עיבוד של הכלאה צלמו של חלבונים הקשורים כרומטין פרוטאומיקס בתרבית של תאים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהבנתנו את ויסות הגנום, כגון כיצד וריאנטים של רצף הקשורים למחלה באזורים לא מקודדים משפיעים על ביטוי ובקרה של גנים על ידי שינוי קשירת חלבונים, והיא יכולה לסייע בזיהוי חלבונים אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה דורשת שום סוג של מניפולציה גנטית של תאים או רקמות, או נוגדנים, ושום ידע מוקדם על חלבונים קושרי DNA שעשויים לקיים אינטראקציה עם DNA באותו מקום. מי שידגים את ההליך הזה יהיה דאנו פרומלה, טכנאי מהמעבדה שלי.

לאחר תכנון אוליגונוקלאוטידים על פי פרוטוקול הטקסט, צלחת 2 עד 5 פעמים 10 לתאי הלימפובלסטואיד החמישי, או קווי תאים אחרים, בבקבוק T25 עם 6 מיליליטר של מדיום RPMI 1640, בתוספת 1% Pen Strep, 2 מיל או יותר L-גלוטמין ו-5% FBS. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו-5% פחמן דו חמצני. השתמש בהמוציטומטר, או במונה תאים אוטומטי, כדי למדוד את צפיפות התאים.

לפני שהתאים מגיעים ל-1 כפול 10 ל-6 תאים למיליליטר, סובב אותם ב-100 פעמים G למשך חמש דקות, והעביר אותם לבקבוק T75 עם 25 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שהוכן מוקדם יותר בסרטון זה. לגדל את התאים עד שמגיעים לצפיפות תאים של 1 כפול 10 ל-6 תאים למיליליטר, ואז להעביר את התאים לבקבוק T150 ב-38 מיליליטר של אותו מדיום, ולגדל אותם במשך יומיים נוספים. לאחר מכן, סובב את התאים ב -100 פעמים G למשך חמש דקות, והשהה אותם מחדש ב -10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640.

לאחר מכן שפכו את המתלה לבקבוק רולר בגודל 1850 סנטימטר מרובע המכיל 500 מיליליטר מדיום, ודגרו את התאים באותם תנאים כמו קודם, למעט בסיבוב מתמיד. לאחר שמגיעים לספירת התאים הרצויה, סובבו את התרבית ב-100 פעמים G למשך חמש דקות, והשעו מחדש את התאים ב-36 מיליליטר של מדיום RPMI 1640. לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והסירו מחסומים קטנים לספירת תאים וחילוץ DNA.

כדי לקשר בין התאים, הוסף 1 מיליליטר של 37% פורמלדהיד כדי להגיע לריכוז סופי של 1%ואז דגר על התאים ב-10 עד 30 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. להרוות את תגובת הקישור הצולבת על ידי הוספת 2 מיליליטר של תמיסת גליצין 2.5 מולרית לריכוז סופי של 125 מילימולר. לאחר מכן דגרו את התאים בסיבוב למשך חמש דקות.

לאחר כדור התאים על ידי צנטריפוגה, השתמש ב-1X PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים. המשך עם ליזה ושקיפה של התאים, או השהה מחדש את הגלולה ב-5 מיליליטר של מאגר ליזה של תאים, והקפיא את התרחיף טיפה אחר טיפה בחנקן נוזלי. לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע ליזה ושיפוע, השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של מאגר ליזיס תאים. הצנטריפוגה של התאים ב -400 פעמים G, ב -4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים ב-6 מיליליטר של מאגר גרעינים עם מעכבי פרוטאז.

לקראת סוניקציה, חלקו את הדגימה באופן שווה לשישה עד שמונה צינורות מיקרופוגה. הנח את הדגימות על קרח או על מתלה קר, והשתמש בסוניקטור עם מיקרו-טיפ כדי לסוניקטור אותן במשרעת של 65% עם חמישה התפרצויות קבועות של 20 שניות, מה שמאפשר למתלה להתקרר לפחות 40 שניות בין פולסים. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 12,000 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש, והשליכו את הכדורים.

לאחר הערכת ההתאוששות הכוללת באמצעות פלואורומטריה, הקפיאו את הדגימות. לאחר הכנת מאגרי הכלאה ושטיפה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-1,200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה פי 1 כדי לשטוף 600 מיקרוליטר חרוזים שלוש פעמים. לאחר מכן השתמש ב-1,200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה פי 2 כדי להשעות מחדש את החרוזים.

בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הוסף 600 מיקרוליטר של דגימה, 120 מיקרוליטר של חרוזים שטופים תלויים במאגר הכלאה פי 2, ו-480 מיקרוליטר של מאגר הכלאה פי 2. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 31 מעלות צלזיוס, ו-30 עד 60 סל"ד למשך 10 דקות. לאחר מכן הניחו את הצינורות על מגנט, עד שהחרוזים משתתקים, והעבירו את הדגימות לצינורות חדשים לפני השלכת החרוזים.

השעו מחדש את האוליגונוקלאוטידים של הלכידה לתמיסת עבודה של 10 פיקומולים למיקרוליטר, והוסיפו 4 מיקרוליטר מתמיסה זו לכל צינור. דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס ב-30 עד 60 סל"ד למשך 40 דקות. במהלך הדגירה, הניחו בצד את החרוזים הדרושים, שטפו את החרוזים שלוש פעמים כמו קודם, אך הפעם השתמשו במאגר הכלאה פי 1 כדי להשעות אותם מחדש.

מוסיפים את החרוזים השטופים לצינורות, ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 30 עד 60 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הנח את הצינורות על המגנט, והסר את הסופרנטנט לאחר שהחרוזים משותקים. לאחר שטיפת החרוזים, יש להוציא את הדגימה על ידי הוספת 40 מיקרוליטר מים בדרגה מולקולרית, ולדגור את הצינורות בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הניחו את הצינורות על המגנט, והמתינו כמה דקות עד שהתמיסה תתבהר, ואז העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה, והשליכו את החרוזים. אחסן את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס, או המשך לניתוח הפרוטאומי על פי פרוטוקול הטקסט. כדי להעריך את תפוקת הלכידה, השתמש במים בדרגה מולקולרית כדי לדלל אליקוט של האלואט, אחד עד עשר.

לאחר חילוץ ה-DNA מאליקוט שצולם מוקדם יותר בסרטון, השתמש בדגימת ה-DNA ובמים בדרגה מולקולרית כדי להכין עקומה סטנדרטית, עם חמישה דילולים סדרתיים של אחד עד עשר. הכן תערובת מאסטר qPCR המוסיפה פריימרים ובדיקות, והוציאו את הכמות המתאימה בכל באר של התגובה. לכל באר, הוסף 5 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת, העקומה הסטנדרטית או מים בדרגה מולקולרית כדי לשמש ללא בקרת תבנית.

אוטמים את הצלחת וסובבו אותה ב 100 פעמים G למשך דקה. לאחר מכן הפעל את הדגימות במערכת qPCR באמצעות הפרמטרים שנמצאים בפרוטוקול הטקסט. לבסוף, השתמש בעקומה הסטנדרטית כדי להעריך את התשואות, ובלכידה מקושקשת כדי להעריך את ספציפיות הלכידה.

מוצגים כאן לכידות הכלאה באמצעות טיטרציה של אוליגונוקלאוטידים. מספר האוליגונוקלאוטידים גדל בהדרגה, בעוד שהריכוז הכולל נשמר קבוע. ניסוי זה עוזר לקבוע כמה אוליגונוקלאוטידים שונים נדרשים כדי להגיע ליעילות הכלאה אופטימלית.

זה גם חושף כל אינטראקציות הכלאה מזיקות ברורות בין קבוצה מסוימת של אוליגונוקלאוטידים, ואם יש אוליגואים עם ספציפיות ירודה, וכתוצאה מכך רקע גבוה. חלק גדול מהשברים בכרומטין המקושר לא יהיו ניתנים ללכידת הכלאה. אם לכידת ההכלאה תתבצע בהצלחה, ניסוי לכידה עוקב של אותו חומר כרומטין, תוך שימוש בקבוצה שונה של אוליגונוקלאוטידים לכידה, יביא לתשואות דומות כמו בעת שימוש בכרומטין טרי.

עם זאת, בניסוי לכידה שני תוך שימוש באוליגו המקורי ושאריות כרומטין מהניסוי הראשון, התשואה תפחת בכ-90% אם רוב החומר הניתן להכלאה היה נלכד בניסוי הראשון. איור זה מציג את לכידת ההכלאה של אזורי יעד כרומוזומליים שונים, כאשר כל אזור משמש כבקרה שלילית עבור האחר. רצף מקושקש משמש גם כשליטה שלילית אמיתית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק תחילה את האוליגונוקלאוטידים של הלכידה, כדי להבטיח שהאזור הרצוי ניתן ללכידת הכלאה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו כרומטין אימונו-משקעים, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו היכן עוד בגנום נקשרים חלבוני האינטראקציה של ה-DNA שזוהו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע HyCCAPP על מנת להעשיר אזורי עניין גנומיים במטרה לזהות דה נובו של אינטראקציות חלבון מקומיות.