הרומן פסיבית ניקוי שיטות לייצור מהיר של שקיפות אופטית כל רקמה CNS
8 במאי 2018
כאן, אנו מציגים שתי מתודולוגיות הרומן, psPACT, mPACT, להשגת שקיפות אופטית מקסימלי וניתוח מיקרוסקופיים עוקבות של רקמות להערכת למכרסמים שלם כל מערכת העצבים המרכזית.
המטרה הכוללת של שיטות psPACT ו-mPACT אלה היא ניקוי מהיר של רקמת מערכת העצבים המרכזית השלמה ללא צורך במערכת ניקוי רקמות אלקטרופורטית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מודל המחקר של מחלות אנושיות, כגון מחלת אלצהיימר או פציעה וניוון וגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שרקמת מערכת העצבים המרכזית של העכבר אינה נפגעת מניקוי הרקמה האלקטרופורטית, והיא מתנקה במהירות על ידי ניקוי פסיבי שונה.
הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה אחרי שהשתמשנו ב-PACT המקורי ובשיטה הקודמת לניקוי המוח. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להפעיל את שיטת psPACT ו-mPACT מכיוון שלשיטה זו יש מספר שלבים של הכנת דגימה. התחל בהכנת תמיסת קוקטייל PACT על ידי הוספת אבקת VA-044 לתמיסה של 4% PFA ו-4% אקרילאמיד בריכוז סופי של 0.25% לאחר החדרת הרקמות בתמיסת PACT, טבלו לחלוטין את כל המוח וחוט השדרה בצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת PACT צוננת, ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
24 שעות לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת PACT טרייה וקרה, וחברו את מכסה הצינור למערכת הכלאת ג'ל רקמות, המחוברת למיכל חנקן ומכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל את הוואקום והגז למשך 10 דקות כדי להטמיע את הדגימה בגז חנקן. כדי לפלמר את ההידרוג'ל, הנח את הצינור המכיל את הדגימה באינקובטור רועד המוגדר ל-150 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות או עד להשלמת הפילמור.
לאחר הדגירה, השתמש בנייר סופג כדי להסיר את שאריות ההידרוג'ל הפולימרי המקיף את הרקמות. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור של 50 מיליליטר המכיל תמיסת ניקוי. הנח את הדגימה באינקובטור רועד המכוון ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד לניקוי הרקמה.
בממוצע, לוקח לעכבר כ-20 יום להגיע לבהירות מלאה. התחל psPACT עם מערכת העצבים המרכזית מעכבר עם 4% PFA שתוקן לאחר מכן ב-4% PFA בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. שטפו את הרקמה הקבועה למשך שעה ב- PBS מולארי של 0.1
.לאחר הכביסה מעבירים את הרקמה לתמיסת A4P0, ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, לאחר שטיפת הטישו ב-PBS במשך חמש דקות, טבלו את הטישו ב-0.25%VA-044 ב-PBS, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך שש עד 24 שעות. הפרדת האקרילאמיד ושלב ה-VA-044 שלאחר מכן מונעת את הצורך בהסרת מונומרים הידרוג'ל לא פולימריים המקיפים את הרקמה, מה שעלול לפגוע בשלמות הרקמה הסופית לאחר השגת שקיפות עם PACT.
לאחר הדגירה, העבירו את הרקמות לתמיסת VA-044 טרייה וקרה. לאחר מכן, הטמיעו את הדגימה בגז חנקן למשך 10 דקות. העבר את הרקמה לתמיסת ניקוי.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה באינקובטור רועד המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד שהרקמה תתנקה. בממוצע, לוקח כ-17 ימים למערכת העצבים המרכזית של העכבר להשיג בהירות מלאה. עבור mPACT, עקוב אחר הפרוטוקול עבור psPACT עד לשלב פתרון הסליקה.
לאחר מכן, טבלו במלואה את תמיסת ניקוי הרקמות המכילה 0.5% אלפא-תיוגליצרול, חומר לא משחים, בנוסף ל-8% SDS ב-0.1 PBS מולארי. הנח את הדגימה באינקובטור רועד המכוון ל-37 מעלות צלזיוס ו-150 סל"ד עד לניקוי הרקמה. בממוצע, לוקח לעכבר שבועיים בלבד להשיג בהירות מלאה באמצעות mPACT.
במחקר הנוכחי, דגימות מוח של עכברים שטופלו באמצעות פרוטוקול mPACT השיגו שקיפות אופטית לאחר 14 יום, לפני דגימות שטופלו באמצעות פרוטוקולי PACT ו-psPACT. דגימות של מערכת העצבים המרכזית השלמות של חולדות שנוקו על ידי mPACT השיגו פינוי מקסימלי תוך 20 יום. מוחות של חולדות בוגרות בלבד, בניגוד לכל מערכת העצבים המרכזית, נוקו באמצעות mPACT תוך חמישה ימים בלבד.
לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים עם מערכת העצבים המרכזית השלמה של העכבר אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח והאנטומיה לחקור מחלות פתופיזיולוגיות, כגון פגיעה ברקמות, מומים התפתחותיים, סרטן ומחלות ניווניות במודלים של מערכת העצבים המרכזית של יונקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שתי מתודולוגיות חדשניות, psPACT ו-mPACT, לשיפור השקיפות האופטית והקלה על ניתוח מיקרוסקופי של כלי דם שלמים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של מכרסמים. טכניקות אלו שואפות לבצע הבהרה מהירה של רקמת CNS שלמה ללא פגיעה בה, תוך מענה לשאלות מפתח הקשורות למודלים של מחלות אנושיות כגון מחלת אלצהיימר ותהליכי תומוריגנזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טכניקות להשקיפות רקמות
- דימוי מיקרוסקופי
רקע
- המחקר מתבסס על שיטות קודמות ומדגיש את המגבלות של הבהרה אלקטרופורטית של רקמות.
- מדגיש את הצורך בתהליכי הבהרה מהירים ואפקטיביים עבור רקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) של מכרסמים.
- מציע פתרונות הן למחקר בסיסי והן להשלכות קליניות בתחום מדעי העצבים.
מטרת המחקר
- פיתוח ותיקוף של psPACT ו-mPACT כפרוטוקולים יעילים להשקפות של רקמות ממערכת העצבים המרכזית (CNS).
- הרחבת היכולות עבור חוקרים הלומדים מצבים נוירופתולוגיים.
- סיוע בהשגה של ויזואליזציה טובה יותר של כלי הדם ברקמות של ה-CNS.
שיטות שהשתמשו בהן
- השיטות כוללות פרוטוקול רב-שלבי להכנה ושינוי שקיפות של רקמת CNS באמצעות תמיסות PACT.
- המודלים הביולוגיים המרכזיים כוללים דגימות CNS מעכבר ועכבש, תוך התמקדות בהשגת שקיפות אופטית.
- תהליך psPACT אורך בדרך כלל כ-20 ימים עד להשגת שקיפות מלאה, בעוד ש-mPACT יכול להשיג זאת בערך ב-14 ימים.
- תמיסות ייעודיות וסביבות אינקובציה משמשות לתהליכי הפולימריזציה והשינוי של השקיפות.
תוצאות עיקריות
- mPACT מציעה הפחתה משמעותית בזמן הפינוי של הרקמה בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- דגימות שטופלו ב-mPACT הפגינו שקיפות אופטית בפרק זמן קצר יותר, מה שמעיד על יעילות מוגברת עבור יישומים מחקריים.
- הטכניקות מוכיחות את יעילותן בקידום חקרם של מצבים נוירולוגיים שונים.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר השקיפות (clearing) מהירה ויעילה של רקמות ממערכת העצבים המרכזית (CNS), ובכך משפר את יכולות המחקר בתחום מדעי המוח.
- המתודולוגיות החדשניות משמשות ככלים בעלי ערך לחקר מנגנוני מחלה ופגיעות ברקמות.
- להשלכות על הבנת מחלות ניוורו-דגנרטיביות ושיפור מחקרים פתולוגיים באמצעות טכניקות דימות משופרות יש משמעות ניכרת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
שיטות שקיפות פסיביות חדשניות כגון psPACT ו-mPACT פותרות צוואר בקבוק קריטי במחקר ופיתוח בתחום מדעי העצבים, על ידי מתן אפשרות לשקיפות אופטית מהירה ובנאמנות גבוהה של רקמת מערכת העצבים המרכזית (CNS) שלמה, ללא נזק אלקטרופורטי. יכולת זו תומכת בתיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים, על ידי שימור הארכיטקטורה התת-תאית תוך האצת לוחות הזמנים של הדימות. טכניקות אלו מגבירות את הביטחון החזוי במחקרים פרה-קליניים של מחלת אלצהיימר, תהליכי tumorigenesis ומודלים של פגיעות, באמצעות ויזואליזציה משופרת של פנוטיפים נוירופתולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) שלמה, על ידי שימור מבנים סוב-צלולריים ומעגלים תאיים למחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
- ערך תפעולי: מפחית ארטיפקטים של עיבוד רקמות הקשורים להבהרה אלקטרופורטית, ובכך משפר את השחזוריות של תוצאות סריקת פנוטיפים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח (portfolio triage) על ידי אספקת קריאות ברורות יותר של התקדמות ניוון עצבי במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תכשירים סטנדרטיים ושקופים של מערכת העצבים המרכזית (CNS), המתאימים לדימות ברזולוציה גבוהה של סממנים תת-תאיים ומודולציה של מסלולים.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בציוד אלקטרופורזה ייעודי, ובכך מוריד את החסמים ליישום הבדיקה בקרב צוותי מחקר ופיתוח.
- יכולת הרחבה: שיטת mPACT משיגה שקיפות של CNS של עכבר בתוך ~14 ימים, מה שמאפשר לוחות זמנים צפויים למסעות של סריקת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקלה על מעבר חלק משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על שלמות הרקמה למחקרים אורכיים של tumorigenesis ומומים התפתחותיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשרת ויזואליזציה של מבנים תת-תאיים ברקמות פתולוגיות, ובכך מפחיתה עמימות בפירוש המכניזם של המטרה.
- נאמנות מודל המחלה: תומכת בפינוי עקבי של ה-CNS בקרב מיני מכרסמים (עכבר/חולדה), ובכך משפרת את היכולת להשוואה בין מחקרים לצורך פרמקולוגיה של בטיחות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
psPACT ו-mPACT משתלבים ברצף שבין השלבים המוקדמים של הגילוי לשלב הפרה-קליני, ותומכים באופן ספציפי בתיקוף מטרה (target validation) עד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), על ידי אספקת מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הניתנים לכימות ומוכנים לדימות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות באמצעות מיפוי תלת-ממדי של ביטוי חלבונים והתפלגות תאים ברקמה שלמה, ובכך מבהירה את מעורבותם של מסלולים במודלים של מחלה.
- סריקה: מספקת תכשירי רקמה כמותיים וניתנים לשחזור התומכים בהערכה סטנדרטית של השפעות תרכובות על ארכיטקטורת ה-CNS.
- אנליטיקה: מייצרת פלטי דימוי ברזולוציה גבוהה המאפשרים לצוויות להשוות שינויים מבניים בין תנאי טיפול שונים עם יחס אות לרעש משופר.
- מחקר תרגומי: שומרת על המשכיות פרוטאומית ומבנית משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים במודלים של ניוון עצבי ופגיעות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת שקיפות CNS לשימוש חוזר, הישימה בפרויקטים מרובים החוקרים נוירופתולוגיה, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות ויזואליזציה של רקמה שלמה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות על ידי הימנעות מפרמטרים אלקטרופורטיים משתנים ומסמיכות לציוד.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות go/no-go על ידי האצת הפקת נתונים פרה-קליניים עבור מועמדים המכוונים ל-CNS.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות לניוון עצבי ואונקולוגיה באמצעות תוצאות פנוטיפיות מהירות וברורות יותר.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהיסטולוגיה של רקמות, כימיה של הידרוג'לים וביצוע פרוטוקולי אינקובציה לניהול הכנת דגימות רב-שלבית.
- תלויה באינקובטורים עם ניעור, מערכות גז חנקן וסביבות מבוקרות טמפרטורה עבור שלבי הפולימריזציה והשקיפות (clearing) של ההידרוג'ל.
- מחייבת סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת תמיסות (למשל, ריכוזי VA-044 ו-SDS) ובקרות תזמון כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין מעבדות.
- התאמה לרקמות שאינן ממערכת העצבים המרכזית (CNS) (למשל, כליה, טחול) דורשת תיקוף של זמני השקיפות ושל השמירה על המבנה, כפי שצוין בחומרי המקור.
- מגבלה מעשית: הצלחת הפרוטוקול תלויה בביצוע קפדני בשל שלבי ההכנה המרובים, כאשר סטיות עלולות להוביל לשקיפות חלקית או לנזק לרקמה.
