Name: בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: למד לבודד ולגדל מיקרוגלייה ממוחות מכרסמים במדיום נטול סרום. שיטה זו מאפשרת שמירה על מורפולוגיה פיזיולוגית וחקר אינטראקציות עם תאי מערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כריסטופר דנה ריב קרן קונסורציום בינלאומי מחקר על פגיעה בחוט השדרה, ד"ר מרים, שלדון ג' אדלסון קרן למחקר רפואי, קרן JPB, נוברטיס המכון של מחקר בסיסי, תרומה נדיבה של וינסנט וקוטס סטלה, את דיימון ראניון מחקר קרן סרטן (DRG-2125-12).

בכל ההליכים הכרוכים מכרסמים תאמו הנחיות אוניברסיטת סטנפורד, העומדים בתקני הלאומי ואת חוקי המדינה ומדיניות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך.
הערה: כל פתרון, מאגר של יצירות הינם מסופקים בכל טבלה של חומרים.
1. מכינים את צלחת פטרי עבור CD11b Immunopanning (יום 0)
הערה: להכין תבשיל immunopanning 1 המוח עכברוש ילדותי כל 1-2.
<ol><li>להוסיף מ 25 ל 50 מ"מ טריס pH 9.5 פתרון צלחת פטרי 15 ס מ.</li>
	<li>להוסיף עז העכבר אנטי איג (H + L שרשראות) המנה עבור ריכוז סופי של 6 µg/mL. מערבולת צלחת לפיזור אחיד.</li>
	<li>דגירה המנה עבור 1-3 h ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש לשטוף כלים שלוש פעמים עם DPBS++ (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עם Ca2 + ו- Mg2 +), לאחר מכן להחליף עם פתרון של גלילה רציפה מאגר המכיל 1 µg/mL נוגדן OX42. תשאירי את הכלים ללילה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח.</li>
</ol>2. רקמת אוסף (יום 1)
הערה: פרוטוקול זה צריך לקחת ~ 3-4 שעות.
<ol><li>לפני שאתחיל להבטיח שכל הפתרונות הם וסטרילי, צונן על קרח. להירגע כל הכלים על הקרח ולחטא עם אתנול לפני השימוש.</li>
	<li>הפרוצדורות הבאות הרגולציה המתאימה, להקריב עכברוש מעבדה לנוער בעזרת פחמן דו-חמצני. הערה: לחלופין, חיים צעירים עלול להיות קורבן עם מנה קטלנית של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (100-200 µL של קטמין 24 מ"ג/מ"ל, חריגות השירותים הווטרינריים 2.4 mg/mL). קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים חייב לשמש אם בעלי החיים בגיל פחות מ- 14 ימים. אם משתמשים מרובים בעלי חיים, לחלץ את הרקמה חיה אחת והנח אותו לתוך צונן מראש DPBS++ על הקרח לפני שתמשיך לבעלי עוקבות.</li>
	<li>לצבוט hindpaw ולהבטיח את בעיית חוסר מוחלט מן החיה לפני שתמשיך.</li>
	<li>Transcardially perfuse החיה עם 10-30 מ של המאגר הקר זלוף באמצעות מחט 27½-G עד מאגר רץ ברורה. הערה: נפח של מאגר זלוף משתנה בהתאם הגודל/גיל של החיה.</li>
	<li>מיד לאחר זלוף להסיר את הראש של החיה. . מגיעים חוט השדרה לחתוך בעצם העורפית בכל צד עם מספריים לנתיחה, יש להיזהר לא נזק למוח. לאחר חיתוך צד לחתוך בזהירות, צד אחד לאורך דופן בקיבה, עצם המצח לכיוון עצם האף. עם מלקחיים בקפידה לסגת העליון של הגולגולת במהירות להסיר את המוח (או מבנים CNS עניין), מניחים מראש צוננת DPBS++ על הקרח.</li>
	<li>חזור על כל בעלי החיים הנותרים. הערה: כל השלבים בהליך צריכה להתבצע בתוך תא למינארי בתנאים סטריליים ראויים.</li>
</ol>3. מכני דיסוציאציה (יום 1)
<ol><li>לאחר שנאסף כל המוח, קוצצים מח אחד לתוך 1 מ3 נתחים בצלחת פטרי על הקרח עם להב קר אזמל ולאחר להעביר מהמגן דאונס קר כקרח עם המאגר הקר douncing 5-7 מ. מביצועם מח אחד בכל פעם.</li>
	<li>מביצועם הרקמה באמצעות קווים עדינים ולא שלמים 10-20 עם מהמגן דאונס רופפים. הקפידו לא ישירות למחוץ את הרקמה בתחתית מהמגן, אך במקום זאת מאלצים את הרקמות בחלל בין צידי הבוכנה מהמגן.</li>
	<li>הסר בזהירות את הבוכנה כדי למנוע את כניסתה של בועות אוויר. לאפשר הפומבית לקוי רקמת נתחים להתיישב לתחתית מהמגן, להעביר את תגובת שיקוע צוננת 50-mL חרוט צינור.</li>
	<li>החלף את אמצעי האחסון שהוסר מאגר douncing טריים, וחזור על הצעדים 3.2 ו- 3.3 עבור סכום כולל של 3-4 סיבובים, או עד רקמות כל חלופה מועדפת. חזור על התהליך עבור כל המוח.</li>
</ol>4. מיאלין להסרת (יום 1)
הערה: הסרת המיאלין משמש עבור בידוד של מיקרוגלייה מחיות שגילם P12.
<ol><li>למדוד את עוצמת הקול של התליה תא בצינור חרוט 50-mL באמצעות פיפטה 25 מ ל ולאחר מכן להוסיף מאגר douncing קר כקרח כדי לכוונן את העוצמה הכוללת 33.5 מ.</li>
	<li>להוסיף 10 מ ל מאגר ההפרדה מיאלין (MSB) תא ההשעיה, לערבב ביסודיות על ידי היפוך ברכבת התחתית מספר פעמים. התוצאה תהיה 23% הסופי ריכוז MSB באמצעי אחסון של 43.5 מ.</li>
	<li>צנטריפוגה תאים למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי. הערה: לצנטריפוגה צריך לקחת כ- 1.5-2 דקות כדי להאט. פעולה זו תיצור רובד גבוה של מיאלין, שאריות תאים מתים, תגובת שיקוע מנוסתם של גלולה קטנה יותר זה מועשר עבור תאים חיים.</li>
	<li>להסיר את השכבה העליונה של המיאלין/פסולת, את תגובת שיקוע עם פיפטה. יש להיזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח הרבה ממנו הוסר ככל האפשר.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא ב 12 מ של מאגר גלילה רציפה. בעדינות triturate התליה תא כדי לשבור את כל גושים של תאים שאולי נותרו.</li>
</ol>5. Immunopanning (יום 1)
<ol><li>עוברים התליה תא מסננת תא 70-מיקרומטר להסרת פסולת גדולה או תא גושים.</li>
	<li>יש לשטוף את הצלחת השתוותם מצופים OX42 שלוש פעמים עם DPBS++. אל תאפשר את הצלחת עד יבש לחלוטין בין שוטף.</li>
	<li>יוצקים את כביסה DPBS++ האחרון ולהחיל התליה תא מסוננים השתוותם למנה. בעדינות מערבולת את הצלחת להפיץ את התאים ולאחר מכן דגירה את הצלחת על משטח שטוח בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות לאפשר תאים לדבוק. דגירה לא יותר מ 20 דקות או תאים יהיה קשה מאוד לשחזר המנה.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת פנורמית עם DPBS++ 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם מחסידי. מיקרוגלייה יהיה מחובר היטב לצלחת, אז מערבולת לצלחת עם כל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים שאינם מחסידי אחרים.</li>
	<li>יוצקים את כביסה DPBS++ האחרון והחלף 15 מ"ל DPBS++ וμl 200 טריפסין (פתרון 1.25% מניות).</li>
	<li>דגירה המנה ≤10 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2 כדי trypsinize. הערה: אל תמשיך יותר מ 10 דקות או מיקרוגלייה יהפוך קשה להסיר.</li>
	<li>לאחר 10 דקות של trypsinization, עדיין יהיה תקוע מיקרוגלייה לצלחת. יוצקים את טריפסין/DPBS++ ולשטוף בעדינות 2 x עם DPBS++ כדי להסיר טריפסין, החלף 12 מ של מדיום הגידול מיקרוגלייה כקרח (MGM).</li>
	<li>המקום panning המנה בקירור למשך 2 דקות כדי לעזור להחליש את המצע תא/אינטראקציה, וודא כי המנה הוא שטוח כדי למנוע תחומי המנה השתוותם מתייבשת.</li>
	<li>פיפטה נמרצות עם 10-mL פיפטה, pipet בקר על מהירות גבוהה להתאושש תאים המנה פנורמית. שואבים רשת 16 x 16 עם הזרם של נוזל פיפטה ואנסה להסיר כל התאים.</li>
	<li>בדוק תאים במיקרוסקופ בהגדלה X 20 כדי לוודא תאים יש מנותקת צלחת. מארק כתמים על המנה שבו תאים עדיין תקוע, אני חוזר pipetting באזורים אלו.</li>
	<li>לאסוף את ההשעיה תא aliquot מ ל 3-4 של תגובת שיקוע למחזור חרוט 15-mL. ספין למשך 15 דקות ב 500 g x ב 4 ° C עם בלימה איטי. הערה: ספינינג מיקרוגלייה דרך אמצעי אחסון קטן מאפשר התאוששות מקסימלית של תאים.</li>
	<li>תשאף את תגובת שיקוע, עוזב 0.5 מ של MGM עם בגדר תא.</li>
	<li>Resuspend כל גלולה ב- MGM הנותרים, בריכה תאים מן כל הקברים.</li>
	<li>ספירת תאים עם hemocytometer.</li>
	<li>צלחת תאים כפי שמתואר שלבים 6 - 7 בהתאם ליישום.</li>
	<li>התרבות תאים ב 37 ° C עם 10% CO2. הערה: תאים יכול להיות תרבות עד 3-4 שבועות עם שינויים מדיה רגיל או שבוע אחד ללא שינויים מדיה.</li>
</ol>6. במקום ציפוי תרביות רקמה צלחות/Coverslips (יום 1)
<ol><li>צלחת 15 µL של קולגן הרביעי ציפוי ישירות במרכז צלחת 24-טוב anionic/cationic תרביות רקמה מצופה (לפרטים, ראה טבלה של חומרים ) דגירה למשך 15 דקות ב 37 ° C עם 10% CO2.</li>
	<li>לאחר ספירת תאים עם hemocytometer לדלל לתאים 2.3 x 10 /mL5ב- MGM. האחות קולגן הרביעי במקום, מיד צלחת 15 µL תא השעיה במקום הזה; זה ייתן 3.5 x 103 תאים/נקודה. תקופת דגירה של 5-10 דקות ב 37 ° C ב- 10% CO2 כדי לאפשר תאים לדבוק, להוסיף 500 µL של CO2 -equilibrated TGF-β2/IL-34/כולסטרול המכילים מדיום הגידול (טיק) בעדינות אל הבאר.</li>
	<li>אם ציפוי על coverslips, הראשון המעיל סטרילי coverslips זכוכית דקה עם 10 µg/mL ploy-D-ליזין (PDL) H2O עבור h 1-RT, לשטוף 3 פעמים עם H2O, ותנו יבש בשכונה תחת אור UV. לאחר coverslips יבש, להמשיך עם ציפוי ספוט על coverslips כמתואר ב- 6.2 שלב.</li>
</ol>7. ציפוי לבידוד RNA/חלבון
<ol><li>יום 1, המעיל כל שטח 24-טוב anionic/cationic מצופה תרביות רקמה צלחת עם ציפוי הרביעי קולגן, דגירה במשך 10 דקות - 1 h ב 37 ° C ב- 10% CO2, ולאחר מכן להסיר, מיד צלחת 3-5 x 104 תאים/טוב CO2 equilibrated טיק מדיה.</li>
	<li>יום 2, לבצע שינוי מדיה 50% עבור כל טוב יום אחרי ההכנה. תאים מתים נוטים אשכול במרכז של הבאר, אז קחו מדיה משם.</li>
	<li>לבצע שינוי 50% מדיה כל 2-3 ימים כדי לשמור על התרבויות. אם שינויים מדיה אציג משתנה לא רצויות על התרבויות, תאים יכולים לשרוד במשך כ שבוע ללא שינויים מדיה, לעומת מעל 3 שבועות עם תחזוקה שוטפת.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי המחקר בוצע בהיעדר יחסים מסחריים או פיננסי שיכול להחשב בתור ניגוד אינטרסים פוטנציאליים.

כיוון מיקרוגלייה לשמש תאים חיסוניים הפלאג של מערכת העצבים, הן מאוד קשוב לשינויים סביבתיים; לכן, זהירות רבה נדרשת כדי למזער את תגובות דלקתיות בתוך התאים במהלך הבידוד שלהם ואת התרבות8. זו מושגת ב פרוטוקול זה דרך טמפרטורה ומהירות. שמירה על התאים על קרח או ב 4 ° C בכל האפשר מקטינה באופן משמעותי ההפעלה, אז כל השלבים צנטריפוגה יתקיים ב 4 ° C, החיות הן perfused עם מאגר זלוף קר כקרח, הפרוטוקול התייעלה כדי למזער את הזמן בין רקמות חילוץ, culturing של התאים. אם הערכת דפוסי ביטוי גנים של תאים בודדים טרי, לקצו...

כמו מקרופאגים של CNS parenchyma, מיקרוגלייה לקיים אינטראקציה עם מגוון רחב של מעגלים עצביים ורשתות איתות גליה. הם ממלאים תפקיד חיוני בתחום הפיתוח הומאוסטזיס של המוח באמצעות גיזום סינפטית, סיווג תא אפופטוטיים להיפגע, ארעית אינטראקציות עם תהליכים עצביים1,2. מיקרוגלייה הם המגיבים מוקדם כדי מפציעות נוירולוגיים, הרחבת תהליכי שלהם ארוך, דק לאתרים הנגע לתאם תגובות דלקתיות ולהגביל המדמם3,4. שינויים microglial מורפולוגיה ומתפקדים בכל מקום פציעות CNS אקוטי וכרוני, נספח מיקרוגלייה שינו מורפולוגיה, לוקליזציה, ביטוי של מתווכים דלקתיים ב מגוון רחב של מחלות הברית1. מחקרים גנטיים בבני אדם מציינים כי מוטציות שמשנות סיכון למחלות ניווניות בעיקר לעיתים קרובות או באופן בלעדי מבוטאים על-ידי מיקרוגלייה ב מערכת העצבים ללא פגע, הצבעה על תפקיד קריטי עבור מיקרוגלייה בפתוגנזה של המחלה או התקדמות5 . בהתחשב שהמוניטין שלהם, פציעות ומחלות, בהבנה של ביולוגיה microglial הוא בעדיפות גבוהה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות.
רבים ההתקדמות קריטית להבנת הביולוגיה microglial נרקמו על ידי חיוץ שיטות ומנגנונים שהתגלו במחקרים של אוכלוסיות אחרות מקרופאג כולל שיטות, ביטוי גנים פרופילים של הגדרות של פונקציונלי / מורפולוגי של הברית. למרות מוכללת מקרופאג פונקציות לעתים קרובות לשחק בדרכים מפתיעות בתוך נוף CNS, מיקרוגלייה הם עצמם מאוד מיוחדים, מפגין חתימה ביטוי גנים ייחודיים המציבה אותם מלבד רקמות אחרות ומורפולוגיה כחוד מקרופאגים6. מיקרוגלייה יש שושלת זו נבדלת מקרופאגים רקמות ביותר אחרים; לישוב מערכת העצבים במהלך גל עובריים של hematopoiesis פרימיטיבית, מוקדם והם לחדש עצמי לאורך החיים, עצמאית התרומות סופית hematopoiesis7. החתימה ביטוי גנים לבגרות מלאה של מיקרוגלייה למבוגרים לא מושגת עד שבוע לאחר הלידה השניה8. רמזים סביבתיים מן הרקמה שמסביב לשחק תפקיד מרכזי הכתבת רקמות ספציפיות מקרופאג תכונות6, הכולל ב מערכת העצבים חשיפה מוגבלת נישא בדם גורמים שהעניק את מחסום הדם - מוח9.
מכשול אחד להבנת באופן מלא microglial תרומות CNS הומאוסטזיס ומחלות הוא הקושי של recapitulating מאפיינים מיוחדים של בוגרת מיקרוגלייה ראיתי ויוו עם תאים מטוהרים במבחנה. שיטות רבות פותחו כדי לבודד, תרבות מיקרוגלייה ללא פגע, אבל רוב הגישות להסתמך על סרום כדי לתמוך הישרדות cell. הראינו כי תוספת של סרום, אשר הוא ריאגנט מטבעו משתנה המכיל מגוון רחב של מולקולות ביו, בעייתית במיוחד כאשר עבודה עם מיקרוגלייה כי הוא מקדם של מורפולוגיה amoeboid, גדל התפשטות, ו phagocytosis מוגברת9 הנצפה לעתים קרובות vivo כאשר מיקרוגלייה נחשפים דם נישא גורמים לאחר ערעור מחסום הדם - מוח. על ידי מדדים אלה, תאים החשופים הנסיוב דומה מיקרוגלייה פציעה או מחלה, אבל שינויים כאלה מופחתים מתי מיקרוגלייה מתורבתים מדיום הגידול מוגדרים המכילים נוזל מוחי-שדרתי-1 (או איל-34), TGF-β, כולסטרול ו הסלנייט.
פרוטוקול זה מספק פרטים culturing עכברוש לנוער מיקרוגלייה בתנאים ללא סרום, הקשורים בעבודה שפורסם לאחרונה9. פרוטוקול זה התייעלה עבור חולדות מיום כמחנכת 21-30 (P21 - P30), אך ניתן להתאים כדי לבודד מיקרוגלייה של חולדות ועכברים בכל גיל, למרות התשואה ואת הכדאיות הכוללת ישתנו בהתאם מינים של גיל של החיה. התשואות מקסימלי ואת הכדאיות המיטבית מושגת כאשר משתמשים מעט ילדותית מיקרוגלייה (~ P9), עם תשואות הכדאיות בהדרגה אובליסק במידת מה רמות נמוכות יותר בבעלי חיים למבוגרים. מיקרוגלייה ניתן גם מבודד מן העכברים, אבל מצאנו כי תאים עכברוש להראות גבוה משמעותית בתשואות, הכדאיות ומורכבות של כחוד מורפולוגיות, בהשוואה לתאים העכבר בתרבויות ללא סרום. בעלי חיים בגיל גדול יותר P50 לא הוערכו עם פרוטוקול זה. הליך בידוד immunopanning מוטבה כדי למזער את השינויים בפרופילי תעתיק microglial במהלך בידוד, כדי למקסם את הכדאיות במורד הזרם של התאים. באמצעות טכניקות אלה ניסוחים מדיה, גבוהה-יכולת הקיום העיקרי תרבויות יכול להתקיים במשך שבועות. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה שהפגינו מורפולוגיה כחוד מאוד מעורבים הרחבה מהירה ו הכחשה של תהליכים, נמוכה יחסית המחירים של התפשטות. להדגיש את חשיבות סרום-חשיפה על מאפיינים אלה, ואנו נדבר על נקודות החוזק והחולשה של שיטה זו ביחס גישות אחרות.

<table><tbody><tr><td>חולדה: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נגד חולדות CD11b חד שבטי (שיבוט OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>פאנינג: 1:1,000; צביעה: 1:500</td></tr><tr><td>עז פוליקולונל אנטי-IBA1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>צביעה: 1:500</td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>צביעה: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey נגד עכבר 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>מכתים: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey נגד עזים 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>צביעה: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa פלואור חמור נגד ארנב 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>מכתים: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (חומר ניקוי בצביעה ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td>Galen ציוד מעבדה</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>פפטון ממוצקי חלב</td><td>סיגמא</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>עכברים IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול צמר בקר</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אולאית</td><td>קיימן כימיקלים&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) חומצה</td><td>קיימן כימיקלים&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM dye</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>חתול # 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>חתול# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז גבוה)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פרימריה&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>תגובות</strong</td></tr><tr><td>>ריאגנטים למלאי&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפו-טרנספרין</td><td></td><td></td><td>בנייה מחדש: 10 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>N-אצטיל ציסטאין</td><td></td><td></td><td>בנייה מחדש: 5 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td></td><td></td><td>בנייה מחדש: 2.5 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:25,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>קולגן IV</td><td></td><td></td><td>בנייה מחדש: 200 &mu; גרם/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -80&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>בנייה מחדש: 2 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitution: 200 &mu; גרם/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -80&deg; </td></tr><tr><td>C כולסטרול</td><td></td><td></td> צמר בקר <td>בנייה מחדש: 1.5 מ"ג/מ"ל ב-100% אתנול ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Heparan sulfate</td><td></td><td></td><td>Reconstruction: 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>חומצה אולאית/חומצה</td><td></td><td></td> גונדואית<td>: גונדואית: 0.001 מ"ג/מ"ל; אולאית: 0.1 מ"ג/מ"ל ב-100% אתנול ריכוז בשימוש: 1:1,000 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td>Reconstruction: 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS ריכוז בשימוש: 1:100 אחסון: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; מתכון </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חיץ</td><td></td><td></td> זלוף<td>: 50 &mu; g/mL heparin ב-DPBS++ (PBS עם Ca++ ו-Mg+ +) הערות: השתמש כאשר</td></tr><tr>מתכון מאגר <td></td><td></td><td>דונקינג</td> קר כקרח<td>: 200 &mu; L של 0.4% DNaseI ב-50 מ"ל של DPBS++ הערות: השתמש כאשר</td></tr><tr>מתכון חיץ <td></td><td></td><td>פאנינג</td> קר כקרח<td>: 2 מ"ג/מ"ל פפטון ממוצקי חלב ב-DPBS++</td></tr> <tr><td>Microglia Growth Medium (MGM)</td><td></td><td></td> <td>מתכון: DMEM/F12 המכיל 100 יחידות/מ"ל פניצילין, 100 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ גלוטמין, 5 ו-mu; גרם/מ"ל N-אצטיל ציסטאין, 5 &mu; גרם/מ"ל אינסולין, 100 &mu; גרם/מ"ל אפו-טרנספרין, ו-100 ננוגרם/מ"ל נתרן סלניט הערות: השתמש ב-MGM קר כקרח כדי להוציא מיקרוגליה מכלי אימנופאנינג.</td></tr><tr>מתכון <td>לציפוי</td><td></td><td></td> קולגן IV<td>: MGM המכיל 2 &mu; מתכון</td></tr><tr>חיץ <td></td><td></td><td>הפרדת מיאלין</td> קולגן IV <td>קולגן: 9 מ"ל פרקול פלוס, 1 מ"ל 10x PBS ללא Ca++ ו-Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 הערות: מערבבים היטב לאחר הוספת &nbsp; CaCl2 ו-MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/כולסטרול המכיל מצע גדילה (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מתכון: MGM המכיל 2 ננוגרם/מ"ל TGF-b2 אנושי, 100 ננוגרם/מ"ל עכברים IL-34, 1.5 &mu; גרם/מ"ל כולסטרול צמר עברים, 10 &mu; גרם/מ"ל הפראן סולפט, 0.1 &mu; גרם/מ"ל חומצה אולאית, ו-0.001 &mu; גרם/מ"ל חומצה גונדואית הערות: הקפידו להוסיף כולסטרול למצע שחומם ל-37 מעלות; C ואל תוסיף יותר מ-1.5 &mu; גרם/מ"ל או שהוא ישקע החוצה. אין לסנן מדיה המכילה כולסטרול. אזנו את מדיית ה-TIC עם 10% CO2 למשך 30 דקות עד שעה לפני הוספתם לתאים כדי להבטיח pH אופטימלי.</td></tr></tbody></table>

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

מיקרוגלייה לייצג 5-10% של כל התאים במערכת העצבים המרכזית (CNS), יותר ויותר מושכים תשומת לב בשל תרומתם במהלך הפיתוח, הומאוסטזיס, ומחלות. למרות מקרופאגים נחקרו בפירוט במשך עשרות שנים, תכונות מיוחדות של מיקרוגלייה, את המקרופאגים רקמות תושב של מערכת העצבים, נותרו במידה רבה מסתורי, בין השאר בשל מגבלות ביכולת להתרכז microglial בוגרת מאפיינים בתרבות. כאן, אנחנו להמחיש תהליך פשוט לבידוד מהירה של מיקרוגלייה טהור מהמוח מכרסמים בוגרת. אנו מתארים גם תנאים תרבות ללא סרום התומכים רמות גבוהות של הכדאיות microglial לאורך זמן. מיקרוגלייה תרבותי בתנאים אלה מוגדרים-בינוני התערוכה תהליכים כחוד משוכלל והתנהגות מעקב דינמי. אנו להמחיש כמה תופעות של סרום חשיפה על מיקרוגלייה בתרבית, לדון איך תרבויות אלה ללא סרום בהשוואה הן תרבויות החשופים סרום, כמו גם מיקרוגלייה בתוך vivo.

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי מיקרוגלייה טוהר גבוהה כחוד תרבות של חולדות לנוער. תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות בעלי חיים ילדותית, הלידה, למבוגרים, כפי שמתואר להלן. מאז תא ומשום כוללים לעיתים קרובות בניואנסים, הזדמנויות רבות עבור תאים למות, השתמשנו בקרת איכות מחסומים כדי לקבוע להצלחה בכל השלבים השונים. אנחנו בדרך כלל פיקוח תא המתלים. באמצעות hemocytometer של מספר השלבים בפרוטוקול בידוד (איור 1 א'). ומשום מוצלחת אמור להניב 2.5-5 x 105 תאים/לנוער בעלי חי...

יש כבר נכשל בשל מאמצים כדי להבין microglial פונקציה בפירוט חוסר בדגמי תרבות microglial לסכם את מאפייני מיקרוגלייה בוגרת ויוו . פרוטוקול זה מתאר גישה בידוד ותרבות שנועדו לשמור על ההישרדות חזקים של עכברים בוגרים מאוד כחוד מיקרוגלייה בתנאים מוגדרים-בינוני.

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול תרבית תאים זה היא לייצר תרביות טהורות ביותר של מיקרוגליה ממכרסמים מתפתחים או בוגרים שניתן לתחזק ללא חשיפה לסרום. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח הקשורות למורפולוגיה של מיקרוגליה, קטוזיס סיבי ואינטראקציה של מיקרוגליה עם סוגי תאי CNS אחרים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שניתן לבודד במהירות מיקרוגליה מרקמת מכרסמים בכל גיל ולתרבית ללא חשיפה לסרום.כדי להסיר את המוח, חתכו את הקונדיל העורפי מחוט השדרה של בעל חיים משני הצדדים בעזרת מספריים לדיסקציה, והקפידו לא לפגוע במוח. לאחר מכן, חותכים עור לאורך החלק העליון של הגולגולת, וחותכים צד אחד לאורך העצם הקודקודית והקדמית לכיוון עצם האף. משוך בזהירות את החלק העליון של הגולגולת לאחור בעזרת מלקחיים, הסר במהירות את המוח והנח אותו ב-DPBS מקורר מראש על קרח.חזור על ההליך עבור כל בעלי החיים הנותרים. לאחר שהמוחות נאספו ב-DPBS קרים, קוצצים כל מוח לקובייה אחת של מילימטר בצלחת פטרי על קרח עם להב אזמל קר ומעבירים להומוגניזטור קר כקרח עם חמישה עד שבעה מיליליטר של חוצץ קר כקרח. לאחר מכן, השתמש בהומוגנייזר רופף כדי לנתק את הרקמה עם 10 עד 20 משיכות עדינות ולא שלמות.הקפד לא לרסק ישירות את הרקמה בתחתית ההומוגנייזר. במקום זאת, דחף את הרקמה דרך הרווח שבין דפנות הבוכנה להומוגניזטור. חשוב להומוגניזציה איטית של הרקמה עם סבבים מרובים של סינון כדי לשמר את כדאיות המיקרוגליה.לאחר מכן, הסר בזהירות את הבוכנה כדי למנוע הכנסת בועות אוויר. אפשר לגושי רקמה מנותקים בצורה גרועה להתיישב בתחתית ההומוגנייזר ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש, צונן, של 50 מיליליטר. לאחר מכן, החלף את הנפח שהוסר במאגר ניקוד טרי וחזור על הליך הדיסוציאציה למשך שלושה עד ארבעה סבבים בסך הכל, או עד שכל הרקמות התנתקו.בהליך זה, הוסף מאגר סינון קר כקרח לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את מתלה התא והתאם את הנפח הכולל ל-33.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר MSB לתרחיף התא וערבב היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. זה יביא לריכוז סופי של 23% של MSB בנפח של 43.5 מיליליטר.לאחר מכן, צנטריפוגה של התאים למשך 15 דקות ב-500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס עם בלימה איטית. לאחר מכן, הסירו את השכבה העליונה של המיאלין והפסולת ואת הסופרנטנט בעזרת פיפטה. היזהר בעת הסרת השכבה העליונה כדי להבטיח שכמה שיותר ממנה יוסרו.לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא ב-12 מיליליטר של מאגר פאנינג. יש לשלש בעדינות את תרחיף התאים כדי לפרק את כל גושי התאים שנותרו. בשלב זה, העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר פסולת גדולה או גושי תאים.שטפו את צלחת הפאנינג המצופה OX42 שלוש פעמים עם DPBS. אל תאפשר לצלחת להתייבש לחלוטין בין כביסות. יוצקים את שטיפת ה-DPBS האחרונה ומורחים את מתלה התאים המסוננים על צלחת הפאנינג.סובב בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את התאים. לאחר מכן, דגרו את הצלחת על משטח ישר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר לתאים להידבק. אין לדגור יותר מ -20 דקות, אחרת התאים יתקשו מאוד להתאושש מהמנה.לאחר מכן, שטפו את כלי הפאנינג עם DPBS 10 פעמים כדי להסיר תאים שאינם דבקים. מיקרוגליה תהיה מחוברת היטב לצלחת, לכן סובב את הצלחת בכל שטיפה כדי להבטיח הסרה של תאים אחרים שאינם נצמדים. יוצקים את שטיפת ה- DPBS האחרונה ומחליפים ב -15 מיליליטר DPBS ו -200 מיקרוליטר טריפסין.כדי לנסות את התאים, דגרו את המנה למשך פחות או שווה ל-10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של טריפסיניזציה, מיקרוגליה עדיין תהיה דבוקה לצלחת. יוצקים את התערובת ושוטפים בעדינות את הצלחת פעמיים עם DPBS כדי להסיר את הטריפסין.לאחר מכן, החלף ב -12 מיליליטר MGM קר כקרח. לאחר מכן, הניחו את צלחת הפאנינג על קרח למשך שתי דקות כדי לעזור להחליש את האינטראקציה בין התאים והמצע ולוודא שהצלחת שטוחה כדי למנוע התייבשות של אזורים בכלי הפאנינג. לאחר מכן, פיפטה במרץ עם פיפטה של 10 מיליליטר ובקר פיפטה במהירות גבוהה כדי לשחזר תאים מצלחת הפאנינג.ציירו רשת בגודל 16 על 16 עם זרם הנוזל מהפיפטה כדי לנסות להסיר את כל התאים. חשוב למצוא איזון בין התאוששות התאים הכוללת לבין בריאות התרבית שלך. פיפטינג חוזר ונשנה של התא כנגד צלחת הפאנינג יביא להפחתת הכדאיות של התרבית שלך.בדוק את התאים במיקרוסקופ בהגדלה של פי 20 כדי לוודא שהם התנתקו מהצלחת. סמן את הכתמים על גבי הכלי שבהם תקועים תאים וחזור על פיפטינג באזורים אלה. אסוף את תרחיף התאים והקצה שלושה עד ארבעה מיליליטר של סופרנטנט בכל צינור חרוטי של 15 מיליליטר.סובב אותו במשך 15 דקות ב-500 x גרם בארבע מעלות צלזיוס עם בלימה איטית. לאחר 15 דקות, שאפו את הסופרנטנט והשאירו 0.5 מיליליטר MGM עם כדור התא. לאחר מכן, השעו מחדש כל כדור ב-MGM שנותר ומשכו את התאים מכל הצינורות.לאחר מכן, ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר. כעת, צלחת 15 מיקרוליטר של ציפוי קולגן IV ישירות במרכז צלחת תרבית רקמה קטיונית מצופה 24 בארות ודגירה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ספירת התאים עם המוציטומטר, יש לדלל אותם ל-2.3 x 10 לחמישה למיליליטר ב-MGM.שאפו את נקודת הקולגן IV וצלחו מיד 15 מיקרוליטר של תרחיף תאים לנקודה זו כדי להניב 3.5 x 10 לשלושת התאים בכל נקודה. לאחר מכן, דגרו במשך חמש עד עשר דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להידבק. לאחר מכן, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של TIC מאוזן CO2 לבאר.אם ציפוי על החלקות כיסוי, יש לצפות תחילה את תלושי כיסוי הזכוכית הסטריליים ב-10 מיקרוגרם למיליליטר PDL במים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים במים ותנו להם להתייבש במכסה המנוע תחת אור UV לפני שתמשיכו בציפוי נקודתי על החלקות הכיסוי. על מנת להדגים בידוד ותרבית מוצלחים של מיקרוגליה טהורה ביותר, בודדנו מיקרוגליה מחולדות P21 ותרבית תאים אלה ב-TIC או TIC בתוספת 10% FCS במשך שמונה ימים.לאחר מכן התאים תוקנו ונצבעו בסמני מיקרוגליה וסמני התפשטות. תאים שגודלו ב-TIC מראים מורפולוגיה מסועפת, רמות נמוכות של התפשטות וביטוי של סמני מיקרוגליה. לשם השוואה, תאים שגודלו ב-TIC בתוספת 10% FCS נצבעו גם לסמני מיקרוגליה, אך מראים רמות גבוהות של התפשטות ומורפולוגיה אמבואידית, תכונות שנראות לעתים קרובות במיקרוגליה מופעלת.בנוסף לצביעה לסמני תאים, RNA-Seq על תאים מבודדים טריים יכול לספק כלי רב עוצמה ורגיש להערכת פרופיל ה-RNA של התאים ויכול לסייע במידע על טוהר ההתחלה של תרביות. מיקרו-פאנינג CD11b מביא בדרך כלל לאחוז קטן של נויטרופילים חיוביים CD11b והעברת מונוציטים, בנוסף למיקרוגליה חיובית CD11b. תאים אלה ימותו ב-TIC לאחר מספר ימים, אך יכולים לסבך את הניתוח של נקודות זמן מוקדמות יותר.הנה סרטון זמן-lapse של מיקרוגליה של חולדות P21 לאחר 14 DIV ב-TIC. לאחר שבועיים, תרביות ללא סרום מראות התנהגות מעקב דינמית עם הארכות ונסיגות מהירות של התהליך בכל המנה. הנה סרטון זמן-lapse של מיקרוגליה של חולדות P21 לאחר חמישה DIV ב-TIC לפני ואחרי חשיפה לסרום עגל עוברי.שינוי מורפולוגי מהיר ניכר לאחר חשיפה לסרום. לאחר שליטה, ניתן לבצע פרוטוקול זה תוך ארבע עד חמש שעות, אם מבוצע כראוי. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות אחרות לניטור פגוציטוזיס, כימוטקסיס, הישרדות, שחרור ציטוקינים, תגובות שעתוק לגירויים, על מנת לענות על שאלות נוספות על תפקוד מיקרוגליה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד במהירות מיקרוגליה מרקמת מכרסמים בוגרים ולתרבית אותם בתנאים נטולי סרום.

isolation-culture-rodent-microglia-to-promote-dynamic-ramified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד וטיפוח תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות. זה כרוך בהפרדת מיקרוגליה מתאים עצביים ולא עצביים אחרים באמצעות לוחות המצופים בנוגדן חד שבטי ספציפי למיקרוגליה.

בידוד ותרבית של תאי מיקרוגליה ממוחות של חולדות באמצעות מדיה נטולת סרום

סרטון זה מדגים טכניקה להסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית עצבית ראשונית של חולדות. נוירונים גרגירים cerebellar מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גלייה מתרבים. בנוסף, הם מטופלים בחומרים ממוקדי ליזוזום כדי לרוקן מיקרוגליה מהתרבית.

הסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית נוירונים של גרגיר המוח הקטן של חולדה

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.

קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של אסטרוציטים מטוהרים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר, ומקל על יישומים עתידיים כגון ניתוח RNA ותרבית תאים. הוא כולל שיטות ונהלים מפורטים לדיסוציאציה של תאים שנועדו לשפר הן את האיכות והן את התפוקה של תאים מבודדים.

בידוד אסטרוציטים טהורים ותאי מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר הבוגר עבור בדיקות חוץ גופיות ומחקרי שעתוק

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

למד לבודד ולגדל מיקרוגלייה ממוחות מכרסמים במדיום נטול סרום. שיטה זו מאפשרת שמירה על מורפולוגיה פיזיולוגית וחקר אינטראקציות עם תאי מערכת העצבים המרכזית.

בידוד והתרבות של מכרסמים מיקרוגלייה לקדם דינאמי כחוד מורפולוגיה במדיום נטול סרום

גלה סרטונים נוספים