Name: תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: חקור בניית מודל תלת-ממדי של חניכיים דלקתיים באמצעות תרבית משותפת של תאי אנושיים. שיטה זו מאפשרת חקר ריפוי פצעים, התחדשות רקמות וסינון תרופות למחלות מחניכיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך בחלקה של החברה יפן לקבלת מענק הסיוע קידום המדע (JSPS) למחקר מדעי (26861689 ו- 17 K 11813). המחברים רוצה להודות מר נתנאל גרין לצורך הגהה.

פרוטוקול זה תוכנן כדי ליצור רקמה אנושית חניכיים מקבילות, הפצע חניכיים דגמים ומודלים דלקת חניכיים. העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT) נמסרו באדיבותו של פרופסור נורברט אי Fusenig של Deutsches Krebsforschungszentrum (היידלברג, גרמניה)7. האדם חניכיים fibroblasts (HGFs) הם בודדו אותנו מהמתרחש רקמות חניכיים על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר8. הסכמה מדעת הושג מראש, ואת המחקר אושרה בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת האתיקה, ניפון שיניים אוניברסיטת בית הספר של החיים וברפואת שיניים טוקיו (מספר אישור: NDU-T2012-35). פרוטוקול שלבים 1-3 צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים.
1. הכנת רקמות אנושיות 3D במקבילות של חניכיים (GTE) (איור 1 א')
<ol><li>מיקס קולגן סוג ג'ל-A עם 10% מרוכזים MEM-אלפא ו- 10% שיקום מאגר (2.2 גרם של NaHCO3 ו- g 4.47 HEPES ב 100 מ ל 0.05 N NaOH) בצינור סטרילי 15 מ"ל על-ידי pipetting. לשמור על הפתרון קולגן מעורבים על הקרח, עד נעשה שימוש.</li>
	<li>מקום 24-ובכן תרבות מוסיף (נקבוביות בגודל 3.0 מיקרומטר) לתוך צלחת 24-. טוב.</li>
	<li>
הסר HGFs פני התרבות באמצעות פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. להשעות את התאים 10 מ"ל של תרבות בינוני A (MEM-אלפא + 20% FBS + 1% GlutaMAX). לספור את התאים על ידי מונה תא Bürker-טורק.
	<ol>
<li>לחלץ את הכמות הרצויה של תאים (1-5 x105 תאים/mL) ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x g.</li>
		<li>להשעות התאים הפתרון קולגן מעורבת. לשמור את התערובת על הקרח עד השלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ"ל של תערובת תא-קולגן (0.5-2.5 10x5 תאים/טוב) תותב תרבות מבלי לייצר בועות. דגירה את התערובת למשך 10-30 דקות באווירה humidified עם 5% CO2 -37 ° C עד מצב של קרישת חסר את התערובת לתוך ג'ל. הערה: להוסיף את התערובת קולגן לתוך המרכז של התותב תרבות, כדי למנוע היווצרות קולגן ג'ל שוויוני.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של המדיום תרבות לתוך הבאר ו 0.5 mL לתוך תותב. דגירה לצלחת תרבות עבור 24 שעות או למשך הלילה באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.</li>
	<li>להסיר HaCaT תאים מפני השטח תרבות באמצעות פתרון טריפסין-EDTA 0.25%. להשעות את התאים 10 מ"ל של מדיום B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) ולספור את התאים. תמצית הנידרשת של תאים (1 – 5 x5 10 תאים/מ ל) עם פיפטה, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x g... להשעות את התאים בינוני ב'.</li>
	<li>הסר את המדיום הכיסויים תרבות, אשר מכילים את התערובת דבורה שחר-קולגן, על ידי השאיפה. להוסיף 0.5 mL HaCaT תא השעיה (0.5-2.5 10x5 תאים/טוב) על התערובת דבורה שחר-קולגן. דגירה התרבויות עבור 24 שעות או לילה. הערה: בנקודת זמן זו, המדיום בתרבות טוב צריך להיות A בינוני, ואילו המדיום בעלון תרבות צריכה להיות בינוני B.</li>
	<li>להחליף את המדיום תרבות עם אופנוע בינוני (תרבות משותפת בינוני) (MEM-אלפא + 15% נוקאאוט סרום החלפת + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. להוסיף 1 מ"ל של המדיום תרבות לתוך התרבות טוב ו 0.5 mL לתוך תותב תרבות. דגירה התרבויות במשך 24-48 שעות.</li>
	<li>להחליף את המדיום תרבות עם אופנוע בינוני + 1% FBS. להוסיף 1 מ"ל לתוך התרבות טוב ו 0.5 mL לתוך תותב תרבות. דגירה התרבויות עבור 24 שעות או לילה.</li>
	<li>להחליף את המדיום תרבות בתרבות היטב עם 0.7-1 מ ל אופנוע בינוני. הסר את המדיום לחלוטין תותב תרבות (פני תרבות צריך להיחשף אוויר). תקופת דגירה התרבויות של 1-2 שבועות. לשנות את המדיום בתרבות טוב פעמיים בשבוע. הערה: אל תתנו את עליית רמת בינוני מעל פני השטח תרבות (השכבה העליונה מורכבת keratinocytes). תמיד לשמור על פני תרבות יבש.</li>
</ol>2. הכנת GTE פצועים (איור 1B)
<ol><li>להכין כבטלן הרקמה 1 – 3 מ מ קוטר. לעקר את זה עם החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
	<li>לדחוף את ניקוב רקמות בניצב לתוך GTE בקשר עמוק 300 מיקרומטר, חור בתוך הרקמה כדי לדמות פצע.</li>
	<li>בשלב זה, השתמש את הפצועים GTE עבור חוקרים התחדשות וריפוי רקמת הפצע. לחלופין, לתקן GTE באמצעות 10% פורמלין נייטרלי בופר לביצוע ניתוח היסטולוגית.</li>
</ol>3. הכנת GTE דלקתיים (iGTE) (איור 1B)
<ol><li>לטפח THP-1 תאים על פי הדוח הקודם9.</li>
	<li>מיקס קולגן סוג ג'ל-A עם 10% מרוכזים RPMI 1640, 10% שיקום מאגר (2.2 גרם של NaHCO3 ו- g 4.47 HEPES ב 100 מ ל 0.05 N NaOH) ו- 10 ננוגרם למ"ל ובחום. לשמור הפתרון קולגן מעורבים על הקרח עד השימוש.</li>
	<li>ספירה 1 – 2 x 10 תאים6 THP-1, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב 190 x ג להשעות תאי 1 מ"ל של הפתרון קולגן מעורב. לשמור את התערובת על הקרח עד השלב הבא.</li>
	<li>להוסיף 10-30 µL THP-1-קולגן התערובת לתוך האזור הפצוע של GTE. להחליף את המדיום תרבות 0.7-1 מ ל אופנוע בינוני המכיל 10 ננוגרם למ"ל של ובחום.</li>
	<li>דגירה התערובת באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 h.</li>
	<li>להשתמש במודל על חקירת דלקת חניכיים או מחלת חניכיים (לדוגמה, להוסיף תרופות אנטי דלקתיות פוטנציאליים iGTE כדי לראות את השפעותיה על שחרור ציטוקינים10). לחלופין, השמט 72 h PMA-טיפול, להוסיף 2 µg/mL של LPS לתוך התרבות, דגירה הרקמה באווירה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות11,12.</li>
</ol>4. קיבוע ואת כל Immunostaining הר GTE ו iGTE תרבויות
<ol><li>
קיבוע של התרבויות.
	<ol>
<li>הסר את המדיום תרבות הצלחת 24-. טוב. לשטוף את רקמות 2 פעמים עם פוספט buffered סליין (הציבורי).</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של 10% פורמלין נייטרלי בופר את הכנס, 1 מ"ל התרבות היטב. השאירו את הצלחת 24-ובכן מקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>הסר את 10% פורמלין נייטרלי בופר ביום המחרת.</li>
		<li>עבור כל הר immunostaining, לשטוף את רקמות 3 - 4 פעמים עם PBS לאחר קיבוע.</li>
		<li>עבור hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת ואת immunostaining רגיל, להמשיך עם התייבשות, פרפין הטבעה ואת חלוקתה. הערה: עבור כל הר immunostaining, שלב זה יכול להיות מושמט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כל הר immunostaining הערה: פרוטוקול זה שונה מזו בהפניה 13.<ol>
<li>לשטוף את הרקמות 3 x ב- PBS 0.5-1%, טריטון, 10-30 דקות בכל פעם.</li>
		<li>דגירה הרקמות פעמיים במשך 30 דקות במאגר חסימה (PBS 1% טריטון + 10% BSA), בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את רקמות 2 × במאגר חסימה, 5 – 10 דקות בכל פעם.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של נוגדן ראשוני פתרון-נדרש הדילול/הריכוז התוספות. השתמש סרט דק פלסטיק תיאחז לעטוף את הכיסויים כדי למנוע ייבוש הרקמה.</li>
		<li>תקופת דגירה הרקמה של 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף את הרקמות 3 פעמים, במשך 30 דקות ב- PBS 1% טריטון + 10% BSA. לשטוף שוב שלוש פעמים, במשך 5 דקות ב- PBS 1% טריטון.</li>
		<li>להוסיף 50 µL של נוגדנים משניים במאגר חסימה (PBS 1% טריטון + 10% BSA) ו µL 5 בפתרון Hoechst 33342 (הכתם תא חי NucBlue) כל הכנס. השתמש סרט דק פלסטיק תיאחז לעטוף את הכיסויים כדי למנוע ייבוש הרקמה.</li>
		<li>תקופת דגירה של 1-2 ימים ב- 4 מעלות צלזיוס. לעטוף את הצלחת 24-ובכן במגבת נייר רטוב, אז את זה לתוך ערכת פלסטיק כדי לשמש במהלך הדגירה.</li>
		<li>לשטוף את הרקמות 3 פעמים, במשך 10 דקות ב- PBS 1% טריטון</li>
		<li>השימוש מחט חדה לחתוך את הקרום של התותב תרבות, כדי להשיג את הרקמה. מקם את הקרום לשקופית. הערה: הרקמה צריך להיות על הקרום.</li>
		<li>להוסיף 2-3 טיפות של קרינה פלואורסצנטית הר בינוני. מכסים את הרקמה עם כיסוי זכוכית, חנות ב 4 ° C בחושך עד הניתוח.</li>
		<li>הצג את רקמות עם לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (LSM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2017).</li>
<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

פרוטוקול זה מבוסס על שיטות ליצירת רקמת חניכיים מקבילות ושווי רקמת שומן תת עורית מתוארת על ידי הקודם דוחות8,21,22. למרות זאת הוא שיטה פשוטה וקלה, כמה צעדים דורשים תשומת לב מיוחדת. לדוגמה, התערובת קולגן יש לשמור בקירור עד השימוש כדי למנוע היווצרות ג'ל בפתרון. בעת הוספת את התערובת קולגן לתוך תותב תרבות, ודא כי הפתרון הוזרק במרכז של התותב, כדי למנוע יצירת ג'ל מוטה (כמו איור 3B). גם לפריצת חור GTE לוקח מ...

מחלות חניכיים הן הגורם המוביל לאובדן שיניים בקרב מבוגרים. דלקת חניכיים חניכיים מחלות חניכיים הנפוץ ביותר בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. שניהם מציגים בתיווך biofilm אקוטי או כרוני שינויים דלקתיים חניכיים. דלקת חניכיים מאופיין על ידי דלקת חריפה, ואילו חניכיים בדרך כלל מציג כמו דלקת כרונית. ברובד היסטולוגית, רכיבים חיידקי להפעיל את ההפעלה של תאים חיסוניים, כגון מקרופאגים, לימפוציטים, תאי פלזמה ותאים תורן1,2. אלו תאים חיסוניים, במיוחד מקרופאגים, אינטראקציה עם תאים מקומיים (כולל תאים אפיתל חניכיים, fibroblasts, תאי אנדותל, תאי העצם) וכתוצאה מכך נגעים דלקתיים רקמת חניכיים3,4. גרסאות ניסיוניות של מחלות חניכיים הוקמו בסוגים שונים של בעלי חיים, כגון חולדות, אוגרים, ארנבות, חמוסים, הולכי על ארבע, פרימטים. עם זאת, physiopathology של מודלים בעלי חיים שונה של בני האדם, ולכן קשה לנתח מנגנונים תאית ומולקולרית ולהעריך תרופות חדשות של מחלות חניכיים5. טיפוח ושיתוף של חיידקים חניכיים, תאים אפיתל אוראלי אנוש טפט שימש לחקור את המנגנון של דלקות חניכיים6. ובכל זאת, טפט תרביות של תאים דרך הפה חסר תלת מימדי (3D) הסלולר הארכיטקטורה של רקמות שלם; לכן, הם לא יכול לחקות את המצב במבחנה .
כאן, 3D רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים (iGTE) הוקם כדי לייצג מחלות חניכיים במבחנה. זה דגם התלת-ממד של מחלות חניכיים נמצא במיקום ביניים בין תרביות תאים חד שכבתי חייתיים. שלושה סוגים של תאים אנושיים, כולל HaCaT keratinocytes, חניכיים fibroblasts THP-1 מקרופאגים, הן מעובדות במשותף על ג'ל קולגן, מגורה על ידי מאתחלי דלקתיות לבנות iGTE. IGTE מקרוב מדמה את התנאים ויוו של תאית התמיינות תאים תאים אינטראקציה, הפעלת מקרופאג בחניכיים. מודל זה יש לא מעט אפליקציות אפשריות סמים הקרנת ובדיקות גישות חדשות תרופתי במחלות חניכיים, כמו גם עבור ניתוח מנגנונים תאית ומולקולרית ריפוי הפצע, דלקת ו התחדשות רקמות.

<table><tbody><tr><td>קולגן מסוג I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>להכנת דרמיס של GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>מדיום תרבית</td></tr><tr><td>תאים הכנס תרבית תאים (לצלחת 24 בארות), גודל נקבוביות 3.0 &mu; מ</td><td>קורנינג, בע"מ</td><td>353096</td><td>לתרבית רקמות</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>תרמו פישר</td><td>35050061</td><td>מגיב תרבית תאים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>31600034</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>מדיום החלפת סרום</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>10828028</td><td>מגיב תרבית תאים</td></tr><tr><td>אגרוף רקמות</td><td>Shibata מערכת שירות ושות', בע"מ</td><td>SP-703</td><td>עבור ניקוב חורים ב- GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (כתם תאים חיים NucBlue)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>לתיוג גרעינים</td></tr><tr><td>פלואורסצנטי הר בינוני</td><td>Dako</td><td></td><td>להרכבת דגימות לאחר צביעה</td></tr> <tr><td>חיסוניתנוגדן אנטי-ציטוקרטין 8+18 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>לזיהוי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת</td> אפיתל <td>היטאצ'י, בע"מ.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>לתצפית על טופוגרפיית פני השטח וההרכב של דגימות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>LSM 700; קרל זייס מיקרוסקופיה ושות', בע"מ</td><td>LSM 700</td><td>להתבוננות בצביעה אימונופלואורסצנטית של דגימות</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 נוגדן</td><td></td><td>abcam ab52625</td><td>לזיהוי נוגדן</td></tr><tr><td>אפיתל אנטי-וימנטין</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>לזיהוי פיברובלסטים ומקרופאגים מופעלים</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>לזיהוי פיברובלסטים בדרמיס</td></tr><tr><td>Anti-CD68 נוגדן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>לזיהוי מקרופאגים</td></tr><tr><td>Human CD14 נוגדנים</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>לזיהוי מקרופאגים</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-מצומד עז משני נגד ארנב נוגדן Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-מצומד עז משני נגד עכבר נוגדן Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>EVOS FL מערכת הדמיית תאים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>לצפייה בצביעת האימונופלואורסצנציה של הדגימה</td></tr><tr><td>תאי THP-1</td><td>Riken בנק תאי BRC</td><td>RCB1189</td><td>להכנת iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>לבידול תאי THP-1</td></tr></tbody></table>

תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

מחלות חניכיים (כגון דלקת חניכיים חניכיים) הם הגורמים המובילים ואובדן שיניים אצל מבוגרים. דלקת חניכיים היא physiopathology היסוד של מחלות חניכיים. הנוכחי ניסיוניות של מחלות חניכיים הוקמו בסוגים שונים של בעלי חיים. עם זאת, physiopathology של מודלים בעלי חיים שונה של בני האדם, ולכן קשה לנתח מנגנונים תאית ומולקולרית ולהעריך תרופות חדשות למחלות חניכיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשחזור רקמה דלקתית אנושית במקבילות של חניכיים (iGTE) במבחנה. ראשית, אנו בונים רקמה אנושית במקבילות של חניכיים (GTE) על ידי ניצול שני סוגים של תאים אנושיים, כולל האדם חניכיים fibroblasts (דבורה שחר) העור האנושי keratinocytes עוריות (HaCaT), בתנאים תלת מימדי. אנו יוצרים מודל הפצע באמצעות כבטלן רקמות לחורר ב GTE. ומונוציטים THP-1 הבא, אנושי מעורבב עם ג'ל קולגן מוזרקים לתוך החור GTE. על ידי adimistration של 10 ננוגרם למ"ל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA) עבור 72 h, הבדיל THP-1 תאים לתוך מקרופאגים אל טופס מוקדים דלקתיים ב GTE (iGTE) (IGTE גם יכול להיות stumilated עם µg/mL 2 של lipopolysaccharides (LPS) במשך 48 שעות ליזום דלקת ). IGTE הוא במבחנה המודל הראשון של דלקת חניכיים באמצעות תאים אנושיים עם ארכיטקטורה תלת מימדי. IGTE משקפת שינויים פתולוגיים משמעותיים (immunocytes activition, תאיים אינטראקציות בין fibryoblasts, תאי אפיתל, ומונוציטים ו מקרופאגים) במחלות חניכיים. GTE GTE פצועים, iGTE יכול לשמש כלי רב-תכליתי ללמוד ריפוי הפצע, התחדשות רקמות, דלקת, תא-תא אינטראקציה, וכן תרופות פוטנציאליות מסך למחלות חניכיים.

HaCaT התאים מוצג מורפולוגיה תקין טיפוסי בהסתכלות מיקרוסקופית שלב-ניגודיות (איור 2 א). סורק אלקטרון מיקרוסקופיות (SEM) תמונות הראה כי HaCaT תא משטחים כוסו על ידי רבים microvilli. חיבורי המערכת בין תאים HaCaT היו מתווכת על-ידי תהליכים קרום (איור 2B). תאים HaCaT הביע אפיתל חניכיים סמן K8/1814, המציין כי HaCaT תאים מתאימים עבור שחזור חניכיים (איור 2C).
<p class="jove_content" ...

המטרה של הפרוטוקול היא לבנות מודל של דלקת חניכיים אנושי בתוך חוץ גופית. מודל זה רקמות מטפחת שיתוף שלושה סוגים של תאים אנושיים, HaCaT keratinocytes, fibroblasts חניכיים ו מקרופאגים THP-1, בתנאים תלת מימדי. מודל זה ניתן להחיל כדי לחקור מחלות חניכיים, כגון דלקת חניכיים, חניכיים.

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לשחזר מודל תלת מימדי של רקמת חניכיים דלקתית על ידי שימוש בשלושה סוגים של תאים אנושיים במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע בחקר ריפוי פצעים, התחדשות רקמות, דלקת ובדיקת תרופות פוטנציאליות למחלות חניכיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו השיטה הראשונה לבניית מודל חוץ גופי של חניכיים דלקתיות באמצעות תאים אנושיים בעלי ארכיטקטורה תלת מימדית.בשפופרת סטרילית של 15 מיליליטר, הוסף קולגן מסוג I-A, 10% MEM-alpha מרוכז ו-10% מאגר שחזור. לאחר מכן, השאירו את תערובת הקולגן על קרח עד לשימוש הבא. לאחר מכן, מקם את תוספות התרבות של 24 בארות בגודל נקבוביות של שלושה מיקרומטר בצלחת תרבית של 24 בארות.לאחר מכן, השתמש בתמיסת 25% טריפסין-EDTA כדי לנתק את ה-HGFs מבקבוק התרבית. לאחר מכן, השעו את התאים המנותקים ב -10 מיליליטר של מדיום תרבית. לאחר מכן, ספרו את מספר התאים באמצעות מונה תאים של בורקר-טורק.לאחר בידוד מספר התא הרצוי, יש לצנטריפוגה את התאים ב -190 פעמים גרם למשך ארבע דקות. לאחר מכן, השעו את כדור התא עם תמיסת הקולגן, והשאירו את הצינור על קרח. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר תערובת קולגן תאים לתוך התוספת לתרבית מבלי לייצר בועות אוויר.לאחר מכן, דגרו את תוספת התרבית עם תערובת התא-קולגן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 30 דקות. לאחר הדגירה מוסיפים מיליליטר אחד ממדיום התרבות לבאר ו -5 מיליליטר מהמדיום לתוך התוספת. לאחר מכן, דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יום.לאחר מכן, השתמש ב-25% מתמיסת טריפסין-EDTA כדי לנתק את תאי ה-HaCaT מלוח התרבית. לאחר ניתוק התאים, הוסף 10 מיליליטר של B בינוני לתאים. לאחר מכן, ספור את מספר התא.לאחר בידוד מספר התא הרצוי, יש לצנטריפוגה את התאים ב -190 פעמים גרם למשך ארבע דקות. לאחר הצנטריפוגה, ממיסים את כדור התא במדיום B.לאחר מכן, שאפו את המדיום מתוספת התרבית. לאחר מכן, הוסיפו 5 מיליליטר של תרחיף תאי HaCaT מעל תערובת הקולגן HGF.השאירו את הכנס התרבות בחממה למשך יום. למחרת, החלף את מדיום התרבות. הוסף מיליליטר אחד של מדיום KSR בתוספת סרום בקר עוברי 5% לבאר התרבית ו-5 מיליליטר בתוספת התרבית.לאחר מכן, דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. למחרת, החלף את מדיום התרבית במדיום KSR של תרבית משותפת בתוספת סרום בקר עוברי 1%. הסר את כל מדיום התרבות הן מתוספת התרבות והן מהתרבות היטב לאחר 24 שעות.לאחר מכן, הוסיפו 7 עד מיליליטר טרי של מדיום KSR בתרבית בלבד, והמשיכו בתרבות במשך שבועיים. זכור לשנות את המדיום בתרבות פעמיים בשבוע. הכינו מנקב רקמות בקוטר של מילימטר עד שלושה מילימטרים, ועקרו את האגרוף בחיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.לאחר העיקור, דחפו את מנקב הרקמות בניצב לתוך GTE לעומק של כ-30 מיקרומטר כדי ליצור פצע ברקמה. לאחר מכן, ערבבו 10 ננוגרם למיליליטר PMA, מאגר שחזור של 10% ומדיום RPMI מרוכז של 10% עם ג'ל קולגן מסוג I-A. לאחר מכן, השאירו את תערובת הקולגן על קרח עד לשימוש הבא.לאחר מכן, צנטריפוגה של תאי THP-1 ב-190 פעמים גרם למשך ארבע דקות. לאחר הצנטריפוגה, השעו את כדור התא במיליליטר אחד של תמיסת קולגן והשאירו על קרח. לאחר מכן, הוסיפו 10 עד 30 מיקרוליטרים של תערובת תאים-קולגן THP-1 לאזור הפצוע של ה-GTE.לאחר מכן, החלף את מדיום התרבות במדיום KSR של 7 עד מיליליטר המכיל 10 ננוגרם למיליליטר PMA. לאחר מכן, דגרו את התערובת ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 72 שעות. כדי לאפיין את ה-GTE המשוחזר, נעשים צביעת H ו-E וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.התמונות מראות את GTE מציג מבנה רקמה דמוי חניכיים עם שכבות מרובות של אפיתל ולמינה פרופריה. התמונות מראות גם שתאי HGF ב-GTEs המשוחזרים מציגים מאפיינים מורפולוגיים מובהקים של פיברובלסטים המוקפים בסיבי קולגן. לאחר מכן, צביעה אימונופלואורסצנטית נעשית כדי לחקור את הביטוי של סמני עור ואפיתל.זאת כדי לאמת אם ל-GTE ו-iGTE יש את המאפיינים המולקולריים של חניכיים אנושיות דלקתיות אמיתיות. התמונות מראות כי וימנטין ו-TE-7 נוכחים חזק בלמינה פרופריה של GTE. K19, סמן ספציפי לאפיתל צומת בדלקת חניכיים, אם כי מתבטא חלש באפיתל GTE, חזק מספיק באפיתל iGTE.לבסוף, על מנת ליצור את המוקדים הדלקתיים ב-iGTE, מוזרקים מונוציטים THP-1 שטופלו ב-PMA באזור הפצוע של הרקמה. 72 שעות לאחר הטיפול ב-PMA, תאי THP-1 מתמיינים לתאים דמויי מקרופאגים. צביעה חיסונית שלמה אישרה כי תאים אלה מבטאים שני סמני מקרופאגים חשובים, CD14 ווימנטין, ויצרו את מוקדי הדלקת.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה עד ארבעה שבועות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מזיהום. בעקבות ההליך הזה, שיטות אחרות, כמו שימוש ב-LPS כדי לעורר תגובות דלקתיות, יכולות להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות, כמו איך לגרום לדלקת דרך אינטראקציות מארח-ביופילם.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הדלקת, התחדשות רקמות וריפוי פצעים לחקור את המנגנון התאי והמולקולרי ולסנן תרופות פוטנציאליות למחלות חניכיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות מודל רקמת חניכיים דלקתית תלת מימדית במבחנה.

three-dimensional-inflammatory-human-tissue-equivalents-of-gingiva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.

בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine

שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.

הנדסת רקמות של 3D אדם<em&gt; במבחנה</emמערכת מבחן גידול&gt;

המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות עור תלת מימדי בעובי מלא, הדומה לעור טבעי. עם מכשיר פציעה אוטומטי שנבנה במיוחד, ניתן ליצור פצעים מדויקים וניתנים לשחזור תחת שמירה על סטריליות.

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.

ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D

הקמנו טכניקה הבידוד, אפיון פנוטיפי ופונקציונלי ניתוח של תאים חיסוניים מן החניכיים בעכברים.

בידוד, אפיון בחינה פונקציונלית של הרשת הסלולרית חניכיימיים החיסון

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

מחקר זה מציג את פרוטוקול למדידת microcirculation ב האוראלית האנושית על ידי לייזר חודרני לעומת זאת הדמיה. פיקוח על פצע ריפוי לאחר vestibuloplasty בשילוב עם השתלה קולגן xenogenic מוצג על מקרה קליני.

הגישה של הרומן ניטור שתל כורוידאלית ב Gingiva אנושי

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום של מודלים של רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה. באופן ספציפי, מערכת המודל המתוארת משתמשת באפיתל אוראלי רב שכבתי החשוף למיקרואורגניזמים הקשורים לביופילמים (רובד שיניים) בהקשר של בריאות הפה לעומת מחלות.

מערכות מודל רקמות אורגנוטיפיות לחקירת אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה

חקור בניית מודל תלת-ממדי של חניכיים דלקתיים באמצעות תרבית משותפת של תאי אנושיים. שיטה זו מאפשרת חקר ריפוי פצעים, התחדשות רקמות וסינון תרופות למחלות מחניכיים.

תלת מימדי רקמה אנושית דלקתיות במקבילות של חניכיים

גלה סרטונים נוספים