Name: קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: למדו כיצד לעכל DNA סומן בפלואורסצנטיות באמצעות אנזימי הגבלה רגישים למתילציה. שיטה זו מאפשרת הערכת שלמות ה-DNA לאחר ניסויים ביוכימיים וגנומיים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי עבור כללי רפואי מדעי (NIGMS) (5605100122001), מרכיב של נבחרת מכונים לבריאות (NIH), כמו גם אוניברסיטת נברסקה קירני (UNK) קיץ תלמיד מחקר התוכנית (SSRP), ו UNK מלגת מחקר לתואר ראשון (URF).

1. הכנת צבעי, Buffers ו- Agarose ג'ל
<ol><li>
להכין את הפתרונות הבאים מכתים דנ א או העיכול של DNA מוכתם.
	<ol>
<li>להכין x 1 TE (טריס-HCl וחומצה ethylenediaminetetraacetic; מאגר EDTA) באמצעות 10 מ מ EDTA טריס-HCl ו- 1 מ מ משורה או סטריליות. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).</li>
		<li>להפוך את aliquots של כל צבע: טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3, בובו-3 (טבלה 1). פיפטה 4 µL של 1 מ מ צבע לתוך ענבר כהה או שחור 1.5 mL צינור, להוסיף µL 36 של טה 1 x, לערבב בעזרת פיפטה; ריכוז זה הופך פתרון לצבוע 100 מיקרומטר (סה כ 40 µL). להשלים שלב זה עבור כל צבע. חנות ב 4 º C. הערה: למנוע חשיפת צבע אור כדי למנוע photobleaching או השפלה של לצבוע.</li>
		<li>להכין מאגר 1 באמצעות 10 מ מ Bis-טריס-פרופאן-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- 100 µg/mL אלבומין שור (BSA). הכנת מאגר 2 באמצעות 50 מ"מ NaCl, 10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ MgCl2ו- µg 100-מ/ל BSA. להכין מאגר 3 באמצעות 50 מ מ אשלגן אצטט, 20 מ מ טריס-אצטט, אצטט מגנזיום 10 מ מ, 100 של µg מ ל BSA. לכל אנזים ידרוש אחד של מאגרים ספציפיים אלה לתפקד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין את הפתרונות הבאים בג'ל.
	<ol>
<li>להפוך 6 x הטעינה לצבוע על ידי שילוב של 0.25% bromophenol כחול, קסילן cyanol 0.25%, 15% Ficoll ב dH2חנות או בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>כדי להפוך את agarose כ- 0.7% ג'ל, שוקל לצאת 0.07 גר' agarose טמפרטורה (HGT) ג'לי גבוהה בתוך הבקבוק Erlenmeyer, להוסיף 100 מ של מאגר x TAE 1 והצב כוס כימית הפוכה על-גבי הבקבוקון.<ol>
<li>מחממים את הפתרון על פלטה חמה עד בועות מתחילים להיווצר על החלק התחתון של הבקבוק, לצוף למעלה.</li>
			<li>הסר את הפתרון הכיריים, ומצננים עצמו את הפתרון נשאר ללא שינוי עד הבקבוקון יכול להיות נגע ביד חשופה, ואז לשפוך את הג'ל לתוך תבנית ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ עם מסרק ג'ל ליצירת בארות.</li>
			<li>להסיר את הבועות ליד המסרק או על פני השטח של הג'ל הבוקעים אותם עם טיפ פיפטה ולאפשר את הג'ל שבמהלכו במשך 15 דקות לפחות. זה ניתן לאחסן במקרר (4 ° C) עטופה בניילון נצמד במשך שבוע למנוע התייבשות של ג'ל או זיהום. לקבלת מידע נוסף על אופן הפעלת ג'ל להפנות לי. et al. 33 . הערה: השתמש מסרק ג'ל עם 30 וולס בודדים. כל אחד צריך להיות רחב עם עומק של 2 מ מ 4.5 מ מ הגובה של הבאר יהיה תלוי כמות ג'ל שפכו לתוך התיבה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין מאגר x TAE (טריס - אצטט - EDTA) 1 באמצעות 40 מ מ טריס-HCl, חומצה אצטית 20 מ מ 1 מ"מ EDTA. לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת ויטראז'ים דנ א
<ol><li>
כתם למדא דנ א (300-800 ng) באמצעות aliquots שונים של צבע. כל צבע (טבלה 1) יש שישה ריכוזים שונים שנבדקו, עבור סכום כולל של 48 תגובות לכל אנזים הגבלה. התהליך הבא מתאר ערכה למעלה עבור התגובה 1 (איור 1).
	<ol>
<li>לדלל למדא הדנ א באמצעות טה x 1 ל- 100 ng / µL. לאחסן 4 ° C. להפוך את פתרון עם נפח כולל של 300 µL.</li>
		<li>כתם למדא unmethylated DNA. עבור כל הלהקה צפויה מן התקציר, מעריכים 75-100 ng/להקה. להוסיף כמויות מתאימות של צבע כדי לייצר ריכוזים של 1.9 מיקרומטר, 3.8 מיקרומטר, 19.4 מיקרומטר, 32.2 מיקרומטר, מיקרומטר: 48.3, 63.5 מיקרומטר / 100 ננוגרם של ה-DNA.</li>
		<li>דגירה בין לילה (15 h - 18 h) ב 4 º C.</li>
		<li>להשאיר תגובה אחת מוכתם לשמש שליטה25. הערה: השתמש unmethylated DNA עבור התגובה לעיכול. אנזימים רגיש מתילציה אין אפשרות לגזור מפוגל אזורים ב- DNA, ייתן הופעה של עיכול לא שלם.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנת וזמינותו אנזים הגבלה
<ol><li>
תקציר מוכתם DNA באנזים הגבלה כדי לקבוע אם את האנזים יכולה לעכל prestained דנ א (איור 1).
	<ol>
<li>למחרת, להוסיף 20 U של אנזים הגבלה, 3 µL של המאגר המתאים (טבלה 2), וכן מים מזוקקים, בלוק, מסוננות עבור סכום כולל של 30 µL. עבור כל תגובה אנזימטית, לבחור את המאגר עם חיתוך היעילות הגבוהה ביותר, אשר ניתן למצוא באתר האינטרנט של היצרן.</li>
		<li>מקום לתגובות באמבט מים בטמפרטורה אופטימלית אנזימטי של הפעילות, רשומים בטבלה מס ' 2 אנזימים 6 בשימוש Maschmann et al., עבור 2-4 h (טבלה 2)25.</li>
		<li>לעצור את התגובה על ידי הוספת 2 µL של 0.5 M EDTA pH 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting צבעונית-DNA ג'ל Agarose
<ol><li>הסר את הצדדים כייר ג'ל 24.5 ס"מ 21.8 ס"מ (שלב 1.2.2) ומניחים את הג'ל לתוך התיבה ג'ל אלקטרופורזה. שופכים 2.5 L מאגר x TAE 1 לתוך התיבה. בזהירות להסיר את המסרק ג'ל הג'ל, כך הבארות הם נגישים33.</li>
	<li>Pipette את התגובות אנזים הגבלה על גבי סרט פלסטיק ולשלב בכל תגובה עם 6 x טוען לצבוע. עבור כל הפתרונות התגובה, להוסיף 1 µL של 6 x בטעינת צבע לכל 5-6 µL של פתרון ה-DNA (1 x). ואז pipette את התגובות (המכיל את צבען הטעינה, < 18 µL) לתוך הבארות.</li>
	<li>מערבבים 1 µL של הסולם 1 kb, µL 9 של 1 x TE ו 2 µL של 6 x טוען לצבוע. לטעון פתרון לתוך הבארות לאגף את פתרונות אחרים.</li>
	<li>מכסים את תיבת ג'ל עם נייר כחול או שחור כהה או בד. להתחבר תיבת ג'ל ספק כוח, הגדר את אספקת החשמל 30 וולט, ולהפעיל אותו בן לילה (15-20 שעות). לכבות את האורות בזמן פועל הג'ל, כדי למנוע photocleavage של ה-DNA עם תוויות.</li>
	<li>למחרת בבוקר לבטל את אספקת החשמל. בג'ל החוצה באמצעות המגש ולהעביר אותו במיכל עם 45 µL אתידיום ברומיד, 1 ליטר 1 מאגר x TAE. לאחסן את המיכל בטמפרטורת החדר בחושך או לכסות בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. תן ג'ל הכתם למשך לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר. התראה: שימוש אתידיום ברומיד עם כפפות, בטיחות משקפיים. כאשר מנקים את הגורם המכיל אתידיום ברומיד פתרון ולזרוק את הג'ל, להתייעץ עם ההנחיות לרשות הברית שלך כדי לקבוע כיצד להתמודד עם שימוש אתידיום ברומיד; בנוסף, כתמים אחרים עשויים להיות מנוצל במקום אתידיום ברומיד.</li>
</ol>5. הדמיה הג'ל Agarose
<ol><li>מקם את הג'ל על גבי transilluminator אור כחול, אשר פולט פלט אור מקסימלית בין 400-500 ננומטר. צלם תמונות עם המצלמה מחוברת לתחנה. התראה: הקפד להשתמש את הכיסוי עבור המאיר ולהניח על משקפי מגן לפני הפעלת מקור האור. הערה: שלב זה עשוי גם ניתן להשלים באמצעות כל מקור אור UV או סורק ג'ל רגיל.</li>
	<li>הצג את התמונות ב- ImageJ על-ידי גרירת הקובץ בשורת המצב ImageJ, התמונה תופיע.</li>
	<li>לקבוע את קצב העיכול עבור הניסוי על-ידי השוואת הלהקות הג'ל לתבנית ג'ל הצפוי סיליקו . כדי לקבוע את שיעור עיכול, מספר להקות ניסיוני מחולק על ידי המספר הצפוי של ה-DNA להקות24,25. אם התבנית ניסיוני DNA מתעכל הלהקה הדפוס הצפוי, שיעור עיכול הוא 1. אם התבנית יש קטעים יותר מהצפוי, שיעור עיכול הוא גדול מ- 1. אם התבנית יש קטעים פחות מהצפוי, שיעור עיכול הוא קטן מ-1.</li>
</ol>

<ol><li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278(2007).</li>
<li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-015-1685-y">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li>
<li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+propulsion%3A+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li>
<li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li>
<li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="https://austingroup.princeton.edu/publications/gradient-nanostructures-interfacing-microfluidics-and-nanofluidics">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li>
<li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25(2009).</li>
<li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+%3A+nanocoding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li>
<li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li>
<li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li>
<li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101(2005).</li>
<li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA%3A+effect+of+modifying+the+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li>
<li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li>
<li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
<li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li>
<li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li>
<li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li>
<li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304(2015).</li>
<li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clone-free%2C+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+%28Bos+taurus%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644(2015).</li>
<li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913(2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711(2009).</li>
<li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

על מנת לעכל DNA fluorescently שכותרתו (איור 1), סדרה של צעדים נדרשים. ראשית, ה-DNA היא מוכתמת עם fluorochrome בן לילה. דנ א יכול להיות מודגרות עם cyanine הדימרים לתקופה קצרה של זמן; אולם, Carlsson. et al. נמצא כי ה-DNA נוצר להקות כפול עבור כל גודל ה-DNA עקב מכתימים לא שלם20. כדי לתקן זאת, ה-DNA יכול להיות מוכתם לילה כדי למנוע התרחשות להקות כפול. זהו שלב קריטי בפרוטוקול. אם לא לצבוע מודגרת למשך זמן ארוך מספיק, לצבוע-הדנ א לא ייתכן ב"שיווי ויית...

הסדרה טוטו (טוטו-1, YOYO-1, פופו-1, בובו-1, טוטו-3, YOYO-3, פופו-3 ובובו-3; טבלה 1) הוא מנוצל במגוון רחב של ניסויים איפה הפריט החזותי של ה-DNA נדרש1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. משפחת דימר cyanine נעשה שימוש נרחב שלהם תשואה קוונטית, רגישות וכתוצאה זיקה גבוהה עבור ה-DNA מולקולות18,19,20. צבעי דימר cyanine יש סלקטיביות נהדר עבור DNA נטושים כפול, כאשר intercalated יש עלייה 100 עד 1000 קיפול של קרינה פלואורסצנטית21. Pyridinium צבענים (YOYO-1, טוטו-1, YOYO-3 וטוטו-3) יש פליטה אורך גל קצר יותר מאשר שלהם quinolium לצבוע את עמיתיהם (טבלה 1) (בובו-1, פופו-1, בובו-3 ו- 3 פופו)22. כמו כן, התשואה קוונטית של הדימרים cyanine intercalated לתוך ה-DNA הוא גבוה (0.2 - 0.6)22. עם זאת, באמצעות אנזים כדי לקבוע את הפרופיל מתילציה של מולקולת ה-DNA2 או למתוח23 של מולקולה DNA כבר מוכתם הפלורסנט דורש שיטה לקביעת אנזימים מה לעכל DNA מוכתם. ניתן להשתמש בכל סוג של צבע זה intercalates לתוך ה-DNA או כל אנזים זה נותן דפוס ניכרת של המצע DNA עבור שיטה זו.
מנג. et al. קודם נקבע שיעור עיכול של DNA prestained באמצעות אלקטרופורזה בג'ל באמצעות מגוון של צבעים שונים24. . Maschmann et al. צלל ב עמוק יותר להסתכל על משפחת טוטו של צבע. שניהם נקבע שיעור עיכול של ויטראז'ים דנ א כדי לראות אם ה-DNA צבעונית עם צבע נתון יכול ובינינו עם אנזים הגבלה25. שיטות אחרות ללמוד איגוד אפקטים של צבעים intercalated עם ה-DNA בעזרת מלקחיים אופטיים26 או NMR27. אחת מהשיטות דורש ציוד מיוחד; ואילו, שיטה זו מאפשרת ציוד שיש רוב מעבדות ביולוגיה מולקולרית כדי לקבוע אם צבע מפריע לעיכול אנזים הגבלה.
בנוסף, בשיטות אחרות כדי למדוד את האורך של מולקולה נתונה, מיפוי אופטי מאורך, מוכתם במולקולות דנ א על משטח, מתעכל דנ א כדי לקבוע את המתיחה והגודל של קטעים. העיבור של צבע הוכח להגדיל את אורך מתאר של מולקולות DNA fluorescently ויטראז'ים ובהתאם את הצבע המשמש, אורך מתאר שונה21. בשיטה זו יש כבר מנוצל במגוון של הגנום1,3,4,6,13,28,29,30, 31. אולם, אם המולקולות היה מוכתם מראש, בהתאם לצבוע אנזים, האנזים לא יוכלו לגזור DNA צבעונית עם צבע נתון. לכן, בשיטה זו קובעת אם הדנ א צבעונית עם צבע נתון יכול להיות מתעכל עם אנזים. בנוסף, בהתאם לריכוז לצבוע, לצבוע מנוצל, הניידות של ה-DNA להקות בג'ל להעביר לאט יותר מאשר DNA יליד בשל ההתרה חלקית של עמוד השדרה ה-DNA כדי לפנות מקום לצבוע להוסיף בין בסיסי זוגות32 .
עם זאת, לפעמים אלה צבעי יכול חלקית או לחלוטין לעכב את הפעולה של אנזימי הגבלה מסוימת,7,24. זה נחשב להיות עקב שינוי מבני ב- DNA הנגרם על ידי ההחזקה של הפלורסנט, אשר עשוי למנוע את האנזים מהכרה רצף מסוים שלו. הבנה כיצד צבע אלה משפיעים על אנזימי הגבלה יכול לסייע בניסויים שבו נדרשת לפרופיל מתילציה או את המתיחה של DNA מוכתם.
בשיטה שלנו, ה-DNA היה מוכתם fluorochrome עניין, מתעכל עם אנזים ההגבלה. אז הדנ א היה electrophoresed-ג'ל, עם תמונה, נמדד קצב העיכול אנזים הגבלה. אנזימי הגבלה נבחרה בהתבסס על התבנית שנגזרו על ג'ל. מדי להקות גרם החפיפה של להקות DNA ולא מעט מדי להקות נתנו תמונה שלמה של ה-dna. יש חניה טובה. כדי להיות מסוגל לקבוע את הפרופיל של מולקולת הדנ א מתעכל; לכן, זה יהיה תלוי על ה-DNA בשימוש ואת האנזים. היתרון בשיטה זו הוא הפשטות שלה; זה רק דורש ציוד בשימוש של הגבלת לעיכול, ג'ל אלקטרופורזה.

<table><tbody><tr><td>למבדה ללא מתילציה DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>HCl Fisher</td></tr><tr><td></td><td></td><td>רעיל S25358</td> מאגר <td>קורוזיבי ומגרה</td></tr><tr><td>1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>מאגר 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>מאגר 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>ג'ל אגרוז בטמפרטורת ג'ל גבוהה</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר</td><td>S25118</td> אור כחול <td>מסוכן</td></tr><tr><td>Transilluminator</td><td>קורא כהה</td><td>DR196</td><td>להרכיב משקפיים נכונים&nbsp;</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>פישר</td><td>15585011</td><td>מסרטן; חלופות אחרות הן ננסי 520, ג'ל אדום וכו'.</td></tr><tr><td>תותח EOS Rebel T3I מצלמה</td><td>תותח</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפוג'י דגם H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח בסיסי Pac</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פיקול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>איסטמן</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

קביעה אם הדנ א מוכתם cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

ויזואליזציה של ה-DNA על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מנצל במגוון צבעים כגון צבעי cyanine. צבעים אלה מנוצלים בשל שלהם זיקה גבוהה ורגישות לדנ א. על מנת לקבוע אם מולקולות DNA הן באורך מלא לאחר סיום הניסוי, שיטה נדרשת כדי לקבוע אם מולקולות מוכתמים הם באורך מלא על ידי ה-DNA עם אנזימי הגבלה. עם זאת, DNA מוכתם עלול לעכב האנזימים, כך שיטה נדרשת כדי לקבוע איזה אנזימים אחד תוכל להשתמש עבור fluorochrome צבעונית הדנ א. בשיטה זו, ה-DNA הוא מוכתם צבע cyanine בין לילה כדי לאפשר את צבען ואת ה-DNA כדי equilibrate. דנ א הבא, ויטראז'ים מתעכל עם אנזים ההגבלה, נטען לתוך ג'ל, electrophoresed. הלהקות תקציר DNA ניסיוני מושווים לעיכול סיליקו כדי לקבוע את פעילות אנזים הגבלה. אם יש מספר זהה של להקות, כצפוי, ואז התגובה היא מלאה. עוד להקות מהצפוי מצביעים על עיכול חלקי ולהקות פחות מצביעים על עיכול לא שלם. היתרון של שיטה זו הוא הפשטות שלה, היא משתמשת בציוד מדען צריכה בשביל באנזים הגבלה assay, ג'ל אלקטרופורזה. מגבלה של שיטה זו הוא זמין למדענים רוב האנזימים הם אנזימים זמינים מסחרית; עם זאת, אפשר להשתמש אנזימי הגבלה כלשהי.

על מנת לקבוע שאם צבע intercalating ישפיע באנזים הגבלה לעכל את ה-DNA, הסדר הנכון של שלבים בטח בעקבות (איור 1). לאחר ה-DNA היא צבעונית, מתעכל עם אנזים מסוים, ניתן לקחת תמונה של הג'ל כדי לקבוע את מספר קטעים ואת גודלם (איור 2). על מנת לקבוע את יעילות האנזים, המספר הכולל של הצפוי להקות גלוי לחלק למספר להקות גלוי. אנזים היעילות שווה אחדות, אם המספר של להקות צפוי לראות התאמה. אם יש עוד להקות על הג'ל ואז ציפית, הערך הוא גדול מאחד ומציין ...

צביעת במולקולות דנ א על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מאפשר מדען להציג אותם במהלך ניסוי. השיטה המוצגת כאן, במולקולות דנ א מראש צבעונית עם צבעי פלורסנט, מתעכל מתילציה, אנזימי הגבלה רגיש שאינו מתילציה.

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעכל מולקולות DNA עם תווית פלואורסצנטית עם אנזימי הגבלה רגישים למתילציה ולא מתילציה ולקבוע את קצב העיכול של הניסוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי הכימיה או הביולוגיה, כגון גנומיקה. היתרון בשיטה זו הוא שמדען יכול לעכל דנ"א מוכתם מראש עם אנזים כדי לקבוע אם הדנ"א הוא באורך מלא לאחר השלמת ניסוי אחר.מי שידגים את ההליך יהיה דרו תומפסון, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלי. להכנת ג'ל אגרוז 0.7%, שקלו 1.4 גרם של אגרוז בטמפרטורת ג'ל גבוהה בבקבוק ארלנמאייר. לאחר מכן מוסיפים 200 מיליליטר של מאגר TAE 1x ומניחים הפוכה על גבי הבקבוק.מחממים את התמיסה על פלטה חמה עד שמתחילות להיווצר בועות בתחתית הבקבוק וצפים למעלה. מוציאים את התמיסה מהפלטה החמה ונותנים לה להתקרר עד שניתן לגעת בבקבוק ביד חשופה. לאחר מכן שופכים את הג'ל לתבנית ג'ל בגודל 24.5 ס"מ על 21.8 ס"מ עם מסרק ג'ל ליצירת בארות.השתמש בקצה פיפטה כדי לפוצץ את הבועות ליד המסרק או על פני הג'ל ואפשר לג'ל להתמצק למשך 15 דקות לפחות. כדי לצבוע DNA למבדה בשישה ריכוזים שונים של צבעים, התחל בשימוש ב-1x TE להכנת 300 מיקרוליטר של 100 ננוגרם למיקרוליטר של DNA למבדה. אחסן את התמיסה בארבע מעלות צלזיוס.בעת הכנת דגימה לכל אחד מריכוזי הצבע הבאים עבור כל פס הצפוי בעיכול הגבלה, יש לצבוע 75 עד 100 ננוגרם של DNA למבדה ללא מתילציה דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, כדי לקבוע אם אנזים הגבלה יכול לעכל את ה-DNA המוכתם, הוסיפו 20 יחידות של אנזים הגבלה, שלושה מיקרוליטרים של המאגר המתאים עם יעילות החיתוך הגבוהה ביותר, ומים מזוקקים ומסוננים לתגובה של 30 מיקרוליטר.הניחו את התגובות באמבט מים בפעילות האנזימטית האופטימלית ודגרו אותן למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן עצרו את התגובות על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של 0.5 מולרי EDTA pH 8.0. הסר את הדפנות מתבנית הג'ל שהוכנה בעבר והניח את הג'ל בקופסת האלקטרופורזה של הג'ל.יוצקים 2.5 ליטר של מאגר TAE 1x לקופסה. לאחר מכן הסר בזהירות את מסרק הג'ל מהג'ל כך שהבארות יהיו נגישות. צנחו את תגובות אנזים ההגבלה על סרט פלסטיק, ולכל תמיסת תגובה, הוסיפו מיקרוליטר אחד של צבע טעינה פי 6 לכל חמישה עד שישה מיקרוליטרים של תמיסת DNA.ואז פיפטה את התגובות לבארות. מערבבים מיקרוליטר אחד של סולם קילו-בסיס אחד, תשעה מיקרוליטר של 1x TE ושני מיקרוליטר של צבע טעינה פי 6. לאחר מכן טען את התמיסה לבארות שמאגפות את הפתרונות האחרים.מכסים את קופסת הג'ל בנייר או בד כחול כהה או שחור, ואז מחברים את קופסת הג'ל לאספקת חשמל. הגדר את ספק הכוח ל-30 וולט והפעל אותו למשך הלילה. כבה את האורות בזמן שהג'ל פועל כדי למנוע פוטו-מחשוף של ה-DNA המסומן.למחרת בבוקר, העבירו את הג'ל במגש למיכל עם 45 מיקרוליטר אתידיום ברומיד וליטר אחד של מאגר TAE 1x. אחסן את המיכל בטמפרטורת החדר בחושך או כסה אותו בנייר כסף כדי למנוע חשיפה לאור. תן לג'ל להישאר לפחות 45 דקות בטמפרטורת החדר.כדי לצלם את הג'ל, הנח את הג'ל על גבי טרנסמאלייטור אור כחול, הפולט תפוקת אור מקסימלית בין 400 ל-500 ננומטר. צלם תמונות עם מצלמה המחוברת לתחנה. קבע את קצב העיכול של הניסוי על פי פרוטוקול הטקסט.יעילות האנזים נקבעת על ידי חלוקת המספר הכולל של הרצועות הצפויות במספר הרצועות הנראות לעין. בנוסף, על מנת לקבוע את הגודל המשוער של הרצועות, נדרשת בקרה כדי לדעת היכן צפויות מולקולות ה-DNA המקוריות בהשוואה ל-DNA המוכתם. הניידות של הרצועות בנתיבים 3 ו-4 פחתה, מה שגרם ללהקות להתקרב לבארות.בנתיבים אלה, כמות הצבע אינה משפיעה באופן ניכר על הניידות, ולכן הרצועות תואמות את השליטה. נתיבים 5 ו-6 מראים יותר רצועות מאשר הביקורת, מה שמעיד על עיכול חלקי, מה שמרמז על הצבעים שהשפיעו על המחשוף באתרי זיהוי. בניסוי הזה, כל הרצועות הצפויות נראות עבור כל ריכוזי הצבע, כך שהקוביות לא הפריעו לעיכול הדנ"א.כדי לראות כיצד הניידות השתנתה ככל שריכוז הצבע YOYO-1 גדל, הוכנסו כוכביות צבעוניות ליד כל רצועה. לדוגמה, לרצועות של 3.5 קילו-בסיס יש כוכביות אדומות לידן בכל ריכוז YOYO-1. ללהקות הבלתי צפויות בנתיבים 5 ו-6 אין כוכבית ליד הרצועות.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכסות את הג'ל בפיסת נייר כהה ולהשלים את הפעלת הג'ל בחדר חשוך. כמו כן, הקפד להשתמש בצינורות כהים לתגובות שלך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעכל מולקולות DNA מוכתמות פלואורסצנטיות עם אנזימי הגבלה ולקבוע את קצב העיכול של התגובה.אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת ביותר, ולכן יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי בטיחות בעת ביצוע ההליך. כמו כן, הקפד להרכיב משקפי בטיחות מתאימים בעת שימוש בטרנס-מאיר.

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרסום זה מתאר כיצד להשתמש מיני דגים Agilent מערכת זיהוי כדי לזהות את המין של דג על ידי הפקת DNA וביצוע PCR וניתוח RFLP.

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

הגנום מאורגן במרחב הגרעיני למבנים שונים שניתן לגלות באמצעות טכנולוגיות לכידת קונפורמציה כרומוזומית. שיטת Hi-C בגרעין מספקת אוסף רחב של אינטראקציות כרומטין בקווי תאים של Drosophila, אשר מייצר מפות מגע שניתן לחקור ברזולוציית מגה-בסיס ברמת שבר ההגבלה.

In-Nucleus Hi-C בתאי דרוסופילה

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.

קבלת A עם 3Cs: לכידת קונפורמציה כרומוזומים לסטודנטים לתואר ראשון

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

פרוטוקול זה מדגים ביצוע בדיקת מולקולה בודדת להדמיה חיה של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG. הוא מתאר (1) הכנת מצע דנ"א, (2) טיהור פלואורסצנטי המסומן כמנחת מסוקים Drosophila melanogaster CMG, (3) הכנת תא זרימה מיקרופלואידי למיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF), ו-(4) בדיקת שחרור DNA של מולקולה יחידה.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

פרוטוקול עבור פרופיל מטבולים של דגימות ביולוגיות על ידי ספקטרומטריית אלקטרופורזה-מסת נימים באמצעות עיצוב ממשק טיפ נקבובי sheathless מוצג.

Sheathless נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית מסה עבור מטבולית Profiling של דגימות ביולוגיות

למדו כיצד לעכל DNA סומן בפלואורסצנטיות באמצעות אנזימי הגבלה רגישים למתילציה. שיטה זו מאפשרת הערכת שלמות ה-DNA לאחר ניסויים ביוכימיים וגנומיים שונים.

קביעה אם הדנ א מוכתם Cyanine צבע יכול להיות מתעכל עם אנזימי הגבלה

גלה סרטונים נוספים