Name: ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: חקור ניתוח כמותי של מורכבות ארבוריזציה דנדריטית עצבית ב-Drosophila. שיטה זו מאפשרת לחקר השפעת גן SOX5 על התפתחות נוירונים ומנגנוני מחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ויליאם א אימר לסיוע טכני הדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי לקרן תרופה לאלצהיימר [R.E.T], המכון הלאומי לבריאות [R01AG014713, R01MH60009 אל R.E.T; R03AR063271, R15EB019704 ל א. ל.], ואת הקרן הלאומית למדע [NSF1455613 ל א. ל.].

1. הכנה ניסיוני
<ol><li>להכין את ריאגנטים הבאים: פוספט של Dulbecco buffered תמיסת מלח (PBS); טריטון X-100; 0.2 PBST % (PBS + 0.2% טריטון X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), מדולל 4% לפני השימוש; סיליקון elastomer בסיס והסוכן ריפוי; antifade הרכבה בינונית (למשל, להאריך זהב); לק....</li>
	<li>הכנת הציוד הבא: ניתוח מיקרוסקופ, שניים חדות מלקחיים וזוג מספריים עבור microdissection, מספר סיכות על microdissection, צלחת פטרי להכנת תבשיל לנתיחה, שקופיות מיקרוסקופ, coverslips, מיקרוסקופ קונפוקלי, ו- a מחשב עם מותקנת תוכנת ImageJ פיג'י.</li>
</ol>2. הזחלים אוסף
<ol><li>חבר UAS-Sox102F-RNAi זבובים עם UAS-GFP, ממ ק-GAL4 או W1118 פראי סוג זבובים, בהתאמה. תרבות זבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 º C.</li>
	<li>~ 5-6 ימים, לאסוף את הזחל לחלל השלישי של UAS-Sox102F-RNAi / ממ ק-GAL4, UAS-GFP או UAS-GFP, ממ ק-GAL4 / + שליטה בזהירות עם המלקחיים על ניתוח.</li>
</ol>3. ניתוח הזחלים
הערה: כל ההליכים בסעיף זה מופעלים תחת מיקרוסקופ microdissection. ההגדלה הוא החוקרים. לנסות להתאים את התצוגה ראייה אופטימלית. ~ 4-6 X הגדלה מומלצת.
<ol><li>במקום זחל על צלחת הקרע העשוי סיליקון elastomer הבסיס ותרבות רקמות פטרי.</li>
	<li>להצמיד את הקרס בפה זחל כדי לאפשר את הצד הגבי להתמודד ולאחר מכן להדביק את הזנב של זחל. מניחים בצד הגבי באמצע ככל האפשר לחשוף את האמצע, אשר יהיה דה מרקר פתוח-up.</li>
	<li>להוסיף 200 µL ל- PBS הזחל כדי לשמור על לחות הגוף.</li>
	<li>לעשות חתך עם זוג מספריים לאורך הקו האמצעי הגבי בין tracheas שני, מסימטרית כדי rostral. לעשות חתך קטן בכל ארבע הפינות של הגוף זחל.</li>
	<li>המקום pin בכל ארבע הפינות של הגוף אז הגוף שקרים שטוח.</li>
	<li>לתקן את הקיר הגוף זחל 4% PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לכבס במים PBST עבור 5 דק. חזור עוד פעמיים.</li>
	<li>הסר את הסיכות של הרקמה. ואז להעביר את הרקמה על זכוכית, לכסות עם הרכבה antifade בינוני, והר עם מכסה. האוויר יבש עבור 1 h, לאטום את הקצוות עם הלק.</li>
</ol>4. עיבוד הדמיה
הערה: התמונות צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה. המשתמש יכול לצלם את הדגימה באמצעות מטרה X 20 (מומלץ).
<ol><li>לכידת תמונות מסדרת Z. פתח את תיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" בתוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי. לקבוע את הטווח עבור לכידת תמונות סדרת Z.<ol>
<li>לחץ על לחצן "העליון ואת התחתון". לקבוע העליון והתחתון למקם ולהזין את הערכים "התחתון:" ו "העליון:" תיבות. הגדר את "צעד" בתיבת הדו-שיח "ללכוד את Z-סדרת" 0.5 מיקרומטר. לאחר מכן לחץ על לחצן "הפעל כעת" כדי לרכוש את Z-סדרת תמונות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמור את התמונות שהושג כקבצי *.tiff או *.nd2.</li>
	<li>אחסן את השקופיות בעל כהה ב 4 ° C לאחר דימות.</li>
</ol>5. דנדריט הערכה
הערה: חלבון ה-GFP היה co-overexpressed ב UAS-GFP, ממ ק-GAL4 טס על הנוירונים da עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. אורך, מסעף ומבנה של da נוירונים בהזחלים לחלל השלישית היו לכמת. ניתוח פרמטרי כוללים אורך של דנדריטים (מיקרומטר), פני השטח (2מיקרומטר), המספר הכולל של ענפים ומבנה מסעף (%). איור 1 מציג את הפרמטרים ניתוח בפירוט.
<ol><li>
אורכו של דנדריטים הערה: האורך של דנדריטים הוא הסכום של דנדריטים כל המסומנות בתוסף מעקב.<ol>
<li>ההתקנה ולהפעיל תוכנות20 פיג'י ImageJ (https://fiji.sc/). ואז לפצל תמונות ערוצים נפרדים, אם קיימות מספר ערוצים של תמונות. הערה: התמונה בפרוטוקול זה יש רק ערוץ אחד של GFP.</li>
		<li>הפעלת "תמונה | ערימות | פרויקט Z"כדי לקבל תחזית Z; יופיע חלון חדש עם השם 'Z-הקרנה.' לחץ על "עוצמת מקסימום" עבור סוג ההקרנה וארגון של מספרים בין ההתחלה פרוסה עצירה פרוסה בהתאם על העדפות אישיות. לחץ על "אישור." תמונת Z-ההקרנה יופיעו הצגת התחזית דנדריט בבירור.</li>
		<li>לאתר את neurites.<ol>
<li>בחר "תוספים | פילוח | פשוט Neurites מעקב"בחלון לאתר של דנדריטים. למצוא את סומא נוירון ולאחר מכן לחץ על נקודה אחת-דנדריט החל לגוף התא, נקודה נוספת בקצה של זה דנדריט. הערה: התוכנית יחברו שתי הנקודות בקו כחול.</li>
			<li>הקש "Y" בחלון יישום plug-in אם הנתיב אינו ברור; הנתיב דנדריט נמצא במעקב עד הקצה של הנתיב שנבחר של תמונות גלויות. לחץ "הנתיב המלא" על תוסף באותו החלון; הקטע הושלמה (איור 2). הערה: מספר דנדריטים הסתיים רחוק יותר נקודות המוצא, בהם מסלול הייתה מחולקת למקטעים קטנים יותר. המקטעים חברו יחד כדי לספק נתיב מלא עבור רכיב המעקב.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לאחר השלמת נתיב, לחזור לנקודת חדשה איפה הענפים. הנתיב החדש יכול להיות בנוי על; התיבה חלון "כל הדרכים" תציג את הערכים אורך כל הנתיבים (איור 3). שמור את קובץ מעקב והמשך עם עקבות לא גמורים כמוצג באיור2.</li>
		<li>ייצוא נתוני האורך דנדריט על ידי לחיצה, "קובץ | ייצוא כמו *.cvs"בחלון 'תוסף'. ואז לסכם את כל אורך נתיב, לייצא את הנתונים לניתוח נתונים/בתכנת. (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
שטח הפנים של הנוירונים da
	<ol>
<li>בחרו בכלי ציור ביד חופשית בחלון 'פיג'י ImageJ'. הנתיב, ולאחר מכן חבר את נקודות הקצה. מתפריט ' 'נתח' ', בחר ' הגדר מדידות | באזור." לחץ על "מדד" מתוך תפריט 'נתח'. התוצאה מופיעה תיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר (איור 4). העתק זה תוכנת ניתוח נתונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
סה כ מספר של ענפים והמבנה הסתעפות של הנוירונים da
	<ol>
<li>לחשב את המספר הכולל של ענפים על-ידי פתיחת "ניתוח" ולאחר מכן "רינדור | לנתח נתיבי Skeletonized"בחלון תוסף של איתור (איור 5). הערה: מבנה סוכת הוא הסכום של הרמות של ענפים. הנתיב הוגדרו בין גוף התא העצות דנדריט, נתיב אחד יכול לכלול מספר ענפים, כגון ובשבילים העיקרי הן דנדריטים של הגוף התא של נוירון. ובשבילים משניים הם ענפים מן הראשית וכן הלאה עם ובשבילים רבעוני, quinary השלישון. המבנה של הסתעפות דנדריט מופרדים זה מזה בהתאם הרמות של סניפים. למשל, האחוזים העיקרי הוא מספר הסניפים מחולקת על ידי המספר הכולל של הסתעפות, וכן הלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li>
<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
<li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons%3A+dendritic+structure+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li>
<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
<li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+through+Dishevelled%2C+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li>
<li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li>
<li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase%2FFurry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li>
<li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li>
<li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
<li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+reversal+of+Alzheimer%27s+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li>
<li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Neurite+Tracer%3A+open+source+software+for+reconstruction%2C+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li>
<li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuriteTracer%3A+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דנדריטים זה innervate האפידרמיס הם אזורי קלט של נוירונים, מורפולוגיות שלהם לקבוע כיצד המידע התקבל, מעובד על ידי נוירונים בודדים. פיתוח דנדריט מורפולוגיה משקף ג'ין אפנון של הארגון דנדריט. הנוירון da זחל דרוזופילה של מערכת העצבים ההיקפית הוא מודל חשוב ללמוד פיתוח דנדריט בגלל: 1) הדמיון פונקציונלי עם יונקים11,12; 2) ארבע הבחנות השיעור מבוסס על מבנה דנדריט11,12; ו- 3) גורמים גנטיים המווסתים מורפוגנזה...

דנדריטים, אשר ההשתקפויות מסועף של נוירון, לכסות את השדה שמקיף חישה וסינפטית תשומות של הנוירון אחרים1,של הנוירונים2. דנדריטים הם מרכיב חשוב של היווצרות סינפסה ולשחק תפקיד קריטי שילוב תשומות סינפטית, וכן הפצת הגירוי אלקטרוכימי של נוירון. Arborization דנדריטים (da) הוא תהליך שבו נוירונים בצורת הדנדריטים חדשות וסניפים ליצירת הסינפסות חדש. פיתוח, המורפולוגיה של דא, כגון צפיפות סניף ודפוסי הקיבוץ, הם תוצאה של תהליכים ביולוגיים רב שלבי, נמצאים בקורלציה גבוהה תפקוד. המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה לניתוח כמותי של המורכבות arborization dendritric עצביים דרוזופילה.
המורכבות של דנדריטים קובעת את סוגי סינפטית, קישוריות, תשומות מן השותף נוירונים. מסעף דפוסים, הצפיפות של דנדריטים מעורבים עיבוד האותות מתכנסת אל שדות דנדריטים3,4. דנדריטים מקבל את הגמישות עבור התאמה בהתפתחות. למשל, איתות סינפטית יש השפעה על הארגון דנדריט נוירון המגע במהלך שלב התפתחותי, את מערכת העצבים בוגרת5. הקמת קישוריות עצביים מסתמך על מורפוגנזה ועל התבגרותם של דנדריטים. מום של דנדריטים מזוהה עם תפקוד לקוי. מחקרים הראו כי חריגות של da נוירון מורפוגנזה עשוי לתרום אטיולוגיה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), ומחלת לו גריג / נוירודגנרטיביות (ALS)6,7,8. שינויים סינפטיים מופיעים בשלב המוקדם של AD, בתאום עם הירידה ואת ירידת ערך של נוירון פונקציה7,8. עם זאת, הפרטים של איך דנדריט פתולוגיה תורמת פתוגנזה מחלות ניווניות אלה נשאר חמקמק.
הפיתוח של דנדריטים מוסדר על ידי גנים אשר קידוד רשת מורכבת של הרגולטורים, כגון משפחת ונ ט של חלבונים9,10, גורמי שעתוק ליגנדים התא קולטנים משטח11,12 . דרוזופילה da נוירונים מורכב ארבע כיתות (מחלקה אני, II, III, IV), של איזה מחלקה IV דה נוירונים יש מסעף הדפוסים המורכבים ביותר, יש כבר מועסקים כמערכת ניסיוני רב עוצמה עבור יותר הבנה מורפוגנזה13, 14. במהלך תחילת מורפוגנזה, ביטוי ו/או RNAi להחרשת גנים class IV דה נוירונים לגרום לשינוי דפוסי מסעף ודנדריט גיזום13. חשוב לפתח שיטה מעשית לניתוח כמותי של arborization הדנדריטים עצביים.
אנחנו הראו בעבר כי להחרשת דרוזופילה ortholog של SOX5, Sox102F, הוביל דנדריטים קצר יותר של נוירונים da, מורכבות מופחתת בשיעור הרביעי da נוירונים15. כאן, אנו מציגים את ההליך של ניתוח כמותי על המורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה. פרוטוקול זה, משנת המתודולוגיה המתוארת הקודם, מספק שיטה קצרה assay הפיתוח של נוירונים חושי דה. זה מדגים תיוג תמונות של נוירון da השלישי לחלל זחל לגוף החומה16,17,18,19. זה פרוטוקול יקר עבור חוקרים המעוניינים לחקור את NDAC ואת הבדלים התפתחותיים ויוו.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516; 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>לק לציפורניים&nbsp;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>סיכות חרקים&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ והחלקות כיסוי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי של arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

דנדריטים הן ההשתקפויות מסועף של נוירון, מורפולוגיה דנדריטים משקף סינפטית הארגון במהלך הפיתוח של מערכת העצבים. דרוזופילה זחל עצביים דנדריטים arborization (da) הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה של דנדריטים העצבית ותפקוד גנים בהתפתחות מערכת העצבים. ישנם ארבעה סוגי נוירונים da. השיעור הרביעי הוא שהמורכב ביותר עם דפוס מסעף המכסה כמעט את כל שטח הקיר גוף הזחל. אנחנו קודם לכן שאפיינו את השפעת להשתיק את דרוזופילה ortholog של SOX5 על השיעור הרביעי arborization דנדריטים עצביים המורכבות (NDAC) באמצעות ארבעת הפרמטרים: האורך של דנדריטים, את פני השטח של כיסוי דנדריט, המספר הכולל של ענפים, ואת המבנה מסעף. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה של ניתוח כמותי NDAC, המורכב לנתיחה זחל, מיקרוסקופיה קונפוקלית ושגרות התמונה ניתוח באמצעות תוכנת ImageJ. תובנות חדשות ההתפתחות העצבית da ומנגנונים הבסיסית שלה לשפר את ההבנה של תפקוד ולספק רמזים אודות הסיבות הבסיסיות של נוירולוגיות והפרעות התפתחותיות.

דנדריטים של נוירונים da הודבקו תוויות על-ידי GFP co-overexpressing (UAS-GFP; ממ ק-GAL4) סומא עצבית da ו דנדריטים ובשבילים עבור זריחה GFP הדמיה ניתוח. המורפולוגיה של דנדריטים נוירון da צולמה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי הפוכה (איור 2).
דנדריטים של נוירונים da שנקשרו באמצעות תוכנת ImageJ פיג'י. הקובץ שימש כדי להעריך את אורך דנדריט (איור 3). להחרשת Sox102F בנוירונים ...

פרוטוקול זה מתמקד ניתוח כמותי של מורכבות עצביים arborization דנדריטים (NDAC) דרוזופילה, אשר יכול לשמש עבור מחקרים של מורפוגנזה דנדריטים.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההשפעה של הגן SOX5 על המורכבות של נוירונים arborization דנדריטי במהלך ההתפתחות העצבית ב Drosophila. שיטה זו יכולה לעזור ללמוד מורפוגנזה של נוירו-דנדריטים, ואת תפקוד הגנים בהתפתחות מערכת העצבים, כדי להבין טוב יותר גנים של מחלות נוירודגנרטיביות. בסופו של דבר טכניקה זו מספקת ניתוח כמותי של מורכבות דנדריטים, אשר ניתן להשתמש בהם בסוגים רבים ושונים של נוירו-דנדריטים.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לכיוון מנגנון גנטי של מחלה נוירו-ניוונית, משום שהמוטציה מחזיקה במפתח להבנת תפקוד הגנים. צלבים מוגדרים של UAS-GFP;ppk-GAL4 עם זבובי זן UAS-Sox102F-RNAi או פקדי W118. תרבות הזבובים בתנאים סטנדרטיים ב 25 מעלות צלזיוס.בעוד חמישה עד שישה ימים, השתמש במטסים כדי לאסוף בזהירות את הזחלים השלישיים של instar לצורך ניתוח. מניחים זחל בצלחת ניתוח עשוי בסיס אלסטומר סיליקון, וצלחת פטרי רקמות תרבות. לאחר מכן מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח.עכשיו תצמיד את זנב הזחל כדי לחשוף את קו האמצע. ואז להצמיד את הזחלים הפה ווים כך הצד הגבי של הזחל הוא למעלה. עכשיו להוסיף 200 microliters של PBS לצלחת כדי לטבול את הזחל בתסרון.לאחר מכן, חותכים את הזנב והפה של הזחל עם חתכים קטנים. ואז לחתוך את הזחל פתוח לאורך קו האמצע הגבי ובין שתי קנה, הולך מן caudal כדי rostral. ואז למקם סיכה בכל אחת מארבע הפינות של הגוף כך הגוף שוכב שטוח.עכשיו לתקן את קיר גוף הזחל בארבעה אחוזים PFA במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את הזחל עם PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה, להסיר את הפינים ולהעביר את הרקמה על מגלשת זכוכית.ואז לטבול את הרקמה במדיום הרכבה antifade, ולהוות אותו עם להחליק כיסוי. אפשר לרקמה המותקנת להתייבש במשך שעה לפני האיטום על החלקת המכסה עם לק ציפורניים. אחסן את השקופיות האלה בחושך בארבע מעלות צלזיוס.לכוד תמונות מסדרת z באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל באמצעות מטרה של פי 20. ראשית, להגדיר את הטווח של z-צעדים לכלול את כל הנוירונים DA בקיר גוף הזחל, ולהגדיר את גודל הצעד לחצי מיקרומטר. לאחר מכן אחסן את התמונות כקבצי TIF או ND2 לעיבוד.לאחר מכן, להעריך את המספר והמורפולוגיה של הדנדריטים על הנוירונים DA. התחל בהערכת אורכיהם. ראשית, בפיג'י ImageJ, לפצל את התמונות לערוצים נפרדים במידת הצורך.יש להעריך רק את ערוץ GFP. לאחר מכן, לעשות z-הקרנה. בחלון החדש, בחרו בעוצמה מרבית לסוג ההקרנה ובחרו בפרוסות ההתחלה והעצור.לאחר מכן לחצו על הלחצן 'אשר' להפקת תמונת z-projection עם הקרנות דנדריט ברורות. עכשיו תאתר את הניריטים באמצעות כלי התוסף. ראשית, ללכת לסומה של הנוירון של עניין ולחץ שבו דנדריט אחד יוצא מגוף התא.לאחר מכן לחץ בקצה של דנדריט זה. אם הקו הכחול המחבר בין שתי הנקודות פועל לאורך הנויריט, הקש Y עבור כן. לאחר מכן, אם קו זה מתאים לנתיב המלא של הנויריט, לחץ על נתיב שלם.אם הקו אינו מתאים לנתיב, לחץ על נקודות בהמשך נויריט זה כדי לכופף את הנתיב למקטעי קו מרובים שיתאימו לאורך הנויריט. לאחר מכן, לחץ על נתיב שלם והמשך בסימון הנתיב עבור הנויריט הבא. לאחר השלמת כל נתיבי העקיבה, בחרו באפשרות 'ניתוח', 'מדוד נתיבים' לייצוא הנתיבים לקובץ CSV.השתמש בנתונים אלה כדי לחשב ערך ממוצע של אורכי נתיב לניתוח. לאחר מכן, לחשב את שטח הפנים של הנוירון. ראשית, בחר את כלי ציור היד החופשית מחלון פיג'י ImageJ.לאחר מכן, לחבר את נקודות הקצה של הנוירון של עניין. לאחר מכן, בחרו באפשרות 'מדידה' מהחלון 'נתח'. התוצאה מופיעה בתיבה חדשה עם הערך עבור האזור שנבחר.העתק ערך זה לתוכנה לניתוח נתונים. לבסוף, לחשב את המספר הכולל של ענפים באמצעות תוסף ניתוח נתיבים שלדים. הדנדריטים של נוירונים DA תויגו על ידי שיתוף overexpressing GFP שלהם סומא דנדריט ארבורים לניתוח הדמיה פלורסנס GFP.המורפולוגיה של דנדריטים תצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך. הדנדריטים של תאי העצב של התובע המחוזי אותרו כמתואר. הקובץ שימש להערכת אורך הנדריט.השתק של Sox102F בנוירונים DA בזחל instar השלישי הוביל לירידה משמעותית במספר הכולל של דנדריטים עם כמחצית אורך הענף עם מבנה פשוט יותר, מראה רק מחצית ממספר הענפים. מבחינה הגיונית, זה הוביל לירידה בשטח הפנים של הארבור. פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה להערכת התפתחות של נוירונים חושיים DA.בעת ניסיון הליך זה, הקפד לקחת מספר רב של תמונות של כל קבוצה של נוירונים DA כדי לקבל כיסוי טוב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח דנדריט על מנת לענות על שאלות נוספות על התפתחות דנדריט. מאז התפתחותה, טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום מדעי המוח להסיק מסקנות למחלות ניווניות כגון אלצהיימר באמצעות מערכות מודל.

quantitative-analysis-neuronal-dendritic-arborization-complexity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית...

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

מקור: Ting, C., et al., ניתוח מורפולוגיה דנדריטית בעמודות ושכבות. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההליך של הכנת מוח דרוזופילה, לכידת ערימות תמונות אופקיות וקדמיות של דנדריטים מדולה עם תווית GFP תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, ויצירת שחזור תלת מימדי לניתוח המורפולוגיה שלהם על פני שכבות ועמודות.

ניתוח מורפולוגיה דנדריטית על פני שכבות ועמודים של מדולה דרוזופילה

אנו מתארים שתי שיטות להדמיה וכימות של ארבוריזציה דנדריטית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברים: הדמיה בזמן אמת ועומק שדה מורחב. בעוד שהשיטה הראשונה מאפשרת מעקב טופוגרפי מתוחכם וכימות של היקף ההסתעפות, השנייה מאפשרת הדמיה מהירה של העץ הדנדריטי.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

כאן אנו מראים כיצד לכמת את מספר הפריסה המרחבית של אזורי הפעילות הסינפטית קולטני האור תסיסנית, הדגיש עם סמן מולקולרי מקודדים גנטית, אפנון שלהם לאחר חשיפה ממושכת לאור.

ניתוח Synaptic אפנון של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, "Morphometrics תסיסנית NMJ" ו "דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics" נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

כאן, אנו מראים כיצד לנתח ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות. זרימת העבודה כוללת טכניקת דימות כפול במטרה לשפר את איכות התמונה ואת בכלים חישוביים לאיתור, רישום סוכות דנדריטים למערך טור התייחסות לניתוח מבנים הדנדריטים בחלל 3D.

ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות

כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

חקור ניתוח כמותי של מורכבות ארבוריזציה דנדריטית עצבית ב-Drosophila. שיטה זו מאפשרת לחקר השפעת גן SOX5 על התפתחות נוירונים ומנגנוני מחלות נוירודגנרטיביות.

ניתוח כמותי של Arborization דנדריטים עצביים מורכבות בדרוזופילה

גלה סרטונים נוספים