גודל ענייני: מדידה של הקפסולה בקוטר של neoformans קריפטוקוקוס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצבוע את קפסולת הפוליסכריד של זני C.neoformans לצורך הדמיה ומדידה של קוטר הקפסולה. שיטות אלו יכולות לסייע לחוקרים באינדוקציה, הדמיה ומדידה של גודל הקפסולה ב-Cryptococcus neoformans. היתרון העיקרי של טכניקות הצביעה וההדמיה הוא שהן פשוטות, מהירות ומאפשרות מדידה מדויקת של קוטר הקפסולה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי התוכנה עשויים לבלבל בפעם הראשונה שמשתמשים בה. קוטר הקפסולה של Cryptococcus neoformans משמש לעתים קרובות כמדד לאלימות. היכולת להפוך תהליך זה לאוטומטי יכולה לחסוך זמן ניתוח משמעותי.

כדי לעודד ייצור כמוסות, יש לדגור תחילה על מושבת C.neoformans במרק דקסטרוז פפטון שמרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 18-36 שעות עד שהתרבית נמצאת בשלב היומן. בתום התרבית, גלו את השמרים על ידי צנטריפוגה ושטפו את השמרים שלוש פעמים ב- PBS. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את השמרים פעמיים 10 עד התאים החמישיים לכל שני מיליליטר של ריכוז DMEM ודגרו על התרבית ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 18 שעות.

למחרת, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והוציאו את כל 10 המיקרוליטרים האחרונים של הסופרנטנט. כדי להכתים את השמרים בדיו הודי, השעו מחדש את הגלולה בסופרנטנט שנותר והעבירו ארבעה מיקרוליטרים של תרחיף התא וארבעה מיקרוליטרים של דיו הודי לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מערבבים בעדינות את התמיסה המתקבלת מבלי ליצור בועות.

לאחר מכן הניחו כיסוי זכוכית מספר 1.5 בעובי 13 מילימטר מעל דגימת התא ואטמו את הקצוות בחומר איטום לא רעיל. כדי להכתים את השמרים בצבע פלואורסצנטי, יש להשעות מחדש את גלולת תרבית הלילה ב-50 מיקרוליטר PBS בתוספת סרום בקר של 1% ולדגור את התאים ב-55-60 מיקרוליטר של נוגדן חד-שבטי 18B7 מצומד של calcofluor-white ו-Alexa Fluor 488 למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש את הגלולה ב -10 מיקרוליטר PBS בתוספת אלבומין סרום בקר.

לאחר מכן העבירו שמונה מיקרוליטרים של תאים לשקופית מיקרוסקופ זכוכית, כסו את דגימת התא בכיסוי זכוכית מספר 1.5 בעובי 13 מילימטר ואטמו את הקצוות בחומר איטום לא רעיל. כדי להכתים את השמרים בשני הצבעים, דגרו תחילה על התאים בעזרת קפסולה פלואורסצנטית וכתם דופן התא כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיקרוליטרים של תאים מוכתמים פלואורסצנטיים וארבעה מיקרוליטרים של דיו הודי על שקופית זכוכית והניחו כיסוי אטום מעל דגימת התא הפטרייתי כפי שהודגם.

כדי לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופ אור, בחר את המטרה 100X ודמיין לפחות 50 תאים לא חופפים לכל מצב עם זמני חשיפה ממוטבים כדי למקסם את ניגודיות התמונה תוך מזעור הטשטוש הנגרם מתנועות תאים קטנים. כדי לדמות את התאים במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, פתח את תוכנת הדמיית המיקרוסקופ ובחר את אורכי גל העירור והפליטה המתאימים לפלואורופורים המשמשים. בלוח הבקרה של אוסף Z, בחר באפשרות האחרונה הראשונה.

באמצעות בקרת המיקוד העדינה במיקרוסקופ, התמקד תחילה מתחת לנקודה הרחבה ביותר של גוף התא של תא שמרים בודד והקפסולות עבור כל התאים בשדה הראייה הנוכחי ולחץ על הגדר תחילה. לאחר מכן, השתמש בפקד המיקוד העדין כדי להתמקד מעל הנקודה הרחבה ביותר של גוף התא של אותו תא ושל הקפסולה עבור כל התאים בשדה הראייה הנוכחי ולחץ על הגדר אחרון. לאחר מכן פתח את לשונית הרכישה ולחץ על התחל ניסוי כדי לרכוש את מחסנית Z עבור המיקום הנוכחי.

כדי למדוד ידנית את קוטר הקפסולה והתא, פתח תוכנית מדידת תאים מתאימה ובחר את התמונה למדידה. בחר מדידה והשתמש בסמן כדי לצייר קו ישר דרך הנקודה הרחבה ביותר של התא כולו כדי למדוד את קוטר התא הכולל. לחץ שוב על מדידה וצייר קו ישר דרך גוף התא כדי למדוד את קוטר גוף התא ולפתוח את התא הבא.

לאחר שכל התאים נמדדו, שמור את התמונות. למדידה אוטומטית של קוטר הקפסולה והתא, פתח תחילה תוכנית מתאימה לעריכת תמונות והפוך את כל תמונות התאים המוכתמים בדיו בהודו. לאחר מכן, כדי לייבא הן את התמונות המקוריות והן את התמונות ההפוכות לתוכנת מדידת התאים, פתח את file תפריט בתוכנית המדידה ובחר ייבוא רצף, טען תמונה, הגדר רצף באופן ידני, ערוץ מידות, ייבוא והחלה.

כדי לזהות ולהסוות את גוף התא, בחר בפרוטוקול הקרינה של מנתח המושבה עבור התמונה ההפוכה הראשונה המעניינת ולחץ על החל. בחר שוב את פרוטוקול הקרינה של מנתח המושבה כדי לפלח את תמונות הגוף של תאי C.neoformans הפוכים מהקפסולות שלהם ולחץ שוב כדי ליצור מסכת ספירה. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות את שם גוף התא של מסכת הספירה והשתמש בפרוטוקול התפשטות התאים בתמונה המקורית כדי לזהות ולהסוות את הקפסולה.

לחץ על Apply כדי ליצור מסיכת ספירה לתמונה המקורית ולשנות את שם קפסולת מסיכת הספירה. כדי ליצור מסכה חדשה מעל התמונה המקורית כדי להפריד את הקפסולות הסמוכות זו מזו, בחר מחיצת קפסולה וקפסולה לאזור הקפסולה. כדי לייצא את הנתונים, לחץ על גיליון אלקטרוני ולאחר מכן לחץ על סמל הייצוא לגיליון אלקטרוני.

בחר את המידות שברצונך לייצא ולאחר מכן שמור לבסוף את הנתונים. עלייה בגודל הקפסולה ניכרת ברוב הזנים לאחר האינדוקציה, אם כי חלק מהזנים מציגים כמוסות קטנות באופן טבעי. בניסוי מייצג זה, נצפה באופן עקבי הבדל משמעותי בגודל הקפסולה בין הזן הגדול ביותר לשני הזנים הקטנים יותר.

ניתן לזהות הבדלים בגודל הקפסולה גם באמצעות צבעי פלורסנט. לכידת תמונות Z stack מבטיחה שהקוטר המרבי של הקפסולה וגוף התא נרכש עבור כל תא. לאחר מכן ניתן לעבד את הערימות כדי לייצר תחזיות בעוצמה מקסימלית למדידה ידנית של קפסולת תא השמרים וקוטר התא.

אין הבדל משמעותי בתוך הניסוי בין מדידות הקפסולה בשתי שיטות הצביעה, אם כי נצפתה שונות גדולה יותר בין הניסויים בעת שימוש בדיו הודי למדידת קוטר הקפסולה בהשוואה לצביעת צבע פלואורסצנטי. הבדלים משמעותיים במדידות קוטר הקפסולה בין חוקרים שונים אינם נצפים בדרך כלל ללא קשר לשיטה בה נעשה שימוש, בעוד שניתן לזהות הבדלים קטנים אך משמעותיים בגודל הקפסולה באמצעות שיטת המדידה האוטומטית. למדידה אוטומטית מוצלחת, התאים חייבים להיות ממוקדים, בעלי קפסולה בינונית עד גדולה, ולא להיות מקובצים יתר על המידה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום לקפסולה ב-Cryptococcus neoformans, לצבוע אותה באמצעות דיו הודי או צביעה פלואורסצנטית, לדמיין את הקפסולה ולמדוד אותה באמצעות תוכנה אוטומטית.