Name: בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: חקור את תפקיד הכוחות המכניים בהתפתחות המוח העוברי המוקדם של תרנגולת White Leghorn באמצעות ניסויים ex-ovo. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי מורפוגנזה ברמת הרקמה והאורגניזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z.C. מאשר התמיכה של קרן הפעלה דארטמאות והחברה ברנקו וייס - לאחווה המדע, מנוהל על ידי ETH ציריך. המחברים תודה ד"ר לארי א טאבר, Benjamen א Filas, גואו Qiaohang, ו Yunfei שי לדיונים מועיל, כמו גם הבודקים אנונימי להערות. חומר זה מתבסס על עבודה נתמכת על-ידי הלאומית למדע קרן בוגר מחקר לאחווה תחת גרנט מס DGE-1313911. כל דעה, ממצאים, מסקנות או המלצות לידי ביטוי בחומר זה הם אלה של המחברים (s), אינן משקפות בהכרח את הנופים של הקרן הלאומית למדע.

1. הכנת תרביות רקמה מדיה
<ol><li>השתמש בקבוק חצי ליטר בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) עם גלוקוז 4.5 g/L, סודיום ביקרבונט-גלוטמין כבסיס לתקשורת תרבות.</li>
	<li>ב תא סטרילי למינארי, להוסיף 10 מ של אנטיביוטיקה חצי ליטר של DMEM.</li>
	<li>באמצעות פיפטה סטרילי, להעביר צינור חרוטי סטרילי 50 מ ל 50 מ של הפתרון אנטיביוטיקה DMEM.</li>
	<li>להוסיף 50 מ של נסיוב החתיכה הפתרון אנטיביוטיקה DMEM שנותרו בבקבוק 0.5 L בשכונה סטרילי.</li>
	<li>לאחסן הפתרון הסופי (המכונה מכאן והלאה צ'יק תרבות המדיה [CCM]) ב- 50 מ ל aliquots צינור חרוטי ב-20 ° C.</li>
</ol>2. דגירה
<ol><li>שימוש עדין מגבונים עם 70% אתנול לנקות מופרית ספציפי פתוגן-חופשית לגהורן לבן ביצי תרנגולת. לארגן ביצים כיוון האורך על מחזיקי.</li>
	<li>הפעל אינקובטור ביצים להגדיר יעד לטמפרטורה של 37.5 ° C ולשמור על הלחות ב 48-55%. הלחות נשלטת על-ידי הוספת כמות מספקת של מים החממה.</li>
	<li>דגירה הביצים HH11-13, כ 40-44 h.</li>
	<li>תן שהביצים להתקרר בטמפרטורת החדר במשך כ- 15-30 דקות לפני הריסוס/ניקוי עם 70% אתנול.</li>
</ol>3. משוך נימים זכוכית
<ol><li>הר של צינורות קפילר באורך ס מ זכוכית 10 עם הקוטר החיצוני של 1.0 מ מ, של הקוטר הפנימי של 0.5 מ מ- פולר micropipette.</li>
	<li>הגדר את החום ומשוך פרמטרים 750, 400, בהתאמה. לחץ על לחצן משיכה כדי לגרור את צינור קפילרי מחטים דק.</li>
</ol>4. נייר סינון הספק שיטה
<ol><li>חותכים עיגולים של 3 ס מ קוטר מסנן נייר.</li>
	<li>חותכים מלבן בערך 1 ס מ על ידי 2 ס מ מן המעגל באמצעות צעצועים. הקפד להסיר כל בולטות או פינות חדות.</li>
</ol>5. העובר קציר והכנות
<ol><li>לפצח את הביצים מלמטה, להפריד את הקליפה בעדינות, היטב להפקיד תוכן לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ x 15 מ"מ. כדי להבטיח שהצד העובר קורה, לשמור את הביצים באותו הכיוון שהם היו מתפשט תוך פיצוח אותם.</li>
	<li>הסר את אלבומין דק בעזרת פיפטה חד פעמיות של פסטר.</li>
	<li>להפריד את אלבומין עבה החלמון באמצעות מלקחיים שהסתיימה בוטה. ודא כי אלבומין עבה הוסר על ידי גירוד בקלילות העליון של החלמון עם המלקחיים שהסתיימה בוטה.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים שקצהו הקנס מרכז ולמקם טבעת נייר סינון על העובר, התאמת לציר הארוך של הטבעת עם הציר הארוך של העובר.</li>
	<li>חותכים את החלמון המקיפים את הטבעת נייר סינון עם מספריים.</li>
	<li>למשוך את הטבעת ואת העובר את החלמון אלכסוני לכיוון האתר שבו החלמון תחילה נחתך.</li>
	<li>יש לשטוף את העוברים בתוך שתי מנות 100-מ מ רציפים עם טמפרטורת החדר 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>במקום הראשון טבעת נייר סינון לתוך צלחת פטרי 35 מ מ. אז במקום הצד הגבי העובר על גבי נייר הסינון כבר בצלחת פטרי 35 מ מ.</li>
	<li>במקום טבעת נירוסטה על גבי נייר סינון הכריך. ודא שלא יגרמו נזק העובר.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של CCM מוכן קודם לכן כל צלחת פטרי.</li>
	<li>להסיר את ה-VM של כל העובר על ידי בקלילות מרמה את המחט נימי משך לרוחב החלק העליון של העובר, פילינג VM משם, החל מהקצה הקדמי (מעל הקדמי), שימשיך מיתר הגב (איור 1 א').</li>
	<li>מקום 8 35 מ מ צלחות פטרי לתוך צלחת אחת של 150 מ מ זה היה רצוף מים רווי המשימה העדינה מגבונים (כדי לשמור על לחות).</li>
	<li>המקום הפטרי 150-מ מ לתוך שקית ניילון sealable ואז למלא את התיק עם תערובת גז המורכב 95% O2 ו- 5% CO2.</li>
	<li>לסגור את השקית ולמקם אותו חממה 37.5 ° C.</li>
	<li>דגירה העוברים עבור h 27 נוספים עד HH15-HH16 (איור 1B).</li>
</ol>6. גרימת מתח פנים
<ol><li>להסיר את העוברים מן החממה ולהשתמש מערכת אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (אוקטובר) תמונה אותם. שימוש OCT כדי לקבוע את זווית הכיווניות הצינור העצבי (NT) (איור 2).</li>
	<li>להעביר את העוברים מיקרוסקופ אור והמחש בהגדלה X 10. להשתמש על פיפטה 200 microliter בהדרגה להסיר את 0.2 מ"ל של מדיה הפטרי.</li>
	<li>קח תמונות brightfield בכל פרק זמן לבחון את ההשפעות של ממשק מדיה-אייר על העובר.</li>
	<li>להסיר מדיה עד המתח על פני העובר גורם פיתול (איור 1C).</li>
	<li>תמונה העובר באמצעות מערכת OCT פעם נוספת כדי לקבוע זווית הפיתוליות הסופי להשוואה לשלוט עוברי.  הערה: התמונות ברייט-שדה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. מערכת טומוגרפיה אופטית קוהרנטית עם מיקרוסקופ המצורפת שימש לרכוש אוספי תמונות חתך של העוברים בשידור חי. תמונות היו שהושגו בתחום 3 x 10 מ"מ x 3 מ"מ3 סריקה ולאחר מכן מעובד בתוכנת הדמיה. לבסוף, מודל פיזיקלי התמונות צולמו באמצעות מצלמה דיגיטלית רפלקס יחיד-עדשה.</li>
</ol>7. פיזית מידול של כוחות מתח/VM
<ol><li>לפתח הגיאומטריה 3D פשוטה הדומה העובר בין 17-HH14 בתוכנה מסחרית דוגמנות (איור 3 א).</li>
	<li>עיצוב כייר שלילי של הגיאומטריה 3D תירחסמ 3D גרפיקה תוכנה.</li>
	<li>שימוש במדפסת תלת-ממד נטען עם מ מ 1.75 בוטאדיאן טבעי styrene פילמנט תלת-ממד הדפס מעוצב העובש, בתבנית stereolithographic (.stl).</li>
	<li>להטיל את התבנית, לערבב את הרכיבים גומי סיליקון של אלסטומר A ו- B בחלקים שווים, יוצקים את התערובת לתבנית באופן מיידי; הגדר את עובש הליהוק לרפא בטמפרטורת החדר במשך 12 שעות (איור 3B).</li>
	<li>סמן את מודל פיזיקלי של העובר לאורך NT בצד הגבי להמחיש פיתול.</li>
	<li>השתמש coverslip כדי לשכפל את כוח להחיל על דגם התלת-ממד פיזי אשר מחקה את זה של VM או מתח (דמות תלת-ממד).</li>
	<li>הכנס של סדרת נוקשה חוטים באורך שווה לצד של המודל הפיזי. לאחר coverslip מפעילה כוח חיצוני על המודל המוח, החוטים להיות מוטה בזווית תלוי במיקום. לקבוע את זווית הסיבוב על ידי arctan של אורך המוקרנת על אורך כל חוט (איור 3E) המקורי.</li>
</ol>8. שינוי הכיוון של הלולאה הלב
<ol><li>בצע את השלבים ב 3.1 ו- 3.2 לקבל צינור קפילרי משך.</li>
	<li>בצע את השלבים ב- 5.1 דרך 5.10 להכין את העובר.</li>
	<li>השתמש זוג מלקחיים כדי להפוך נייר הסינון כך העובר הופכת הגחוני /-צד-up.</li>
	<li>השתמש את צינור קפילרי משך לחתוך חתך ממברנה splanchnopleure (SPL).</li>
	<li>השתמש את צינור קפילרי להפעיל כוח מכני כדי לדחוף את הלב מן הצד הימני בצד שמאל.</li>
	<li>בצע את השלבים ב- 5.12 דרך 5.15 כדי לבחון את השינוי שחל פיתול.</li>
</ol>

<ol><li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://appliedmechanicsreviews.asmedigitalcollection.asme.org/article.aspx?articleid=1395451">Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis.</a> Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).</li>
<li>Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+models+for+mechanics+of+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Computational models for mechanics of morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).</li>
<li>Savin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+growth+and+form+of+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On the growth and form of the gut.</a> Nature. 476, 57-62 (2011).</li>
<li>Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+of+development%3A+Models+and+methods+for+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C+-+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).</li>
<li>Shyer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Villification%3A+how+the+gut+gets+its+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Villification: how the gut gets its villi.</a> Science. 342, 212-218 (2013).</li>
<li>Ambrosi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+biological+growth+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanics+and+Physics+of+Solids%22%5BJournal%5D)">Perspectives on biological growth and remodeling.</a> Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3530441">Tunable helical ribbons.</a> Appl. Phys. Lett. 98, (2011).</li>
<li>Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+cucumber+tendril+coils+and+overwinds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How the cucumber tendril coils and overwinds.</a> Science. 337, 1087-1091 (2012).</li>
<li>Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+mechanics+in+the+opening+of+chiral+seed+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods.</a> Science. 333, 1726-1730 (2011).</li>
<li>Filas, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potential+role+for+differential+contractility+in+early+brain+development+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomech.+Model.+Mechanobiol%22%5BJournal%5D)">A potential role for differential contractility in early brain development and evolution.</a> Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).</li>
<li>Xu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axons+pull+on+the+brain%2C+but+tension+does+not+drive+cortical+folding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding.</a> J. Biomech. Eng. 132, 71013(2010).</li>
<li>Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+embryonic+chick+brain+twists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">How the embryonic chick brain twists.</a> J. R. Soc. Interface. 13, (2016).</li>
<li>Manca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+regulates+axial+rotation+during+early+stages+of+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).</li>
<li>Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+of+the+looping+heart%3A+differential+growth+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bending of the looping heart: differential growth revisited.</a> J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+and+twisting+the+embryonic+heart%3A+A+computational+model+for+c-looping+based+on+realistic+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry.</a> Front. Physiol. 5, (2014).</li>
<li>Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphomechanics%3A+Transforming+tubes+into+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Morphomechanics: Transforming tubes into organs.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).</li>
<li>Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+effects+of+the+surface+ectoderm+on+optic+vesicle+morphogenesis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo.</a> J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+is+cytoskeletal+contraction+required+for+cardiac+fusion+before+but+not+after+looping+begins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?</a> Phys. Biol. 12, 16012(2015).</li>
<li>Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+and+stress-dependent+growth+shape+the+forebrain+of+the+early+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mech.+Behav.+Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo.</a> J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).</li>
<li>Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotatin+is+a+novel+gene+required+for+axial+rotation+and+left-right+specification+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos.</a> Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a, Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+chicken+embryo+culture+system+suitable+for+imaging+and+microsurgery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li>
<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).</li>
<li>Schierenberg, E., Junkersdorf, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eggshell+and+underlying+vitelline+membrane+for+normal+pattern+formation+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Arch.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo.</a> Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).</li>
<li>Chuai, M., Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanisms+Underlying+Primitive+Streak+Formation+in+the+Chick+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo.</a> Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).</li>
<li>Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+forces+in+dextral+rotation+during+cardiac+looping+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo.</a> Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).</li>
<li>Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo.</a> Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).</li>
<li>Voronov, D. A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+experimental+conditions%3A+Effects+of+extraembryonic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces.</a> Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).</li>
<li>Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. <a target="_blank" href="https://journals.aps.org/prapplied/abstract/10.1103/PhysRevApplied.5.017001">Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting.</a> Phys. Rev. Appl. 5, (2016).</li>
<li>Manner, J., Seidl, W., Steding, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+cervical+flexure%3A+an+experimental+study+on+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos.</a> Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).</li>
<li>Ware, M., Schubert, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+early+axon+scaffold+in+the+rostral+brain+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo.</a> J. Anat. 219, 203-216 (2011).</li>
<li>Ramasubramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+intrinsic+and+extrinsic+forces+in+early+cardiac+S-looping%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping.</a> Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).</li>
<li>Hoyle, C., Brown, N. a, Wolpert, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+left%2Fright+handedness+in+the+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of left/right handedness in the chick heart.</a> Development. 115, 1071-1078 (1992).</li>
<li>Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+adaptation+of+the+looping+embryonic+heart+to+altered+mechanical+loads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads.</a> Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).</li>
<li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and the chick embryo.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).</li>
<li>Roebroek, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+ventral+closure+and+axial+rotation+in+embryos+lacking+the+proprotein+convertase+Furin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin.</a> Development. 125, 4863-4876 (1998).</li>
<li>Peebles, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+proton+spectroscopy+and+diffusion+weighted+imaging+of+chick+embryo+brain+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo.</a> Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerberus+regulates+left-right+asymmetry+of+the+embryonic+head+and+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart.</a> Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

בעוד פיסיקליות לשחק תפקיד אינטגרלי מורפוגנזה26,27,28,29,30, למנגנונים מכאניים הספציפיים, יחד עם קואורדינציה של מכונות, המנגנונים המולקולריים, להישאר נחקרו במידה רבה. זה ידוע כי flexure הגחוני של פיתול rightward של המוח הפרימיטיבי הם שני תהליכים המרכזית שתורמים תחילת מורפוגנזה עובריים18,31,<s...

ביולוגיה התפתחותית מודרנית המחקר מתמקד בעיקר פיתוח ההבנה מנקודת המבט של גנטיקה מולקולרית1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ידוע כי התופעה הפיזית לשחק תפקיד מרכזי מורפוגנזה, או הדור של ביולוגית טופס14,15,16,17; עם זאת, מנגנונים מכניים ספציפי של פיתוח נשארים מחקר כלשהו. Flexure הגחוני פיתול rightward של הצינור המוח הפרימיטיבי לאחר המבורגר-המילטון שלב 11 (HH 11)18 הם שני תהליכים עיקריים שתורמים צורה עוברית לשנות19,20. בפרט, המנגנון הפיזי שבבסיס פיתוח הכיווניות של המוח העוברי נשאר שהיישום מובן.
פיתול מתחלקים ב צ'יק העובר הוא בין האירועים morphogenetic המוקדם של אסימטריה (Lr) משמאל בפיתוח. כאשר התהליך של אסימטריה L-R הוא מוטרד, מומים מולדים כגון סיטוס אינברסוס, isomerismאו heterotaxia תתרחש21. כאן אנו מציגים פרוטוקול המשלב לשעבר-ovo ניסויים22,23 עם מידול הפיזי כדי לאפיין כוחות מכני במהלך התפתחות המוח העוברי מוקדמת. מטרת השיטה המובאת היא לזהות את הכוחות מכני אחראי פיתול המוח ואת הגורמים המשפיעים על מידת פיתול במהלך התפתחות מוקדמת12. על סמך התצפית ניסיוני קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, שיערנו כי ה-VM מספק את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. לכן, בשיטה זו, אנו להסיר את החלק של ה-VM שמכסה את האזור במוח כדי לגלות את ההשפעות על פיתול המוח. יתר על כן, השיטה של החלת נוזלים מתח נעשה שימוש כדי לאשר את תפקיד מכני של VM ולספק הערכה של הכוח הדרוש עבור פיתול המוח, אשר לא נעשה בעבר. מדידת הכוחות במהלך מורפוגנזה עובריים הוא משימה מאתגרת. ראוי לציין, במחקר חלוצי, Campàs ועמיתים24 פיתח שיטה לכמת את הלחצים הסלולר באמצעות microdroplets מוזרק. עם זאת, שיטה זו הייתה מוגבלת למדידת כוחות ברמה התאית, ולכן לא ניתן ליישום כדי לחקור את הכוחות על רקמות או אורגניזם-ברמת. פרוטוקול הציג נייר זה פותחה כדי חלקית למלא את החלל הזה.

<table><tbody><tr><td>מופרית ספציפית ללא פתוגן ביצי עוף לבן לגהורן</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אופטי קוהרנטי טומוגרפיה מיקרוסקופ</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>אלסטומר סיליקון</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מנתח</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)</td> <td>לונזה</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה</td><td>סיגמא</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>סרום אפרוח</td><td>סיגמא</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר סאטר דגם P-30</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol MultiPhysics</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת גרפיקה ממוחשבת תלת מימדית</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מחובר ל-OCT</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת</td><td>EOS&nbsp;</td><td>מורד T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

התפתחות באופן מסורתי נלמדת מנקודת המבט של גנטיקה למערכות ביולוגיות, אך החשיבות הבסיסית של מכניקה ב מורפוגנזה מזוהה הופכת יותר ויותר. בפרט, הבחורה עובריים הלב והמוח התחתית, אשר עוברים שינויים מורפולוגיים דרסטי כפי שהם מפתחים, הן בקרב המועמדים הממשלה ללמוד את התפקיד של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה. כיפוף הגחון מתקדמת, פיתול rightward של המוח צ'יק עובריים צינורי יקרה בשלב המוקדם של איברים ברמת משמאל המשווע התפתחות האפרוח. קרום vitelline (VM) מגבילה את הצד הגבי של העובר, היה מעורב במתן את. הכוח הדרוש לגרום פיתול של המוח המתפתח. כאן אנו מציגים שילוב של ניסויים לשעבר-ovo חדשים ובאופן פיזי מידול כדי לזהות את המכניקה של פיתול המוח. המבורגר-המילטון שלב 11, העוברים הם קצרו ותרבותית ex ovo (בתקשורת). ה-VM יוסר לאחר מכן באמצעות צינור קפילרי משך. על ידי השליטה הרמה של הנוזל ובאיומים העובר לממשק נוזל-אייר, מתח הפנים נוזלים של התקשורת יכול לשמש כדי להחליף את תפקיד מכני של VM. תיאום הניסויים בוצעו גם לשנות את המיקום של הלב למצוא תוצאות השינוי כיראליות של פיתול המוח. תוצאות של פרוטוקול זה להמחיש את תפקידי היסוד של המכניקה נהיגה מורפוגנזה.

במחקר זה, ה-VM של העובר-HH11 הוסר מהקצה הקדמי כדי flexure בית החזה. העוברים היו עם תמונה באמצעות מערכת OCT. בשלב זה, פיתול המוח צינור לא התחיל (איור 1 א'). לאחר להיות מודגרות עד HH15-16, העוברים עם שלהם VM הוסר הציג פיתול המוח מופחתת שפופרת, כ-35 מעלות (איור 1B) לעומת שליטה עוברי, אשר מוצג פיתול של בסביבות 90 מעלות. כאשר רמת התקשורת הונמך לזירוז מתח בצד הגבי של העוברים עם המכונה הוירטואלית שלהם הוסר, המוח המעוות ברמות דומות לאלה ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול היכרות עם ערכת ניסויים לשעבר-ovo חדשים וגישות מודלים פיזיים ללמוד את המכניקה של מורפוגנזה במהלך המוקדמות פיתול המוח העוברי צ'יק.

Embryonic development is traditionally studied from the perspective of biomolecular genetics, but the fundamental importance of mechanics in morphogenesis ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסוי זה היא לחקור את תפקידם של כוחות מכניים בהתפתחות מוחית עוברית מוקדמת באמצעות ניסויים מחוץ לביצ. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית ובביומכניקה, כגון תפקידם של רמזים מכניים במורפוגנזה, שהיא יצירת צורה ביולוגית. יתרונה העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לאפיין את תפקידם של כוחות מכניים במורפוגנזה ברמת הרקמה והאורגניזם.כדי להתחיל בהליך זה, השתמש במגבונים עדינים עם 70% אתנול כדי לנקות את ביצי העוף המופרות ללא פתוגנים ספציפיים. לאחר מכן, מסדרים את הביצים בכיוון אורכי על מחזיק. לאחר מכן, הגדר את חממת הביצים בטמפרטורת יעד של 37.5 מעלות צלזיוס, ושמור על הלחות על 48 עד 55%הלחות נשלטת על ידי הוספת כמות מתאימה של מים לחממה.דגרו על הביצים למשך כ-40 עד 44 שעות עד HH11 עד 13. לאחר מכן, הניחו לביצים להתקרר בטמפרטורת החדר למשך כ-15 עד 30 דקות לפני הניקוי עם 70% אתנול. בשלב זה, פצחו את הביצים מלמטה, פרקו את הקליפה בעדינות והפקידו בזהירות את התכולה לצלחת פטרי בגודל 150 על 15 מילימטר.כדי להבטיח שצד העובר למעלה, שמור את הביצים באותו כיוון שבו הן הודגרו בזמן פיצוחן. הסר את האלבומין הדק באמצעות פיפטה חד פעמית של פסטר. מפרידים את האלבומין העבה מהחלמון בעזרת המלקחיים הבוטים.ודא שהאלבומין העבה הוסר על ידי גירוד קל של החלק העליון של החלמון. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים עדינים, הניחו טבעת נייר סינון מעל העובר ומרכזו אותה, תוך התאמת הציר הארוך של הטבעת לציר הארוך של העובר. לאחר מכן, חותכים את החלמון המקיף את טבעת נייר הסינון במספריים.לאחר מכן, משוך את הטבעת והעובר מהחלמון בכיוון אלכסוני לכיוון המקום בו נחתך החלמון לראשונה. לאחר מכן, שטפו את העובר בשתי מנות עוקבות של 100 מילימטר עם PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הניחו טבעת נייר פילטר בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר.הניחו את הצד הגבי של העובר כלפי מעלה על נייר הסינון השני בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. לאחר מכן, הניחו טבעת נירוסטה על גבי כריך נייר המסנן. הקפד לא לפגוע בעובר.כעת, הוסיפו שלושה מיליליטר של ה-CCM שהוכן בעבר לכל צלחת פטרי. הסר את קרום הוויטלין של כל עובר על ידי רפרוף קל של מחט הנימים הנמשכת על פני החלק העליון של העובר. לאחר מכן, מקלפים את קרום הוויטלין, מתחילים מהקצה הקדמי וממשיכים לנוטוכורד.לאחר מכן, הניחו שמונה צלחות פטרי בגודל 35 מילימטר בצלחת אחת של 150 מילימטר מרופדת במגבונים רוויים במים כדי לשמור על הלחות. לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי בגודל 150 מילימטר לתוך שקית ניילון אטומה, ומלאו את השקית בתערובת גז המורכבת מ-95% חמצן ו-5% CO2. אטמו את השקית, והניחו אותה באינקובטור של 37.5 מעלות צלזיוס.כעת, הוציאו את העובר מהאינקובטור, והשתמשו במערכת OCT כדי לדמות אותם ולקבוע את זווית הפיתול של הצינור העצבי. העבירו את העוברים למיקרוסקופ אור, והדמיינו בהגדלה של פי 10. השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בהדרגה 0.2 מיליליטר מדיה מצלחת הפטרי.צלם תמונות שדה בהיר לאחר כל סבב של הסרת מדיה כדי לראות את השפעת ממשק המדיה-אוויר על העובר. המשך להסיר את המדיה עד שמתח הפנים על פני העובר גורם לפיתול. דמיינו את העובר באמצעות מערכת OCT פעם נוספת כדי ליצור זווית פיתול סופית להשוואה לביקורת עוברים.כדי לשנות את כיוון לולאת הלב, השתמש בזוג מלקחיים כדי להפוך את נייר הסינון כך שהעובר יהפוך לצד הגחון כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש בצינור הנימים הנמשך כדי לחתוך חריץ בקרום ה-splanchnopleure ולהפעיל כוח מכני כדי לדחוף את הלב מהצד הימני לצד השמאלי. הפעל את מתח פני הנוזל כדי לשמור על הלב בצד שמאל.לאחר מכן, דגרו על העובר למשך 20 שעות נוספות כדי לראות את השינוי בכיראליות של הפיתול. מוצג כאן עובר שנקצר עם VM שהוסר ב-HH11. אותו עובר דגר במשך 27 שעות לאחר הסרת ה-VM והראה פיתול מופחת.הנה אותו עובר שעבר פיתול מוחי עם הפעלת מתח פנים נוזלי, והנה עובר הביקורת עם פיתול מוחי תקין בשלב דומה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיזהר לא לפגוע בעובר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח אלמנטים סופיים על מנת למדל באופן חישובי כיצד כוחות פיזיקליים יכולים להשפיע על המורפולוגיה.לכן, טכניקה זו שפותחה כאן סללה את הדרך למחקרים עתידיים על מכניקת המורפוגנזה בעוברי אפרוחים. לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד לקצור עוברי אפרוחים לתרבית חוץ גופית, להסיר במיקרו-ניתוח את קרום הוויטלין, לסכם מחדש את הכוח המסופק על ידי קרום הוויטלין ולעקוב אחר מורפולוגיה עוברית באמצעות OCT והדמיית שדה בהיר.

probing-roles-physical-forces-early-chick-embryonic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

מאמר זה מתאר תיוג פני...

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

על ידי השתלת חרוזים ספוגים בגורמי גדילה או מעכבים ספציפיים של מסלולי איתות לעוברים מתפתחים, ניתן לבדוק ישירות את השפעותיהם in vivo. בפרוטוקול זה מושתלים חרוזים בניצן הגפה כדי לקבוע את ההשפעות של מולקולות אלו על ביטוי גנים והעברת אותות.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

מתוארים פרוטוקולים המשתמשים במחסומים אטומים לחסימת אירועי אינדוקציה בין רקמות ציר הגוף הראשי והצד בעובר הגוזל הנדרשים להיווצרות גפיים. חרוזים ספוגים באותות אינדוקטיביים מועמדים משמשים להתגברות על ההשפעה של מיקום מחסום וניתוח ביטוי גנים מאשר זאת.

יישום של חסמים בלתי חדירים בשילוב עם חרוזים ספוגים פקטור מועמד ללמוד איתותי אינדוקטיבי של צ&#39;יק

העדר כלים למדידת תכונות החומר, הפרמטרים tensional ויוו מונע אימות התפקידים שלהם במהלך הפיתוח. אנחנו מועסקים מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ומעקב nanoparticle לכמת תכונות מכניות על התא חלמון העובר תקין דג זברה במהלך epiboly. שיטות אלה הינם אמינים החלים נרחב הימנעות התערבויות פולשניות.

AFM ו Microrheology בתא חלמון עובר דג זברה

אנו מציגים כיוונון של מלקחיים אופטיים מצמידים מיקרוסקופ אור גיליון, ואת יישומו כדי לחקור מכניקה תא בלי חרוזים ב העובר דרוזופילה .

בודק את התא מכניקה עם מלקחיים אופטיים ללא חרוז בתוך העובר דרוזופילה

גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.

גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

בדיקת החרוזים הספוגים כוללת אספקה ממוקדת של ריאגנט הבדיקה בכל נקודת זמן התפתחותית כדי לחקור את ויסות התמיינות התאים והמורפוגנזה. מוצג פרוטוקול מפורט, החל על כל מודל ניסיוני של בעלי חיים, להכנת שלושה סוגים שונים של חרוזים מושרים והשתלתם באינטרדיגיט של עובר עוף.

ניתוח התמיינות תאים, מורפוגנזה ותבניות במהלך עוברי עוף באמצעות בדיקת החרוזים המושרים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

פרוטוקול זה פותח כדי לנטר לאורך זמן את התכונות המכניות של רקמת הצלחת העצבית במהלך נוירולציה של עובר אפרוח. הוא מבוסס על שילוב של מיקרוסקופ ברילואין ומערכת דגירה על הבמה, המאפשרת הדמיה מכנית חיה של רקמת לוחית עצבית בעוברי אפרוחים בתרבית לשעבר .

מעקב אחר האבולוציה המכנית של רקמה במהלך סגירת הצינור העצבי של עובר אפרוח

חקור את תפקיד הכוחות המכניים בהתפתחות המוח העוברי המוקדם של תרנגולת White Leghorn באמצעות ניסויים ex-ovo. שיטה זו מאפשרת לחקור תהליכי מורפוגנזה ברמת הרקמה והאורגניזם.

בודק את התפקידים של הכוחות הפיזיקליים במערכת מורפוגנזה עובריים מוקדם של הבחורה

גלה סרטונים נוספים