קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעכל מולקולות DNA עם תווית פלואורסצנטית עם אנזימי הגבלה רגישים למתילציה ולא מתילציה ולקבוע את קצב העיכול של הניסוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הכימיה או הביולוגיה, כגון גנומיקה. היתרון בשיטה זו הוא שמדען יכול לעכל דנ"א מוכתם מראש עם אנזים כדי לקבוע אם הדנ"א הוא באורך מלא לאחר השלמת ניסוי אחר.

מי שידגים את ההליך יהיה דרו תומפסון, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלי. להכנת ג'ל אגרוז 0.7%, שקלו 1.4 גרם של אגרוז בטמפרטורת ג'ל גבוהה בבקבוק ארלנמאייר. לאחר מכן מוסיפים 200 מיליליטר של מאגר TAE 1x ומניחים הפוכה על גבי הבקבוק.

מחממים את התמיסה על פלטה חמה עד שמתחילות להיווצר בועות בתחתית הבקבוק וצפים למעלה. מוציאים את התמיסה מהפלטה החמה ונותנים לה להתקרר עד שניתן לגעת בבקבוק ביד חשופה. לאחר מכן שופכים את הג'ל לתבנית ג'ל בגודל 24.5 ס"מ על 21.8 ס"מ עם מסרק ג'ל ליצירת בארות.

השתמש בקצה פיפטה כדי לפוצץ את הבועות ליד המסרק או על פני הג'ל ואפשר לג'ל להתמצק למשך 15 דקות לפחות. כדי לצבוע DNA למבדה בשישה ריכוזים שונים של צבעים, התחל בשימוש ב-1x TE להכנת 300 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיקרוליטר של DNA למבדה. אחסן את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס.

בעת הכנת דגימה לכל אחד מריכוזי הצבע הבאים עבור כל פס הצפוי בעיכול הגבלה, יש לצבוע 75 עד 100 ננוגרם של DNA למבדה ללא מתילציה דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, כדי לקבוע אם אנזים הגבלה יכול לעכל את ה-DNA המוכתם, הוסיפו 20 יחידות של אנזים הגבלה, שלושה מיקרוליטרים של המאגר המתאים עם יעילות החיתוך הגבוהה ביותר, ומים מזוקקים ומסוננים לתגובה של 30 מיקרוליטר.

הניחו את התגובות באמבט מים בפעילות האנזימטית האופטימלית ודגרו אותן למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן עצרו את התגובות על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.5 מולרי EDTA pH 8.0. הסר את הדפנות מתבנית הג'ל שהוכנה בעבר והניח את הג'ל בקופסת האלקטרופורזה של הג'ל.

יוצקים 2.5 ליטר של מאגר TAE 1x לקופסה. לאחר מכן הסר בזהירות את מסרק הג'ל מהג'ל כך שהבארות יהיו נגישות. צנחו את תגובות אנזים ההגבלה על סרט פלסטיק, ולכל תמיסת תגובה, הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע טעינה פי 6 לכל חמישה עד שישה מיקרוליטרים של תמיסת DNA.

ואז פיפטה את התגובות לבארות. מערבבים מיקרוליטר אחד של סולם קילו-בסיס אחד, תשעה מיקרוליטר של 1x TE ושני מיקרוליטר של צבע טעינה פי 6. לאחר מכן טען את התמיסה לבארות שמאגפות את הפתרונות האחרים.

מכסים את קופסת הג'ל בנייר או בד כחול כהה או שחור, ואז מחברים את קופסת הג'ל לאספקת חשמל. הגדר את ספק הכוח ל-30 וולט והפעל אותו למשך הלילה. כבה את האורות בזמן שהג'ל פועל כדי למנוע פוטו-מחשוף של ה-DNA המסומן.

למחרת בבוקר, העבירו את הג'ל במגש למיכל עם 45 מיקרוליטר אתידיום ברומיד וליטר אחד של מאגר TAE 1x. אחסן את המיכל בטמפרטורת החדר בחושך או כסה אותו בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. תן לג'ל להישאר לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לצלם את הג'ל, הנח את הג'ל על גבי טרנסמאלייטור אור כחול, הפולט תפוקת אור מקסימלית בין 400 ל-500 ננומטר. צלם תמונות עם מצלמה המחוברת לתחנה. קבע את קצב העיכול של הניסוי על פי פרוטוקול הטקסט.

יעילות האנזים נקבעת על ידי חלוקת המספר הכולל של הרצועות הצפויות במספר הרצועות הנראות לעין. בנוסף, על מנת לקבוע את הגודל המשוער של הרצועות, נדרשת בקרה כדי לדעת היכן צפויות מולקולות ה-DNA המקוריות בהשוואה ל-DNA המוכתם. הניידות של הרצועות בנתיבים 3 ו-4 פחתה, מה שגרם ללהקות להתקרב לבארות.

בנתיבים אלה, כמות הצבע אינה משפיעה באופן ניכר על הניידות, ולכן הרצועות תואמות את השליטה. נתיבים 5 ו-6 מראים יותר רצועות מאשר הביקורת, מה שמעיד על עיכול חלקי, מה שמרמז על הצבעים שהשפיעו על המחשוף באתרי זיהוי. בניסוי הזה, כל הרצועות הצפויות נראות עבור כל ריכוזי הצבע, כך שהקוביות לא הפריעו לעיכול הדנ"א.

כדי לראות כיצד הניידות השתנתה ככל שריכוז הצבע YOYO-1 גדל, הוכנסו כוכביות צבעוניות ליד כל רצועה. לדוגמה, לרצועות של 3.5 קילו-בסיס יש כוכביות אדומות לידן בכל ריכוז YOYO-1. ללהקות הבלתי צפויות בנתיבים 5 ו-6 אין כוכבית ליד הרצועות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכסות את הג'ל בפיסת נייר כהה ולהשלים את הפעלת הג'ל בחדר חשוך. כמו כן, הקפד להשתמש בצינורות כהים לתגובות שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעכל מולקולות DNA מוכתמות פלואורסצנטיות עם אנזימי הגבלה ולקבוע את קצב העיכול של התגובה.

אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי בטיחות בעת ביצוע ההליך. כמו כן, הקפד להרכיב משקפי בטיחות מתאימים בעת שימוש בטרנס-מאיר.