כימות היסטולוגית כדי לקבוע נטל פטרייתי ריאות ב Aspergillosis ניסיוני

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לכמת את העומס הפטרייתי הריאתי בעכברים עם אספרגילוזיס פולשני על ידי ניתוח היסטולוגי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפתוגנזה הפטרייתית לגבי מנגנוני תגובה מגנים ומזיקים למארח וגורמי אלימות פטרייתיים מרכזיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בדגימות היסטולוגיות קיימות כדי להשיג עומס פטרייתי עם תוצאות דומות ליישום PCR כמותי של DNA פטרייתי ריאות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אספרגילוזיס פולשני, ניתן ליישם אותה גם במחקרי מחלות אחרים שבהם פתוגנים יכולים להיות מוכתמים באופן דיפרנציאלי ברקמות המארח. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כשהתחלנו לחשוב על שיטות חלופיות לכימות עומס פטרייתי ריאתי עם פחות שונות מאשר שיטות כמותיות של DNA. מי שידגים את הליכי ההדבקה והקציר יהיה אנגר צוגרל, טכנאי מחקר.

24 שעות לפני ההדבקה, רוקנו את הנויטרופילים בכל עכבר ניסיוני בן שבעה עד 10 שבועות עם 0.5 מיליגרם של נוגדן נגד עכבר-Ly-6G בתמיסת מלח סטרילית המועברת תוך צפקית בזווית של 45 מעלות לרבע הימני התחתון הצדדי של כל בעל חיים והחזירו את העכברים לכלובים שלהם. למחרת בבוקר, שפכו 1.5 גרם של חרוזי זכוכית 0.5 מילימטר על צלחת תרבית A.fumigatus conidia והטו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה עד שהחרוזים מצופים בפטרייה. אוספים את תערובת החרוזים המצופה קונידיה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומשהו את החרוזים בחמישה מיליליטר DPBS.

מערבל את החרוזים כדי לנתק אותם מהפטרייה ולספור את הקונידיה בדילול פי 50 של סופרנטנט על המוציטומטר. לדלל את הקונידיה לאחת כפול 10 עד הקונידיה השמינית למיליליטר של ריכוז DPBS ולטעון 50 מיקרוליטר של תמיסת קונידיה לכל עכבר למיקרופיפטות בודדות. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, הניחו את העכבר המורדם הראשון על לוח משופע במצב שכיבה ורסן בעדינות את החותכות העליונות בעזרת גומייה ואת החותכות התחתונות בחוט מתכת.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים קטנים כדי להחזיק בזהירות את הלשון בהארכה מלאה ולהעביר 50 מיקרוליטר מתמיסת הקונידיה לבסיס הלשון. שמור על הלשון בהארכה מלאה, הקשב לנשימה מהירה ולרעש הנקישה המובהק של השאיפה למשך 20 שניות או עד לשאיבה מלאה של המתלים. לאחר מכן, החזירו בעדינות את העכבר לכלוב שלו עם ניטור עד לשכיבה מלאה והדביקו את החיה הבאה.

כאשר כל העכברים נדבקו, הזריקו לתת-קבוצה של בעלי החיים חומר אנטי פטרייתי וחזרו על דלדול הנויטרופילים בכל החיות 24 שעות לאחר ההדבקה. שלושה ימים לאחר מתן הפטרייה, הניחו את העכבר הראשון במצב שכיבה על לוח קצף מכוסה בכרית סופגת. ודא שהעכבר מורדם בצביטה בבוהן, וחטא את השיער עם 70% אתנול.

לאחר אבטחת הגפיים, השתמש במספריים כדי לפתוח בזהירות את חלל החזה העליון ולחתוך את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הריאות והלב. חתכו את הווריד הנבוב התחתון היורד מהלב, הקפידו להימנע מחיתוך כלי דם אחרים או ניקוב איברים כלשהם, והשתמשו במזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט בגודל 25 המוחזקת בזווית של 45 מעלות כדי להחדיר לאט חמישה מיליליטר של DPBS קרים לחדר הימני של הלב. לאחר זלוף עם חמישה מיליליטר של פורמלין 10% באותו אופן, יש לחשוף בזהירות את קנה הנשימה ולנתק את רפידות השומן שמסביב תוך הקפדה לא לנקב את קנה הנשימה.

הרם את קנה הנשימה החשוף בעזרת מלקחיים והשתמש במחט בגודל 25 כדי לתקוע חור בקנה הנשימה העליון. הכנס בזהירות צינורית דרך החור לכיוון הריאות וקשר חוט כירורגי באופן רופף סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצינורית. השתמש במזרק של מיליליטר אחד כדי לנפח את הריאות במיליליטר אחד של 10% מאגר פורמלין דרך הצינורית ובמהירות, אך בזהירות, הסר את הצינורית.

הדק את חוט הניתוח כדי לאטום את קנה הנשימה ומשוך בעדינות את החוט כדי לנתק את רקמת החיבור ולאפשר לקצור את הריאות וקנה הנשימה. הנח את הרקמות בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל 15 מיליליטר של מאגר פורמלין 10% עם קצה אחד של החוט מחוץ לצינור. לאחר מכן, אטמו את המכסה והפכו את הצינור כדי לטבול לחלוטין את הדגימה והקיבוע למשך 24 שעות לפחות.

כדי לדמות את הרקמה שנקטפה, פתח תחילה תוכנית כימות הדמיה מתאימה והשתמש במיקרוסקופ אור כדי להשיג לפחות ארבעה שדות נפרדים של כסף מתאנמין מותאם של גומורי, או שקופית מוכתמת GMS, תחת המטרה פי 10. ודא שהתמונות מייצגות את דרכי הנשימה הנגועות בתוך הריאה ושהם מציגים צפיפות רקמה דומה. כדי להוסיף פסי קנה מידה לתמונות, תחת תפריט עריכה, בחר הוספה/עריכה של סימני כיול ובחר את עובי הקו, הצבע וגודל סרגל קנה המידה.

לחץ על התמונה שבה יש למקם את סרגל קנה המידה, ולאחר מכן פתח את ערוך תפריט ובחר מיזוג ומיזוג סימני כיול כדי להוסיף סרגל קנה מידה לכל תמונה ולשמור את התמונות בתיקיות קבוצת הניסוי המתאימות. כדי לחשב את העומס הפטרייתי בכל בעל חיים, פתח תוכנית מתאימה לעיבוד תמונה ופתח את תיקיית התמונות הראשונה. בתפריט 'תמונה', בחרו 'אות' ו'אוסף RGB' כדי להמיר את התמונות.

בעזרת מקש החץ ימינה, בחר את השנייה מבין שלוש התמונות ולחץ על Control-Shift-T כדי לפתוח את מכוון הגדרות תפריט הסף. אתר את תמונת ה-tiff או ה-jpg המקורית כהפניה ופתח את התמונה עם תוכנית לצפייה בתמונות. בעת בחירת ערך הסף, חשוב להיות מסוגל להציג את התמונה המקורית כך שהאזור שנבחר ייצג את קורי הפטרייה ולהבטיח עקביות בין הדגימות.

הזז את המחוון העליון עד הסוף שמאלה והתאם את המחוון התחתון עד שהאזור האדום שנבחר מייצג את תמונת המיקרוסקופיה. לחץ על Set ו-OK, ובחר Analyze and Set Measurements (ניתוח והגדרת מדידות) הבודק אזור, שבר שטח, הגבל לסף, הצג תווית והשאיר את ההגדרות התחתונות כברירת מחדל. לחץ על OK ובחר Analyze and Measure.

התוצאות אמורות להופיע. לאחר מכן, ייצא את הנתונים לתוכנית ניתוח נתונים לצורך גרפים וניתוח סטטיסטי והזן את הממוצע של ארבעת אחוזי השטח או יותר עבור כל דגימת ריאה. כפי שמדגים גרף הישרדות מייצג זה, עכברים חסרי אאוזינופילים עם אספרגילוזיס פולשני שטופלו בחומר אנטי פטרייתי לאחר ההדבקה מציגים הישרדות מוגברת בהשוואה לחיות בר

צביעה מייצגת של GMS מעכברים נויטרופניים מסוג בר וחסרי אאוזינופילים עם אספרגילוזיס פולשנית חושפת פינוי פטרייתי כמעט מוחלט בעכברי נוקאאוט שטופלו באנטי פטריות שאינו הדדי בבעלי חיים מסוג בר עם או בלי טיפול אנטי פטרייתי. יתר על כן, PCR כמותי וכימות GMS במיקרוסקופ אור ידני כפי שהודגם זה עתה מאשרים שניהם כי טיפול בחומרים אנטי פטרייתיים מביא לירידה המשמעותית ביותר בעומס הפטרייתי בין עכברים מסוג בר לחסר אאוזינופילים. עם זאת, בעכברים שלא טופלו, רק כימות GMS קבע ירידה משמעותית בעכברים חסרי אאוזינופילים בניסוי זה.

כאשר האזורים הממוצעים של מקטעים מוכתמים ב-GMS של ריאות שלמות מחושבים בהגדלה של ארבעה X, ההבדלים דומים לתוצאות המתקבלות עם ארבעה שדות מייצגים של 10X אם כי עם פחות מובהקות סטטיסטית. תוצאות דומות של הישרדות, עומס פטרייתי ופינוי פטריות נצפות גם בעכברים עם מחסור בתאי T גמא-דלתא שטופלו באותו חומר אנטי פטרייתי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להישאר עקבי בעת צילום הקטעים ההיסטולוגיים ובעת התאמת ערך הסף כדי להשיג תוצאות דומות.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות הכוללות ניתוח היסטולוגי של דגימות בעלות הבדלים ברורים בין צביעת מטרה לרקע כדי לענות על שאלות נוספות הקשורות לפתולוגיה של מחלות בריאות וברקמות אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להדביק עכברים בקונידיה פטרייתית על ידי שאיפה לא רצונית וכיצד למדוד צמיחה פטרייתית בקטעי רקמת ריאה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. אל תשכח שעבודה עם Aspergillus fumigatus וכתם כסף מתאנמין שונה של Gomori עלולה להיות מסוכנת וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי ועבודה מתחת למכסה מנוע מאוורר היטב בעת ביצוע הליך זה.