שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול
28 בפברואר 2018
העשרה סביבתית (EE) היא סביבת מגורים בעלי חיים המשמש כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס את החיבורים בין אורח חיים, מתח, מחלה. פרוטוקול זה מתאר הליך שבאמצעותו משתמש במודל עכבר של המעי הגס tumorigenesis, EE במיוחד להגדיר שינויים microbiota המגוון הביולוגי עשוי להשפיע התמותה בעלי חיים.
המטרה העיקרית של פרסום זה היא להציג שיטה לנורמליזציה של המיקרוביום של מכרסמים. בהדגמה זו, נבדקת השפעת ההעשרה הסביבתית על המיקרוביום במהלך היווצרות גידול המעי הגס. פרוטוקול זה מראה כיצד נורמליזציה של המיקרוביום לפני התערבות העשרה סביבתית משפרת את יכולת השחזור הניסיונית.
אנו גם מראים כיצד להפחית את הסטרס של בעלי חיים ולשפר אינטראקציות באמצעות סביבה מועשרת. למרות שהתמקדנו בהשפעת העשרה סביבתית במודל גידול במעי הגס, ניתן ליישם את השיטה בקלות כדי להבין טוב יותר את תפקיד המיקרוביום באטיולוגיה של מחלות. הגדר את הכלובים בתנאים סטריליים בעבודה מתחת למכסה מנוע מאוורר.
הבקרות לניסוי זה מורכבות מכלובים קונבנציונליים עם מצעים ורקמות מעבדה לקינון, אך מלבד זאת חסרים מכשירי העשרה. כדי להקים את כלובי גידול הגורים או כלובים מועשרים בסביבה, חברו שני כלובים גדולים עם חיטוי עם מנהרה מאובטחת בלולאה מעוקרת וכללו פלטפורמה מעוקרת בכל כלוב כדי להגדיל את שטח הרצפה. עבור EE, ספק גם גלגלי ריצה מעוקרים, מנהרות, איגלו, בקתות, כדורי זחילה וחומרי קינון.
הנח גם את הכלובים המועשרים וגם את כלובי הבקרה באותו מתלה כדי לספק אוורור שווה. לצורך רבייה, שלבו אב אחד ושני סכרים פוטנציאליים בכלובים רגילים. בכל בוקר, בדקי אם יש פקקים בנרתיק המעידים על כך שהחיה הזדווגה במהלך הלילה.
אם לא נראה פקק, התנגדות לבדיקה בנרתיק יכולה לזהות פקק מופנם. אם לנקבה יש פקק וגינלי, העבירו אותה לכלוב גידול גורים גדול. ניתן לשכן עד 12 סכרים בהריון בכלובים מועשרים סביבתית עם פלטפורמות בתנאי שכולם צפויים להיוולד במהלך אותו שבוע.
כאשר הגורים בני 21 עד 28 יום, חלקו את הזכרים והנקבות לפי גנוטיפ לסביבות ביקורת או לסביבות מועשרות. הקפד לשמור פרופורציה של כל גנוטיפ בכל כלוב. כלובים לא מועשרים יכולים לתמוך בעד חמישה עכברים, בעוד שכלובים מועשרים דורשים לפחות 20 עכברים לגירוי חברתי ויכולים לתמוך בעד 41 עכברים.
התחל לאסוף צואה יום או יומיים לפני המתת חסד של העכברים. יש לאסוף תמיד באותה שעה ביום. כדי לאסוף צואה מבעלי חיים חיים, קשקשו בזהירות את החיה על כלוב נקי.
לאחר מכן אוספים את הצואה שעושה את צרכיהם באמצעות מלקחיים סטריליים ומעבירים לצינור מיקרופוגה סטרילי. אם בעל חיים לא עושה את צרכיו באופן מיידי, הכניסו אותו לכלוב נקי והמתינו עד שהחיה תעשה את צרכיה, מה שיכול לקחת עד שעה. כדי לאסוף צואה מבעל חיים שעבר המתת חסד, נתחו אותו כדי לגשת למעי הגס.
לאחר מכן חותכים את המעי הגס ממש מתחת לקקום ומניחים את המעי הגס על פיסת נייר פילטר. לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להרים את החלק העליון של צינור המעי הגס ולפתוח את הלומן באמצעות מספריים. חותכים לאורך דיסטלי לפרוקסימלי כדי לפתוח את המעי הגס לאורכו.
לאחר מכן אוספים צואה מהמעי הגס הדיסטלי לתוך צינור מיקרופוגה סטרילי באמצעות מלקחיים סטריליים. אחסן את דגימות הצואה במינוס 80 מעלות צלזיוס. בנוסף לצואה, אסוף דגימות רקמה אחרות מהמעי הגס והמעי הדק, מיקרוזומים, רקמת שומן וכן הלאה.
השתמש בערכה מסחרית כדי לבודד DNA מיקרוביאלי מהצואה בעקבות פרוטוקול זיהוי פתוגנים בצואה. כאשר עושים זאת, העבירו את הדגימות מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש ושקלו אותן. לאחר מכן, הגדר PCR המגביר את ה-DNA המיקרוביאלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן נקו את מוצרי התגובה באמצעות חרוזים מגנטיים. לצורך הניקוי, תחילה צנטריפוגה קצרה את לוחית ה-PCR של האמפליקון כדי לאגד את תוצרי התגובה. לאחר מכן, מערבל את החרוזים המגנטיים כדי לפזר אותם באופן שווה ולהעביר 20 מיקרוליטר לכל תגובה היטב.
מערבבים היטב את החרוזים עם התמיסה על ידי פיפטינג של כל הנפח לאט 10 פעמים. לאחר מכן הניחו לחרוזים להתיישב במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את לוחית ה-PCR על מעמד מגנטי והמתינו שתי דקות עד שהסופרנטנטים יתבהרו בעקבות איסוף מגנטי של חרוזים.
לאחר מכן הסר והשליך את הסופרנטנטים. לאחר מכן, כשהצלחת עדיין על המגנט, מלאו כל באר חרוזים ב-200 מיקרוליטר אתנול טרי של 80% והמתינו 30 שניות. ואז הסר בזהירות את הסופרנטנט.
חזור על שלב כביסה זה פעם אחת ותן לחרוזים להתייבש באוויר למשך 10 דקות. כעת הסר את תוצרי התגובה מהחרוזים על ידי הסרת הצלחת מהמעמד המגנטי והוספת 52.5 מיקרוליטר טריס לכל באר. מערבבים לחלוטין את החרוזים לתמיסה על ידי פיפטינג של כל הנפח לאט 10 פעמים.
לאחר מכן אספו את החרוזים על המעמד המגנטי כמו קודם והעבירו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת PCR נקייה. מכסים את הצלחת בדבק שקוף ומאחסנים אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע. השתמש ב-supernatant שנאסף כדי לבצע PCR אינדקס כדי לצרף ברקודים לרצף המתאמים.
לאחר מכן טהר את המוצרים והכן את הספרייה באינדקס לרצף. בעכברים, העשרה סביבתית ידועה כמשפרת את תוחלת החיים ואת תיקון פצעי הגידול. כדי להגדיר את תפקיד המיקרוביוטה בפנוטיפ זה, חיות רבייה שולבו במושבת העכברים למשך חודש אחד לפחות כדי לנרמל את המיקרוביוטה.
לאחר מכן הם גודלו וצאצאיהם גודלו בסביבה מועשרת או בסביבה רגילה. הצאצאים היו גם נושאי גידול או סוג פראי. לאחר 16 שבועות, החיות הורדמו ודגימות צואה נאספו כדי לבודד DNA מיקרוביאלי.
לאחר מכן, נעשה שימוש ב-PCR כדי להגביר את תת-היחידה הריבוזומלית 16S בדגימות כדי לסקור את רכיבי המיקרוביום. תוצרי התגובה זוהו לאחר מכן באמצעות אינדקס ברקוד. מעניין שסביבות משופרות אינן משפרות את המגוון הביולוגי בחיות בר, אך הן מגדילות במידה ניכרת את המגוון הביולוגי בבעלי חיים נושאי גידולים.
זה מדגים את הרגישות של השיטה. עלייה זו במגוון הביולוגי יוחסה לנוכחות מוגברת של פילום פרוטאובקטריה עם עלייה משמעותית במחלקות alphaproteobacteria ו-betaproteobacteria וירידה בגמפרוטאובקטריה פתוגנית. העלייה הגדולה ביותר בקבוצת הבטא-פרוטאובקטריה הייתה בסוג Sutterella, ככל הנראה קומנסל המעורב בפירוק אימונוגלובולין A המופרש.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשנות את שיטות הגידול כדי לנרמל את המיקרוביום בין חיות ניסוי לפני שתתחיל בהתערבויות המעניינות שלך. בזמן ביצוע הליך זה, זכרו שבעלי חיים ביססו את הטריטוריה שלהם בסביבה. בשל כך, שינויים בסביבה יכולים לגרום לסטרס שישפיע על המיקרוביום של החיה.
שינוי פתאומי בהתנהגות החיה הוא סימן פיזי ללחץ. בעקבות הליך זה, ניתן לבודד חיידקים ספציפיים ולאפיין אותם עוד יותר כדי לבדוק את הספיקות של המיקרובים המזוהים על התקדמות המחלה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט להערכת ההשפעות של העשרה סביבתית (EE) על המגוון הביולוגי של מיקרוביומ המעי במודל של גידול במעי הגס של עכברים. השיטה שמה דגש על נרמול המיקרוביומ לפני התערבות ה-EE כדי לשפר את השחזוריות הניסויית, ובוחנת כיצד EE משפיעה על הרכב המיקרוביומ, במיוחד בעכברים עם גידולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר מיקרוביום
- ביולוגיה של הסרטן
- גידול בעלי חיים
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- הוכח כי העשרה סביבתית (Environmental enrichment) תורמת לשיפור תוצאות המחלה בבני אדם ובמודלים של בעלי חיים.
- EE עשויה להפחית תהליכי תומוריגנזה ולשפר את ההישרדות בעכברים על ידי ויסות תגובות חיסוניות ותיקון פצעים.
- המיקרוביום של המעי מעורב בפתוגנזה של סרטן המעי הגס, מחלות מעי דלקתיות, השמנה וסוכרת.
- נורמליזציה של המיקרוביום וגידול קפדני של בעלי החיים הם קריטיים להשגת תוצאות הדירות במחקרי מיקרוביום.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול הניתן לשחזור להערכת ההשפעה של EE על גיוון המיקרוביום במעי במודל של גידול במעי הגס של עכבר.
- להדגים את החשיבות של נורמליזציה של המיקרוביום לפני התערבויות ניסיוניות.
- לאפיין שינויים במיקרוביוטה באמצעות ריצוף 16S rDNA לאחר חשיפה ארוכה ל-EE.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמת סביבות בקרה וסביבות מועשרות עבור עכברים, כולל הגדרות כלובים ספציפיות ומכשירי העשרה.
- אסטרטגיות רבייה להבטחת פיזור הגנוטיפ ונורמליזציה של המיקרוביום.
- איסוף דגימות צואה מבעלי חיים חיים ומהורגשים תחת תנאים סטריליים.
- בידוד של DNA מיקרוביאלי מדגימות צואה באמצעות ערכות מסחריות.
- הגברה של 16S rDNA באמצעות PCR, ולאחריה טיהור באמצעות חרוזי מגנט והוספת ברקודים לריצוף.
- ניתוח של הרכב המיקרוביום והמגוון הביולוגי לאחר הריצוף.
תוצאות עיקריות
- העשרה סביבתית הגבירה באופן משמעותי את המגוון הביולוגי של המיקרוביום בעכברים עם גידולים סרטניים, אך לא בבעלי חיים מסוג wild-type.
- העלייה במגוון הביולוגי נבעה בעיקר משפע גבוה יותר של Proteobacteria, ובמיוחד alphaproteobacteria ו-betaproteobacteria, עם ירידה ב-gammaproteobacteria פתוגניים.
- הסוג Sutterella, שסביר להניח שהוא קומנסלי, הראה את העלייה הגדולה ביותר בקרב ה-betaproteobacteria.
- נורמליזציה נאותה של המיקרוביום ושיטות טיפול בבעלי חיים הפחיתו משתנים מתערבים ושיפרו את השחזוריות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר הערכה רחבה של השפעות EE על מיקרוביום המעי במודלים של מחלות.
- נורמליזציה של המיקרוביום לפני ההתערבות חיונית לקבלת תוצאות מהימנות.
- ניתן להתאים גישה זו לחקר תפקידי המיקרוביום במחלות שונות באמצעות מודלים של עכברים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
נורמליזציה של המיקרוביום במודלים פרה-קליניים של עכברים היא קריטית להפחתת משתנים מתערבים ולשיפור הביטחון החזוי של מחקרי העשרה סביבתית במחקרי אונקולוגיה. שיטה זו מאפשרת הערכה חסונה של האופן שבו גורמים סביבתיים מושפעים מהגיוון של המיקרוביום, מה שמשפיע ישירות על מהימנותם של מודלים רלוונטיים למחלה ועל גילוי ביומרקרים תרגומיים. שילוב של פרוטוקולי נורמליזציה והעשרה של המיקרוביום מחזק את שלבי הגילוי המוקדמים ואת מיון הפורטפוליו על ידי הבהרת המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס התקדמות הגידול.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מעמיקה של תפקיד המיקרוביום בתהליכי קרצינוגנזה והתקדמות המחלה.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות בקרה על גורמים סביבתיים ומיקרוביאליים מתבלים.
- משפר את הביטחון החזוי בקישור בין העשרה סביבתית להשפעות המתווכות על ידי המערכת החיסונית והמיקרוביום.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות במודלים של עכברים הרלוונטיים למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכינה קבוצות בעלי חיים סטנדרטיות לבדיקות מיקרוביום ואימונולוגיה בהמשך התהליך.
- משפרת את השחזוריות ואת התוצר הכמותי באמצעות איסוף דגימות מבוקר וריצוף 16S rDNA.
- מאפשרת הערכה מהימנה של התערבויות המשפיעות על המיקרוביום במסלולי פיתוח אונקולוגיים.
- תומכת ביכולת הגדלה של הבדיקות ובשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מודלים של מספר מחלות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן מודלים פרה-קליניים עם מחלה אנושית על ידי התייחסות לפתוגנזה המונעת על ידי המיקרוביום.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני עבור טיפולים המכוונים למיקרוביום.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים בהתבסס על נתוני מיקרוביום חסונים וניתנים לשחזור.
- תומך בזיהוי של ביומרקרים תרגומיים הקשורים למודולציה סביבתית ומיקרוביאלית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף מהשלב הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני, על ידי ביסוס תנאי מיקרוביום סטנדרטיים לפני התערבויות של העשרה סביבתית במודלים של גידולי עכבר.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות בנוגע לאינטראקציות בין המיקרוביום לסביבה בתהליכי קרצינוגנזה.
- סריקה: מספקת קריאות מיקרוביום כמותיות וניתנות לשחזור לצורך השוואת תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מספקת נתוני רצף 16S rDNA לתמיכה בניתוח סטטיסטי של שינויים במגוון המיקרוביאלי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים פרה-קליניים למחלות בבני אדם על ידי מידול של מנגנונים המונעים על ידי המיקרוביום.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למודלים שונים של עכברים הרלוונטיים למחלות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מיקרוביום-אונקולוגיה.
- ערך תפעולי: מתקנן את גידול בעלי החיים ואת עיבוד הדגימות להשגת תוצאות הדירות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי מזעור משתנים מתערבים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של תוכניות התערבות סביבתיות ותוכניות המכוונות למיקרוביום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול בעלי חיים, ניתוח מיקרוביום וטכניקות של ביולוגיה מולקולרית.
- דורש גישה למתקני בעלי חיים סטריליים, מכשור PCR ותשתיות ריצוף.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לפרוטוקולים של רבייה, העשרה ואיסוף דגימות.
- ניתן להתאמה עבור גנוטיפים של עכברים ומודלים של מחלות, תוך מתן תשומת לב לשילוב מושבות ולבקרות סביבתיות.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות שינויים במיקרוביום עקב דחק (stress) וצורך בניהול סביבתי קפדני.
