סיבוב מקצה לקצה. צנטריפוגה של החרוזים בכוח הכבידה פי 300 ושטוף אותם במאגר ליזה תאים שלוש פעמים. לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים השטופים ב -50 מיקרוליטר של מאגר דגימה מדולל.

לבסוף, מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך שתיים-שלוש דקות. במחקר זה, שיטת BiCAP משמשת לצפייה באינטראקציה חיובית למספר סוגי חלבונים כ-16 שעות לאחר טרנספקציה משותפת של תאי HEK293T. מיקרוסקופיה קונ-פוקלית משמשת לצפייה בדימריזציה של RTKERBB2 בקרום הפלזמה, ובקשירת יוביקוויטין ל-E3 ligase UBR5.

לאחר טיהור זיקה עם ננו-גוף GFB, ניתן לזהות רק את חלבון בקרת ונוס באורך מלא, וחלבונים מתויגים V1 ו-V2 המקיימים אינטראקציה בדגימת הטרנספקציה המשותפת. בזמן שאתה מנסה הליך זה, זכור לייעל את המיקום של תג ההשלמה הקרינה הדו-מולקולרי, ואת הקצה הטרמינלי C או ה-N של החלבון המעניין שלך. זה הכרחי כדי לצפות באינטראקציה חיובית בין חלבון לחלבון.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את טכניקת BiCAP, וכיצד ליישם אותה על אינטראקציית החלבון המעניינת שלך. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש ברבות מטכניקות האפיון במורד הזרם, כמו ChIPseek כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד דימריזציה של גורמי השעתוק שולטת בקשירת ה-DNA.