Name: הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למדו שיטות psPACT ו-mPACT לניקוי מהיר של רקמת מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות. טכניקות אלו מאפשרות שקיפות אופטית מלאה תוך שבועיים ומסייעות בחקר מחלות נוירודגנרטיביות כמו אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט המוח קוריאה 21 פלוס למדעי הרפואה, אוניברסיטת Yonsei. בנוסף, עבודה זו נתמכה על ידי מענק נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ה-NRF-2017R1D1A1B03030315).

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה מחקר מתאים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei. כל החיות ניסיוני מוקרבים בהתאם לקווים המנחים של הוועדה טיפול בבעלי חיים מעבדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת Yonsei.
1. הכנת נוגדנים
התראה: Paraformaldehyde (PFA), אקרילאמיד ו נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי; חלוק, כפפות, מגן eyewear).
<ol><li>4% אקרילאמיד (א. א) פתרון (A4P0): להוסיף 20 מ של 40% אקרילאמיד פתרון עד 180 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS).</li>
	<li>0.25% VA-044 פתרון: להוסיף 0.5 גר' 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] אבקת dihydrochloride (VA-044) עד 200 מ"ל תמיסת 0.1 M באגירה פוספט (PBS). אמנם ניתן לאחסן את האבקה VA-044 בטמפרטורת החדר, זה להיות מאוחסן ב 4 ° C על solubilization ב- PBS. לקבלת תוצאות מיטביות, להכין רק את כמות פתרון לצורך הניסוי.</li>
	<li>פתרון קוקטייל ברית: להוסיף 10 גרם של אקרילאמיד 225 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון ולכוונן את העוצמה עד 200 מ"ל עם 4% מחברים. לפני השימוש, להוסיף 100 מ ג של אבקת VA-044 40 מ"ל של תערובת צינור חרוטי 50 מ.</li>
	<li>הסכם סליקה מאגר פתרון: להוסיף 40 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 350 מ של 0.1 M PBS ולכוונן את העוצמה עד 500 מ"ל עם PBS 0.1 M. עבור mPACT ניקוי פתרון, להוסיף 0.5% α-thioglycerol ההסכם ניקוי מאגר פתרון.</li>
	<li>העכברים השתמשו במחקר זה היו עכברים זכרים BALB בת שבוע-2; החולדות השתמשו במחקר זה היו עכברי-SD זכר 2 בן שבועיים.</li>
</ol>2. הרדמה וניתוח זלוף
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
<ol><li>עזים ומתנגד החיה בחדר נטול הפתוגן עם 30 מ"ג/ק"ג של zoletil באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26-מד. לפקח על החיה עבור 5-10 דקות.</li>
	<li>ברגע החיה הגיעה מטוס כירורגי של הרדמה, השתמש בשיטה הבוהן-קמצוץ תגובה כדי לקבוע את העומק של הרדמה. לאשר בעיית חוסר. הערה: השלבים הבאים לערב עכבר ועכברוש, ניתוח בצע דומה פרוטוקול המשמש במחקר הקודם11.</li>
	<li>עושים חתך 5-6 ס מ מתחת לצלעות, דרך דופן הבטן בעור.</li>
	<li>להשתמש במספריים מעוגלים, בוטה לבצע חתך הסרעפת, palpating את אזור בית החזה כדי לאתר את האתר של החתך מראש.</li>
	<li>להרחיב את החתך מעבר לכל אורכה של קשת הצלעות לחשוף את חלל הצדר.</li>
	<li>תחסיר בקפידה את הריאות. לעשות חתך דרך. קשת הצלעות עד לעצם הבריח. באמצעות מספריים איריס, לבצע חתך קטן בקצה האחורי של החדר השמאלי. הכנס של המחט אל תדאגי בלאנט או זית-שקצהו זלוף אבי העורקים, עובר דרך החדר חתוכה.</li>
	<li>לאבטח את המחט ולמנוע זליגת מאת מחבר חובק למעקה הלב עם עוצר דימום. לחלופין, השתמש עוצר דימום ששונה כדי לצבוט העורקים סביב קצה המחט.</li>
	<li>עושים חתך גדול באטריום ימין, מטפל על מנת להבטיח מינימום נזק העורקים. העכברוש מוכן כעת זלוף.</li>
</ol>3. כל זלוף, דיסקציה של עכברוש
התראה: PFA אקרילאמיד הם רעילים המגרים, וכך צריך להיות מטופל בשכונה fume עם עיקרון השוויון הפוליטי המתאים.
הערה: השלבים הבאים זלוף כל דומים פרוטוקול המשמש במחקר הקודם מאת Woo ואח. (2016) 10 , 11.
<ol><li>לצרף את העלייה הימנית של הלב מחט בקוטר 18, מקפיד לא להציג את כל בועות האוויר.</li>
	<li>באמצעות מזרק 50 מ ל, במהירות ובצורה שווה לשאוב 50 מ של קר 0.1 M PBS לאודנום הפארין (היחידות 10/mL).</li>
	<li>לחבר את המחט אל תדאגי הצינור של המשאבה ממברנות.</li>
	<li>לשטוף עם 200 מ של 0.1 M קר PBS פתרון המכיל הפארין (היחידות 10/mL) במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה.</li>
	<li>לתקן עם 250 מ של 4% קר PFA פתרון במהירות זרימת הדם של 10 מ"ל לדקה. העכברוש צריך להיות נוקשה בשלב זה.</li>
	<li>לאסוף ולאחסן את הפתרון PFA הנותרים עבור סילוק.</li>
	<li>עבור ברית, perfuse רקמות עם פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 אבקה עם מחט בקוטר 18 ולאחר מכן הסר את הראש ועמוד השדרה. לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתך קו האמצע של הצוואר האף. שלב נוסף זלוף זה מיותר עבור השיטות psPACT ו- mPACT; לאחר קיבוע, מיד לבודד את הראש ועמוד השדרה ולחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>לחשוף את בסיס הגולגולת על-ידי הסרת כל שריר עמוד השדרה והצוואר שיורית.</li>
	<li>השתמש rongeurs ומספריים כדי לקלף את הגולגולת. הסר את המוח ואת חוט השדרה.</li>
	<li>לאחסן את הרקמה 4% מחברים ב 4 ° C; רקמות ניתן לאחסן עד 1 לשבוע.</li>
</ol>4. הידרוג מונומר אינפוזיה, פלמור של מערכת העצבים עכבר ועכבר
התראה: אקרילאמיד, למען חברה דמוקרטית, α-thioglycerol ו- PFA המגרים, וכך צריך להיות מטופל ברדס fume ועם שתן המתאים.
<ol><li>
ברית (פסיב פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד, תרבות של כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) מ קבוע עכברים וחולדות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל פתרון קוקטייל צונן ברית של 4% מחברים, אקרילאמיד 4%, ו- 0.25% VA-044 אבקה, חנות ב 4 ° C עבור ה 24 ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין ה-s olution.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל מערכת הכלאה מחובר למיכל חנקן: הגדר את המערכת 37 מעלות צלזיוס. להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) ברית פתרון קוקטייל, להתחבר עם הצינורית, לאחר מכן את הריב.</li>
		<li>כדי פולימריזציה של הידרוג, במקום הצינור המכיל את מדגם חממה חזק (150 סל ד, 37 ° C) במשך 3 שעות, או עד הפילמור הושלם.</li>
		<li>באמצעות נייר סופג (ראה טבלה של חומרים), הסר הידרוג polymerized הנותרים של הרקמות הסובבות.</li>
		<li>להעביר את רקמת צינור 50 מ ל המכיל פתרון סליקה (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח בערך 20 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (תהליך נפרד טכניקת ניקוי פסיבי)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>העברת רקמות לרכבת התחתית 50 מ ל המכיל 4% מחברים, וחנות ב 4 ° C עבור 24h. להבטיח כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין מקבע.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה קבוע עבור 1 h ב- PBS 0.1 M, ולאחר מכן להעביר A4P0 פתרון (4% אקרילאמיד ב- PBS 0.1 M). חנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
		<li>לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות ב- PBS 0.1 M.</li>
		<li>לטבול את הרקמה ב- 0.25% VA-044 ב- PBS 0.1 M. לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 6-24 שעות, ולאחר מכן להעביר לפתרון VA-044/PBS טריים של 0.25%.</li>
		<li>להטביע את הדגימה גז חנקן במשך 10 דקות בעזרת טישו ג'ל הכלאה המערכת (ראה טבלה של חומרים) מחובר למיכל חנקן: להעביר לרקמות שפופרת 50 מ ל המכיל טרי קר (4 ° C) פתרון VA-044/PBS 0.25%, ולהתחבר עם הצינורית. הפעל את שואב האבק.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון (8% מרחביות ב 0.1 M PBS, pH 8.0).</li>
		<li>דגירה על מדגם חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כ- 17 ימים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (ששונה פסיבי פינוי טכניקה)
	<ol>
<li>לבודד את כל מערכת העצבים המרכזית (המוח ועמוד השדרה) עם עצם קאטר ומספריים של כדורגלן-קבוע עכברים וחולדות על ספסל נקי.</li>
		<li>בצע את שלבים 4.2.2 - 4.2.8 של הפרוטוקול psPACT.</li>
		<li>העבר את הרקמה ניקוי פתרון. שים לב כי בניגוד הפרוטוקולים ברית ו- psPACT, mPACT מחייב פתרון סליקה בהיקף של 0.5% α-thioglycerol בנוסף מרחביות 8% ב- 0.1 M PBS, pH 8.0. Α-thioglycerol הוא סוכן האו ם browning המסייעת לנקות רקמות יותר במהירות וביעילות. ודא כי הרקמה הוא שקוע לחלוטין הפתרון.</li>
		<li>מקם את הדגימה חממה חזק מוגדר 37 ° C ו 150 סל ד עד הרקמה נוקתה. בממוצע, זה לוקח כשבועיים עבור העכבר CNS להשגת בהירות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. מקדם שבירה התאמה ו Immunostaining של CNS שנוקה
הערה: nחישוקים (מבוסס-Nycodenz השבירה התאמת פתרון) מורכב אבקת Nycodenz 0.8 g/mL מומס מאגר הבסיס 30 מ ל (אזיד הנתרן 0.01% ו- Tween-20 ב 0.1 M PBS, pH 8.0). מומלץ כי הפתרון נמצא במחלקה של 37 ° C רועד חממה כדי לאפשר יוצרות נאותה של האבקה.
<ol><li>דגירה רקמות ב- 0.1% טריטון X-100 ב 0.1 M PBS כבר שעתיים, ואז לחסום עם 2% שור אלבומין (BSA) ב- PBS 0.1 M עבור 6-אייץ '.</li>
	<li>לשטוף את סעיפים 3 פעמים ב- PBST (0.1% Tween-20 ב- PBS 0.1 M) עבור ה 2 כתם מקטעים עם נוגדנים הראשי (במקרה זה, נוגדן אנטי-ארנב PECAM-CD31, אשר את כתמי הדם) במשך יומיים.</li>
	<li>כתם מקטעים עם נוגדנים משניים (בבמקרה זה, עז ארנב אנטי Cy3 אג פלורסנט המספר המשלים) ב- 2% BSA במשך יומיים.</li>
	<li>שטיפת בתווית רקמות שלוש פעמים ב- PBST עבור 2 h, חנות 15 מ"ל חישוקים n2-10 ימים.</li>
	<li>לפני הדמיה, להעביר רקמות שכותרתו כמות קטנה של nחישוקים על מנות תרביות רקמה 35 או 60-מ מ. לתקן עם סיליקון סביב הקצה התחתון של המנה.</li>
	<li>להוסיף 1.5-2 מ"ל של המכון טריים n.</li>
</ol>6. עיבוד תמונה
<ol><li>לרכוש תמונות של רקמות שנוקה עם אריח סריקה באמצעות של קונפוקלי סורק לייזר microscopewith 10 x הגדלה (ראה טבלה של חומרים). עבור התווית על-ידי Cy3 רקמות, השתמש אורכי הגל של 550-600 ננומטר.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בעוד בשיטות חילוץ פאסיביים, שאינם electrophoretic המועסקים ברית לשפר באופן משמעותי את עקביות מושגת עם רקמת הקודם ניקוי שיטות כגון בהירות2,3,4,7 , 8, הטכניקה עדיין נושאת מספר חסרונות, הקשה ביותר של אשר הוא משך הזמן הדרוש להשגת בהירות רקמות מקסימלי12. במחקר הנוכחי, אנו מציגים ששונה פרוטוקולים ברית להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש בשביל ...

המטרה הבסיסית חקירה מדעית וקלינית כרוכה השגת הבנה מלאה של איבר מבנה ותפקוד; עם זאת, האופי המורכב ביותר של איברים יונקים לעתים קרובות מגישה כמחסום להשגת המטרה הזו1באופן מלא. בהירות (החלפת השומנים ברור hybridized אקרילאמיד נוקשה הדמיה תואמי Tisssue-הידרוג)2,3,4, הכוללת בנייה של היברידית הידרוג מבוססי אקרילאמיד רקמות ללא פגע, משיגה סיווג אופטי מגוון רחב של איברים, כולל את המוח, הכבד, הטחול, תוך שמירה על שלמות המבנה שלהם5. בהירות אפשרה ובכך לא רק ויזואליזציה, אלא גם הזדמנות דק לנתח רשתות הסלולר מורכבות מורפולוגיות רקמות ללא צורך חלוקתה.
כדי להשיג את סיווג רקמות, בהירות מעסיקה electrophoretic שיטות להסרת התוכן השומנים המדגם בהישג יד. בעוד בהירות נרשמה לייצור רקמות במצב יציב-הידרוג כלאיים, מחקרים הראו כי בזכות השימוש בשיטות ניקוי (וכו ') רקמת electrophoretic מפיקה את התוצאות משתנה מבחינת איכות לרקמות, לרבות, בראונינג, נזק epitope, ו איבוד חלבון5,6. כדי לטפל בבעיות אלה, ששונה פרוטוקולים כגון ברית (טכניקה פסיבי של בהירות), אשר מחליף את הטיפול וכד' עם טכניקה הפסיבי, חומרי יוניים delipidation מבוסס, כבר מפותחת7,8,9. למרות השגת עקביות יותר תוצאות, עם זאת, ההסכם דורש יותר זמן כדי לקבל אישור מקסימלי. יתר על כן, אף אחת משיטות אלה טרם הוחלו את כל הטופס CNS או לפי דגמים גדולים מכרסמים כגון עכברים, שרקנים.
המחקר הנוכחי מבקשת להתייחס הגבלות אלה על-ידי מציע מתודולוגיות הרומן, psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), להקלה על פינוי מהיר של כל מערכת העצבים המרכזית ואיברים פנימיים מודלים גם העכבר וגם עכברוש10. באופן ספציפי, psPACT מעבד רקמות אקרילאמיד 4% ו- 0.25% VA-044 בשני שלבים נפרדים במהלך היווצרות הידרוג; mPACT בעיקרו של דבר כרוך אותם שלבים, אבל תוספי תזונה פתרון סליקה מבוססי מרחביות עם 0.5% α-thioglycerol כמו מפתח תגובה כימית. בשתי הטכניקות לרתום את אנדוגני מערכתית cerebrospinal הדם ומערכות תפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי לייצר סיווג אופטי. מהווה הוכחה של עיקרון, נדגים את השימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית לנתח כלי דם דפוסים רקמות שנוקה10.

<table><tbody><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>פתרון סליקה</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>תמיסת nRIMS</td></tr><tr><td>40% תמיסת אקרילאמיד</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>פילמור (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&acute;-אזוביס [2-(2-אימידזולין-2-יל)פרופאן] דיהידרוכלוריד</td><td>וואקו תעשיות כימיות טהורות, בע"מ</td><td>017-19362</td><td>פילמור (VA-044)</td></tr><tr><td>1-תיוגליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M1753-100ML</td><td>תמיסת ניקוי (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>תמיסת nRIMS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td> אלבומין סרום בקר <td>צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>(BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>הפרין צביעה חיסונית</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS תמיסת</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה בע"מ</td><td>sc-28188</td><td>צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>עז אנטי-ארנב-IgG Cy3 מצומד פלואורסצנטי</td><td>ג'קסון ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Tech & חדשנות</td><td>BPP-9004</td><td>זלוף, פילמור</td></tr><tr><td>20X פוספט חוצץ מלח (pH 7.4)</td><td>Tech & חדשנות</td><td>BPB-9121</td><td>זלוף, מאגר</td></tr><tr><td>10 מ"ל פס</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>העברת תמיסה</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>צינור פינוי</td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תרבית תאים</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>צלחת קונפוקלית</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>קוריאה חיסון ושות', בע"מ</td><td>26G 1/2</td><td>הרדמה&nbsp;</td></tr><tr><td>50 מ"ל מזרק</td><td>קוריאה חיסון ושות', בע"מ</td><td>21G1 1/4</td><td>זלוף</td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3553</td><td>פילמור (A4P0)</td></tr> <tr><td>נייר Whatman 3 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>נייר ספיגה להסרת ג'ל</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>הדמיה</td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>זלוף</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>מערכת הכלאת ג'ל רקמות</td> <td>EasyGel</td></tr></tbody></table>

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה cns

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

מאז הפיתוח של בהירות, bioelectrochemical פינוי טכניקה המאפשרת למיפוי פנוטיפ תלת מימדי בתוך רקמות שקוף, שפע של מתודולוגיות סליקה הרומן כולל מעוקב (הדמיה מוחית ברור, בלא הפרעה קוקטיילים וניתוח חישובית), מתג (פקד-מערכתיות של אינטראקציה עם הזמן) וקינטיקה של כימיקלים, מפה (מוגדל ניתוח של פרוטאום) ו ברית (טכניקה בהירות פסיבי), הוקמו להרחיב את ערכת הכלים הקיימים עבור ניתוח מיקרוסקופי של רקמות ביולוגיות. מטרות המחקר הנוכחי כדי לשפר ולמטב את הנוהל ההסכם המקורי עבור מערך של רקמות מכרסמים שלם, כולל את כל מערכת העצבים המרכזית (CNS), הכליות, הטחול העכבר כל העוברים. כינה psPACT (ברית נפרדת תהליך) ו mPACT (שהשתנה ההסכם), טכניקות הרומן אלה מספקים אמצעי מניעה תכופה מיפוי תא המעגלים והצגה של מבנים subcellular ברקמות נורמליים ופתולוגיים ללא פגע. בפרוטוקול הבא, אנו מספקים מתווה מפורט, צעד אחר צעד כיצד להשיג סיווג רקמות מקסימלי עם הפלישה מינימלי של המבנית שלהם דרך psPACT ו- mPACT.

הדור של דגם שקוף של מערכת העצבים כל באמצעות טכניקות אופטימיזציה סליקה פסיבי
סיווג אופטי של עכבר, חולדה רקמות CNS כל הושג במהירות תוך שימוש בטכניקות שונות סליקה פסיבי (איור 1). תיאור סכמטי של רקמות ניקוי במשך הזמן מוצג באיור 2A. שלא כמו שיטת ההסכם המקורי, psPACT (ברית נפרדת בתהליך) כרוך בטיפול דגימות עם 4% אקרילאמיד (A4P0) והפתרון יוזם VA-044 0.25% בשני ...

כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

המטרה הכוללת של שיטות psPACT ו-mPACT אלה היא ניקוי מהיר של רקמת מערכת העצבים המרכזית השלמה ללא צורך במערכת ניקוי רקמות אלקטרופורטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מודל המחקר של מחלות אנושיות, כגון מחלת אלצהיימר או פציעה וניוון וגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שרקמת מערכת העצבים המרכזית של העכבר אינה נפגעת מניקוי הרקמה האלקטרופורטית, והיא מתנקה במהירות על ידי ניקוי פסיבי שונה.הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה אחרי שהשתמשנו ב-PACT המקורי ובשיטה הקודמת לניקוי המוח. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להפעיל את שיטת psPACT ו-mPACT מכיוון שלשיטה זו יש מספר שלבים של הכנת דגימה. התחל בהכנת תמיסת קוקטייל PACT על ידי הוספת אבקת VA-044 לתמיסה של 4% PFA ו-4% אקרילאמיד בריכוז סופי של 0.25% לאחר החדרת הרקמות בתמיסת PACT, טבלו לחלוטין את כל המוח וחוט השדרה בצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת PACT צוננת, ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.24 שעות לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת PACT טרייה וקרה, וחברו את מכסה הצינור למערכת הכלאת ג'ל רקמות, המחוברת למיכל חנקן ומכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל את הוואקום והגז למשך 10 דקות כדי להטמיע את הדגימה בגז חנקן. כדי לפלמר את ההידרוג'ל, הנח את הצינור המכיל את הדגימה באינקובטור רועד המוגדר ל-150 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות או עד להשלמת הפילמור.לאחר הדגירה, השתמש בנייר סופג כדי להסיר את שאריות ההידרוג'ל הפולימרי המקיף את הרקמות. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת ניקוי. הנח את הדגימה באינקובטור רועד המכוון ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד לניקוי הרקמה.בממוצע, לוקח לעכבר כ-20 יום להגיע לבהירות מלאה. התחל psPACT עם מערכת העצבים המרכזית מעכבר עם 4% PFA שתוקן לאחר מכן ב-4% PFA בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. שטפו את הרקמה הקבועה למשך שעה ב- PBS מולארי של 0.1.לאחר הכביסה מעבירים את הרקמה לתמיסת A4P0, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, לאחר שטיפת הטישו ב-PBS במשך חמש דקות, טבלו את הטישו ב-0.25%VA-044 ב-PBS, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש עד 24 שעות. הפרדת האקרילאמיד ושלב ה-VA-044 שלאחר מכן מונעת את הצורך בהסרת מונומרים הידרוג'ל לא פולימריים המקיפים את הרקמה, מה שעלול לפגוע בשלמות הרקמה הסופית לאחר השגת שקיפות עם PACT.לאחר הדגירה, העבירו את הרקמות לתמיסת VA-044 טרייה וקרה. לאחר מכן, הטמיעו את הדגימה בגז חנקן למשך 10 דקות. העבר את הרקמה לתמיסת ניקוי.לאחר מכן, דגרו את הדגימה באינקובטור רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד שהרקמה תתנקה. בממוצע, לוקח כ-17 ימים למערכת העצבים המרכזית של העכבר להשיג בהירות מלאה. עבור mPACT, עקוב אחר הפרוטוקול עבור psPACT עד לשלב פתרון הסליקה.לאחר מכן, טבלו במלואה את תמיסת ניקוי הרקמות המכילה 0.5% אלפא-תיוגליצרול, חומר לא משחים, בנוסף ל-8% SDS ב-0.1 PBS מולארי. הנח את הדגימה באינקובטור רועד המכוון ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד לניקוי הרקמה. בממוצע, לוקח לעכבר שבועיים בלבד להשיג בהירות מלאה באמצעות mPACT.במחקר הנוכחי, דגימות מוח של עכברים שטופלו באמצעות פרוטוקול mPACT השיגו שקיפות אופטית לאחר 14 יום, לפני דגימות שטופלו באמצעות פרוטוקולי PACT ו-psPACT. דגימות של מערכת העצבים המרכזית השלמות של חולדות שנוקו על ידי mPACT השיגו פינוי מקסימלי תוך 20 יום. מוחות של חולדות בוגרות בלבד, בניגוד לכל מערכת העצבים המרכזית, נוקו באמצעות mPACT תוך חמישה ימים בלבד.לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים עם מערכת העצבים המרכזית השלמה של העכבר אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח והאנטומיה לחקור מחלות פתופיזיולוגיות, כגון פגיעה ברקמות, מומים התפתחותיים, סרטן ומחלות ניווניות במודלים של מערכת העצבים המרכזית של יונקים.

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

טכניקות ניקוי אופטי מחוללות מהפכה באופן שבו רקמות נראות. בדוח זה אנו מתארים שינויים בפרוטוקול המקורי של Clear Lipid-Hybridized Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) שמניב תוצאות עקביות יותר ופחות יקרות.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

ACT-פרסטו (הקשורים בלחץ טכניקת בהירות פעיל העברה יעילה ויציבה של מקרומולקולות לאיברים) מאפשרת סליקת רקמות מהירה, יעילה, אבל לא יקרה וחדירת נוגדן מהירה לרקמות מסומנות על ידי דיפוזיה פסיבית או מסירה סייע בלחץ. באמצעות שיטה זו, מגוון רחב של רקמות יכול להיות מסומן, immunolabeled ידי נוגדנים מרובים, ו-צלם נפח.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.

הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

ספרואידים של גידולים הופכים להיות מנוצלים יותר ויותר כדי להעריך אינטראקציות בין תאים למיקרו-סביבה של הגידול ואת התגובה לטיפול. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חזקה אך פשוטה להדמיה בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול תלת-ממדיות באמצעות ניקוי אופטי מהיר.

ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

טכניקות ניקוי אופטי, כגון תמיסות ספיגת מולקולות, מפחיתות את פיזור האור באופן זמני כדי לשפר את ההדמיה הביולוגית ומציעות אסטרטגיות הדמיה in vivo תואמות ביולוגית והפיכות לאיברים משובצים עמוק. פרוטוקול זה מציג נהלי ניסוי מפורטים כמו גם עיבוד תמונה מתקדם להשגת הדמיה דינמית באיכות גבוהה לדינמיקה בזמן אמת בבעלי חיים חיים.

סליקה אופטית חולפת באמצעות מולקולות סופגות להדמיית ex vivo ו-in vivo

למדו שיטות psPACT ו-mPACT לניקוי מהיר של רקמת מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות. טכניקות אלו מאפשרות שקיפות אופטית מלאה תוך שבועיים ומסייעות בחקר מחלות נוירודגנרטיביות כמו אלצהיימר.

הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS

גלה סרטונים נוספים