שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במורפולוגיה ובתפקוד של לויקוציטים בתוך הכבד במהלך הלם ספטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג סרטונים ישירים של לויקוציטים בתוך הכבד. לפני הניתוח, השתמש באתנול 70% כדי לחטא את שולחן הניתוחים ואת כל המכשירים.

לאחר מכן הגדר את הכלים לניתוח כבד והתאם את לוחית החימום ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הרדמת עכברים מוזרקים LPS או PBS לפי פרוטוקול הטקסט, יש למרוח כמות קטנה של משחת עיניים כדי למנוע התייבשות הרשתית. השתמש בסכין גילוח וקרם להסרת שיער כדי להסיר את השיער סביב הבטן.

לאחר מכן השתמש בגזה רטובה כדי לנקות את הבטן. תוך כדי ביצוע הזרקה רטרו-אורביטלית באמצעות מזרק אינסולין, יש להזריק 200 מיקרוליטר של תמיסת דקסטרן אדומה מטקסס. השתמש בטוש כדי לסמן את האזור התת-צלעי הימני מתהליך הקסיפואיד לקצה הצלע.

לאחר מכן מרחו יוד פובידון על בטן העכבר כדי למנוע זיהום משני. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את האפידרמיס. לאחר מכן, בעזרת מספריים מיקרו ומלקחיים פותחים את חלל הבטן וחושפים בזהירות את הכבד.

השתמש בצמר גפן כדי לגלגל את האונה הצדדית השמאלית. לאחר מכן שפכו 500 מיקרוליטר PBS סטרילי על חלל הבטן כדי למנוע את התייבשות הכבד. הנח את העכבר במצב דלקת הרקוביטיס הנכון בתא מעוצב בהתאמה אישית והחל כמות קטנה של דבק רקמות על מיטת הסיליקון.

לאחר מכן השתמש בצמר גפן כדי לחבר בזהירות את הכבד. רקמת הכבד פריכה ביותר. לעולם אל תשתמש בכלים חדים או כבדים בעת חשיפת הכבד והחזקתו.

כמה שניות לאחר מכן, הרטיבו את הכבד שוב עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי למנוע ממנו להתייבש. לאחר מכן הניחו את מסגרת המתכת על הכבד והשתמשו באגוזים כדי לתקן אותה היטב. הנח תמיד אגוזים תומכים לפני הנחת מסגרת המתכת.

זה יעזור להפחית את הלחץ של מסגרת המתכת. כדי לבצע הדמיה תוך-חיונית של הכבד, הפעל את תוכנת הזן כדי להפעיל את הלייזר. הגדר את אורך הגל ל-880 ננומטר והגדר את הערוצים הירוקים והאדומים.

לאחר מכן התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לעוצמת הקרינה. הנח את החדר על ההדמיהtagה ומקם את עדשת המטרה לטבילה במים 20 עוצמה קרוב לזכוכית הכיסוי. תקן את תנור הגומי מסיליקון מתחת לגוף העכבר כדי לשמור על טמפרטורת גופו.

לאחר מכן, צייר 500 מיקרוליטר מים מזוקקים על מסגרת המתכת. ואז מקם את עדשת האובייקט קרוב לכבד. כוונן את המיקוד וקבע את העומק והזמן של אזור ההדמיה.

להדמיה לטווח ארוך, יש להזריק חצי מנה של תערובת ההרדמה של זולטיל ורומפון שהוכנה קודם לכן לכל שעה במהלך ההדמיה מסיבות אתיות. שמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס ותמיד השגיח על העכבר מכיוון שזמני ההרדמה שונים עבור כל עכבר. כדי לנתח את הנתונים, פתח את Velocity וייבא את הנתונים הגולמיים מהספריה.

לאחר מכן הסר את הרעש מהתמונה וצלם תמונה. לבסוף התאם את הפריטים הערוכים ל 100% וייצא את הקבצים כקבצי JPEG או TIF עבור תמונות תמונה וקבצי AVI לסרטים. ניתוח הדמיה תוך-חיונית של עכברי ביקורת הראה שמספר קטן של נויטרופילים מסתובבים בכלי הדם.

ואילו מספר הנויטרופילים גדל משמעותית בעכברים שטופלו ב-LPS. במצב LPS הרבה נויטרופילים הסתובבו בתוך זרם הדם אך הם לא נדדו מחוץ לכלי הדם. כפי שניתן לראות בסרטים אלה, בהשוואה לעכברי ביקורת, נויטרופילים בעכברים שטופלו ב-LPS היו דבוקים יותר למשטח הלומינלי של כלי הדם, מה שגרם לנויטרופילים להתגלות בתדירות גבוהה יותר בכלי.

מלבד התנועתיות של נויטרופילים, מקרופאגים קפסולריים בכבד, או LCMs, בעכברי CX3CR1-GFP נצפו על פני רקמת הכבד ולא עמוק בתוך הרקמה. בנוסף, LCMs הראו מעט תנועה או הפעלה בכבד אפילו בעכברים שטופלו ב-LPS. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכוון את קו החתך מתהליך xiphoid לקצה הבטן התת-צלעית הימנית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הזרקת טיפול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד הכבד מתאושש מנזק וזיהום. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה לחקור את תגובת הלויקוציטים במהלך אלח דם ולבדוק תרופות פוטנציאליות.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לחשוף כבד עם חתך מינימלי בבטן. אל תשכח שעבודה עם ליפופוליסכריד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו עיקור ושטיפת ידיים בעת ביצוע הליך זה.