בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

אנו מציגים פרוטוקול לחקור את סמנים ביולוגיים של mRNA ביטוי של קרום העצם, נגזר תאים (שיתפקדו) הנגרמת על ידי ויטמין C (ויטמין C), 1,25-dihydroxy ויטמין D [1,25-(OH)₂D₃]. בנוסף, נוכל להעריך את היכולת של בקר קבוצת מחשבים ראשי להבדיל לתוך osteocytes, chondrocytes ו- adipocytes.

המטרה הכוללת של מחקר זה היא לחקור את ההשפעות האוסטיאואינדוקטיביות של ויטמין D על תאי גזע מזנכימליים מתורבתים שנקטפו מפריאוסטאום המכתשית הדנטלית. השימוש בתאי גזע מזנכימליים הוא התקדמות גדולה ברפואת השיניים בעשור האחרון. הם בודדו בהצלחה ותרבו מחלקים רבים של רקמת השיניים.

עם זאת, המטרה היא לבודד ולתרבית תאי גזע מזנכימליים מפריאוסטאום המכתשית ולחקור את הפוטנציאל האוסטיאואינדוקטיבי של תרכובת ויטמין D. באופן כללי, אנשים חדשים בעניין זה יתקשו בגלל הרעיון החדש של היווצרות עצם בתאי גזע מזנכימליים שמקורם בפריאוסטאום המכתשית. צוות המעבדה מדגים את ההליך תהיה מיס שין-וון צ'י.היא

עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, קצרו את הרקמות הפריאוסטאליות מהמטופלים במהלך ניתוחי שיניים באמצעות מפריד פריוסטאלי. אוספים פרוסות שגודלן כשניים על חמישה מילימטרים.

אחסן את פרוסות הרקמה ב-DPBS עם אנטיביוטיקה. במעבדה, השתמש באזמל כדי לטחון היטב את שברי הרקמה הפריאוסטאלית המכתשית תוך 24 שעות מרגע הקציר. לאחר מכן, תרבית את הרקמה על צלחות פטרי בגודל 35 מילימטר במדיום התרבות המתאים.

השתמש באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס עם גז פחמן דו חמצני 5%. שלושה ימים לאחר מכן, השליכו את הרקמות הפריאוסטאליות שנאספו והחליפו את המדיום. כאשר התאים התרבו לכ-80% מפגש, נתק את התאים המתורבתים על ידי הוספת טריפסין.

ודגירה על התרבות במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 0.8 מיליליטר בינוני כדי לסיים את הניתוק. לאחר איסוף וספירה, מחלקים 5,000 תאים במיליליטר אחד לצלחת.

סמן את התאים המצופים כמעבר אחד בשלב זה. תרבית תאים אלה והפרד אותם שוב לאחר שהם התרבו למפגש של 80%. המדיום עם המעבר הראשון הוא בתחילה בצבע כתום/אדום.

כאשר המדיום מתחיל להפוך לכתום שלושה ימים לאחר מכן, שנה אותו. כאשר המעבר תא אחד מגיע למפגש של 80%, צור את תאי הדור השני עד החמישי על ידי חזרה על אותם הליכים המשמשים להכנת דור האפס לדור הראשון. החלף את המדיום פעמיים בשבוע.

ארבעה שבועות לאחר מכן, העריכו את הפוטנציאל של התאים להתמיין לשושלת אוסטאוגנית על ידי התבוננות במורפולוגיה של התאים במיקרוסקופ. גזור את התאים באמצעות בדיקת פון קוסה. בדיקה זו מבדילה את נוכחותם של משקעים מסויידים בתרבות שלך.

שוטפים את התאים עם PBS ומקבעים אותם למשך 30 דקות במיליליטר אחד של 10% פורמלין. לאחר מכן, הסר את הפורמלין ולאחר מכן שטוף את התאים וטפל בהם ב-5% כסף חנקתי. חשוף את התאים לאור UV למשך שעה.

לאחר מכן, הסר את חנקת הכסף וטפל בתאים בשני מיליליטר של 5% נתרן גופרתי ארבע פעמים במשך שלוש דקות בכל פעם. החלף את התמיסה בין הטיפולים. לבסוף, שטפו את התאים פעמיים באמצעות מים מזוקקים.

20 מתוך 34 דגימות רקמה פריוסטאלית הניבו בהצלחה מושבות תאי גזע שמקורן במח עצם. לא נמצאו גורמים ביחס לתורמים המשפיעים באופן מובהק על הצלחת הגידול. בתחילה, PDCs יצרו מושבות ואשכולות כדוריים עם תערובת של תאים עגולים וצורת ציר.

לאחר המעבר הראשון, התאים היו דמויי פיברובלסטים הומוגניים עם צורת ציר. בתום ההתמיינות האוסטיאוגנית, בדיקת פון קוסה הצביעה על נוכחות אפשרית של מרבצי סידן והתמיינות אוסטאוגנית. תוצאות אלו מצביעות בבירור על כך שבקרב אוכלוסיות תאים פריוסטאליים, לתאי אב יש פוטנציאל להתמיין לתאים אוסטאוגניים.

תאי המבשר האוסטיאוגניים טופלו גם בקלציטריול ונבדקו באמצעות RTPCR כדי להעריך את רמת הביטוי של פוספטאז אלקליין המהווה אינדיקטור חזק להתמיינות אוסטאוגנית מוקדמת של תאים. גם הטיפול בוויטמין C וגם בקלציטריול, מטבוליט פעיל של ויטמין D, הגביר את ביטוי הפוספטאז האלקליין. כמו כן, ביטוי רמות ה-mRNA של קולגן אחד עלה בתגובה לאותם טיפולים.

נמצא כי הביטוי של mRNA סיאלופרוטאין בעצם גדל עבור התאים שטופלו בריכוז גבוה יותר של קלציטריול. עם זאת, CBFA one, וביטוי mRNA של אוסטוקלציום לא הגיבו לטיפולים. לאחר צפייה בסרטון זה, הקהל אמור להבין היטב את פרוטוקול המינרליזציה והתרבות של פריאוסטאום המכתשית האנושית.

לאחר שליטה, ניתן לבצע את המרדף הזה תוך ארבעה עד חמישה שבועות אם הוא מבוצע כראוי. כאשר מנסים ניסוי זה, חשוב להשתמש בטכניקה זהירה וסטרילית כדי למנוע זיהום של התא.