בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסוי זה היא לחקור את תפקידם של כוחות מכניים בהתפתחות מוחית עוברית מוקדמת באמצעות ניסויים מחוץ לביצ. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית ובביומכניקה, כגון תפקידם של רמזים מכניים במורפוגנזה, שהיא יצירת צורה ביולוגית. יתרונה העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לאפיין את תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה ברמת הרקמה והאורגניזם.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במגבונים עדינים עם 70% אתנול כדי לנקות את ביצי העוף המופרות ללא פתוגנים ספציפיים. לאחר מכן, מסדרים את הביצים בכיוון אורכי על מחזיק. לאחר מכן, הגדר את חממת הביצים בטמפרטורת יעד של 37.5 מעלות צלזיוס, ושמור על הלחות על 48 עד 55%הלחות נשלטת על ידי הוספת כמות מתאימה של מים לחממה.

דגרו על הביצים למשך כ-40 עד 44 שעות עד HH11 עד 13. לאחר מכן, הניחו לביצים להתקרר בטמפרטורת החדר למשך כ-15 עד 30 דקות לפני הניקוי עם 70% אתנול. בשלב זה, פצחו את הביצים מלמטה, פרקו את הקליפה בעדינות והפקידו בזהירות את התכולה לצלחת פטרי בגודל 150 על 15 מילימטר.

כדי להבטיח שצד העובר למעלה, שמור את הביצים באותו כיוון שבו הן הודגרו בזמן פיצוחן. הסר את האלבומין הדק באמצעות פיפטה חד פעמית של פסטר. מפרידים את האלבומין העבה מהחלמון בעזרת המלקחיים הבוטים.

ודא שהאלבומין העבה הוסר על ידי גירוד קל של החלק העליון של החלמון. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים, הניחו טבעת נייר סינון מעל העובר ומרכזו אותה, תוך התאמת הציר הארוך של הטבעת לציר הארוך של העובר. לאחר מכן, חותכים את החלמון המקיף את טבעת נייר הסינון במספריים.

לאחר מכן, משוך את הטבעת והעובר מהחלמון בכיוון אלכסוני לכיוון המקום בו נחתך החלמון לראשונה. לאחר מכן, שטפו את העובר בשתי מנות עוקבות של 100 מילימטר עם PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו טבעת נייר פילטר בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר.

הניחו את הצד הגבי של העובר כלפי מעלה על נייר הסינון השני בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. לאחר מכן, הניחו טבעת נירוסטה על גבי כריך נייר המסנן. הקפד לא לפגוע בעובר.

כעת, הוסיפו שלושה מיליליטר של ה-CCM שהוכן בעבר לכל צלחת פטרי. הסר את קרום הוויטלין של כל עובר על ידי רפרוף קל של מחט הנימים הנמשכת על פני החלק העליון של העובר. לאחר מכן, מקלפים את קרום הוויטלין, מתחילים מהקצה הקדמי וממשיכים לנוטוכורד.

לאחר מכן, הניחו שמונה צלחות פטרי בגודל 35 מילימטר בצלחת אחת של 150 מילימטר מרופדת במגבונים רוויים במים כדי לשמור על הלחות. לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי בגודל 150 מילימטר לתוך שקית ניילון אטומה, ומלאו את השקית בתערובת גז המורכבת מ-95% חמצן ו-5% CO2. אטמו את השקית, והניחו אותה באינקובטור של 37.5 מעלות צלזיוס.

כעת, הוציאו את העובר מהאינקובטור, והשתמשו במערכת OCT כדי לדמות אותם ולקבוע את זווית הפיתול של הצינור העצבי. העבירו את העוברים למיקרוסקופ אור, והדמיינו בהגדלה של פי 10. השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בהדרגה 0.2 מיליליטר מדיה מצלחת הפטרי.

צלם תמונות שדה בהיר לאחר כל סבב של הסרת מדיה כדי לראות את השפעת ממשק המדיה-אוויר על העובר. המשך להסיר את המדיה עד שמתח הפנים על פני העובר גורם לפיתול. דמיינו את העובר באמצעות מערכת OCT פעם נוספת כדי ליצור זווית פיתול סופית להשוואה לביקורת עוברים.

כדי לשנות את כיוון לולאת הלב, השתמש בזוג מלקחיים כדי להפוך את נייר הסינון כך שהעובר יהפוך לצד הגחון כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש בצינור הנימים הנמשך כדי לחתוך חריץ בקרום ה-splanchnopleure ולהפעיל כוח מכני כדי לדחוף את הלב מהצד הימני לצד השמאלי. הפעל את מתח פני הנוזל כדי לשמור על הלב בצד שמאל.

לאחר מכן, דגרו על העובר למשך 20 שעות נוספות כדי לראות את השינוי בכיראליות של הפיתול. מוצג כאן עובר שנקצר עם VM שהוסר ב-HH11. אותו עובר דגר במשך 27 שעות לאחר הסרת ה-VM והראה פיתול מופחת.

הנה אותו עובר שעבר פיתול מוחי עם הפעלת מתח פנים נוזלי, והנה עובר הביקורת עם פיתול מוחי תקין בשלב דומה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיזהר לא לפגוע בעובר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח אלמנטים סופיים על מנת למדל באופן חישובי כיצד כוחות פיזיקליים יכולים להשפיע על המורפולוגיה.

לכן, טכניקה זו שפותחה כאן סללה את הדרך למחקרים עתידיים על מכניקת המורפוגנזה בעוברי אפרוחים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד לקצור עוברי אפרוחים לתרבית חוץ גופית, להסיר במיקרו-ניתוח את קרום הוויטלין, לסכם מחדש את הכוח המסופק על ידי קרום הוויטלין ולעקוב אחר מורפולוגיה עוברית באמצעות OCT והדמיית שדה בהיר.