שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד
6 בפברואר 2018
הקמנו פרוטוקול כירורגיים חדשניים עבור שני הפוטונים הדמיה של עכברים חיים כבד עם הפלישה מינימלי. בטכניקה זו, זיהינו את מבנה נתונים היסטוריים של הכבד במהלך endotoxemia ליפופוליסכריד-induced. אנו צופים כי שיטה זו עשויה להיות מנוצל כדי לקבוע את היעילות של טיפול שונים ריאגנטים ליקוציט הכבד ההעברה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן במורפולוגיה ובתפקוד של לויקוציטים בתוך הכבד במהלך הלם ספטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשיג סרטונים ישירים של לויקוציטים בתוך הכבד. לפני הניתוח, השתמש באתנול 70% כדי לחטא את שולחן הניתוחים ואת כל המכשירים.
לאחר מכן הגדר את הכלים לניתוח כבד והתאם את לוחית החימום ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הרדמת עכברים מוזרקים LPS או PBS לפי פרוטוקול הטקסט, יש למרוח כמות קטנה של משחת עיניים כדי למנוע התייבשות הרשתית. השתמש בסכין גילוח וקרם להסרת שיער כדי להסיר את השיער סביב הבטן.
לאחר מכן השתמש בגזה רטובה כדי לנקות את הבטן. תוך כדי ביצוע הזרקה רטרו-אורביטלית באמצעות מזרק אינסולין, יש להזריק 200 מיקרוליטר של תמיסת דקסטרן אדומה מטקסס. השתמש בטוש כדי לסמן את האזור התת-צלעי הימני מתהליך הקסיפואיד לקצה הצלע.
לאחר מכן מרחו יוד פובידון על בטן העכבר כדי למנוע זיהום משני. השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לחתוך את האפידרמיס. לאחר מכן, בעזרת מספריים מיקרו ומלקחיים פותחים את חלל הבטן וחושפים בזהירות את הכבד.
השתמש בצמר גפן כדי לגלגל את האונה הצדדית השמאלית. לאחר מכן שפכו 500 מיקרוליטר PBS סטרילי על חלל הבטן כדי למנוע את התייבשות הכבד. הנח את העכבר במצב דלקת הרקוביטיס הנכון בתא מעוצב בהתאמה אישית והחל כמות קטנה של דבק רקמות על מיטת הסיליקון.
לאחר מכן השתמש בצמר גפן כדי לחבר בזהירות את הכבד. רקמת הכבד פריכה ביותר. לעולם אל תשתמש בכלים חדים או כבדים בעת חשיפת הכבד והחזקתו.
כמה שניות לאחר מכן, הרטיבו את הכבד שוב עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי כדי למנוע ממנו להתייבש. לאחר מכן הניחו את מסגרת המתכת על הכבד והשתמשו באגוזים כדי לתקן אותה היטב. הנח תמיד אגוזים תומכים לפני הנחת מסגרת המתכת.
זה יעזור להפחית את הלחץ של מסגרת המתכת. כדי לבצע הדמיה תוך-חיונית של הכבד, הפעל את תוכנת הזן כדי להפעיל את הלייזר. הגדר את אורך הגל ל-880 ננומטר והגדר את הערוצים הירוקים והאדומים.
לאחר מכן התאם את עוצמת הלייזר בהתאם לעוצמת הקרינה. הנח את החדר על ההדמיהtagה ומקם את עדשת המטרה לטבילה במים 20 עוצמה קרוב לזכוכית הכיסוי. תקן את תנור הגומי מסיליקון מתחת לגוף העכבר כדי לשמור על טמפרטורת גופו.
לאחר מכן, צייר 500 מיקרוליטר מים מזוקקים על מסגרת המתכת. ואז מקם את עדשת האובייקט קרוב לכבד. כוונן את המיקוד וקבע את העומק והזמן של אזור ההדמיה.
להדמיה לטווח ארוך, יש להזריק חצי מנה של תערובת ההרדמה של זולטיל ורומפון שהוכנה קודם לכן לכל שעה במהלך ההדמיה מסיבות אתיות. שמור על טמפרטורת הגוף על 37 מעלות צלזיוס ותמיד השגיח על העכבר מכיוון שזמני ההרדמה שונים עבור כל עכבר. כדי לנתח את הנתונים, פתח את Velocity וייבא את הנתונים הגולמיים מהספריה.
לאחר מכן הסר את הרעש מהתמונה וצלם תמונה. לבסוף התאם את הפריטים הערוכים ל 100% וייצא את הקבצים כקבצי JPEG או TIF עבור תמונות תמונה וקבצי AVI לסרטים. ניתוח הדמיה תוך-חיונית של עכברי ביקורת הראה שמספר קטן של נויטרופילים מסתובבים בכלי הדם.
ואילו מספר הנויטרופילים גדל משמעותית בעכברים שטופלו ב-LPS. במצב LPS הרבה נויטרופילים הסתובבו בתוך זרם הדם אך הם לא נדדו מחוץ לכלי הדם. כפי שניתן לראות בסרטים אלה, בהשוואה לעכברי ביקורת, נויטרופילים בעכברים שטופלו ב-LPS היו דבוקים יותר למשטח הלומינלי של כלי הדם, מה שגרם לנויטרופילים להתגלות בתדירות גבוהה יותר בכלי.
מלבד התנועתיות של נויטרופילים, מקרופאגים קפסולריים בכבד, או LCMs, בעכברי CX3CR1-GFP נצפו על פני רקמת הכבד ולא עמוק בתוך הרקמה. בנוסף, LCMs הראו מעט תנועה או הפעלה בכבד אפילו בעכברים שטופלו ב-LPS. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכוון את קו החתך מתהליך xiphoid לקצה הבטן התת-צלעית הימנית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הזרקת טיפול על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד הכבד מתאושש מנזק וזיהום. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הרפואה לחקור את תגובת הלויקוציטים במהלך אלח דם ולבדוק תרופות פוטנציאליות.
לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לחשוף כבד עם חתך מינימלי בבטן. אל תשכח שעבודה עם ליפופוליסכריד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו עיקור ושטיפת ידיים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי חדש לדימות דו-פוטוני של כבד עכבר חי עם פולשנות מינימלית. הטכניקה מאפשרת תצפית על התנהגות לוקוציטים במהלך אנדוטוקסמיה המושרית על ידי ליפופוליסכריד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- טכניקות דימוי חי
רקע
- הבנת התגובות של הכבד במהלך הלם ספטי היא חיונית.
- נדידת לוקוציטים ממלאת תפקיד משמעותי בדלקת של הכבד.
- שיטות דימות מסורתיות עשויות שלא לספק תובנות בזמן אמת.
- דימות דו-פוטוני מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של רקמות חיות.
מטרת המחקר
- לבחון את המורפולוגיה והתפקוד של לוקוציטים בכבד.
- להעריך את השפעת האנדוטוקסמיה על התנהגות הלוקוציטים בכבד.
- לפתח טכניקת דימות זעיר-פולשנית לרקמות חיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מכשירים כירורגיים וחיטוי.
- שימוש בחומרי אלחוש לעכברים לפני ההדמיה.
- מריחת פומדת עינית להגנה על הרשתית.
- הסרת שיער מסביב לבטן לצורך גישה כירורגית.
תוצאות עיקריות
- דימיון מוצלח של דינמיקת לוקוציטים בכבד.
- זיהוי שינויים מבניים במהלך אנדוטוקסמיה.
- לכידת וידאו בזמן אמת של התנהגות לוקוציטים.
- יישומים פוטנציאליים להערכת התערבויות טיפוליות.
מסקנות
- טכניקת ההדמיה החדשנית משפרת את הבנתנו את האימונולוגיה של הכבד.
- היא מספקת פלטפורמה למחקרים עתידיים על נדידת לוקוציטים בכבד.
- שיטה זו עשויה להקל על הערכת טיפולים לדלקות בכבד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות תוך-חי (intravital) בזמן אמת באמצעות פוטונים כפולים של דינמיקת לוקוציטים בכבד של עכבר שטופל ב-LPS מאפשר ויזואליזציה ישירה של התנהגות תאי מערכת החיסון במהלך תגובות דלקתיות חריפות. יכולת זו תומכת בהסרה של סיכונים מנגנוניים (mechanistic de-risking) ובביטחון חיזוי במחקרים בשלבים מוקדמים של אימונולוגיה ודלקת. גישה זו ממוקמת באופן אסטרטגי כדי לספק מידע לאישור מטרות (target validation) ובדיקת היפותזות טיפוליות עבור מודלים של אלח דם וכשל רב-איברי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של גיוס והיצמדות לוקוציטים בתגובה לאנדוטוקסמיה.
- מבהיר את המיקום והניידות של תאי מערכת החיסון בתוך מיקרו-סביבות כבדיות הרלוונטיות למחלה.
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות חיסוניות המעורבות בנזק לאיברים המושרה על ידי ספסיס.
- תומך בביטחון חיזוי לצורך תיעדוף של התערבויות מווסתות מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מקימה מערכות דימות in vivo מאושרות להערכה כמותית של דינמיקת תאי חיסון.
- מאפשר מדידה הדירה של תגובות נויטרופילים ומקרופאגים לתרכובות מועמדות.
- מספק פלטי דימות סטנדרטיים להשוואה בין מחקרים ובין צוותים.
- מאפשר סריקה של ריאגנטים המווסתים את ניידותם ומורפולוגייתם של לוקוציטים in situ.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של ספסיס ודלקת חריפה של הכבד.
- תומך ברציפות תרגומית על ידי קישור התנהגות תאית לתוצאות ברמת האיבר.
- מספק בסיס לקדם טיפולים אימונומודולטוריים המכוונים לנזק רקמתי המונע על ידי לוקוציטים, תוך התאמה לרמת הסיכון.
- מספק תובנה מכניסטית להערכה פרה-קלינית של יעילות טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול דימות זה משתלב ברצף שבין השלב המחקרי לשלב הפרה-קליני, בכך שהוא מאפשר בחינה מונחית-השערה של התנהגות תאי חיסון ברקמות חיות. הוא מגשר בין מחקרי מנגנונים ראשוניים לבדיקות יעילות בהמשך התהליך במודלים של מחלות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס עבור גיוס והפעלה של תאי מערכת החיסון בתגובה לאתגר של אנדוטוקסין.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על דינמיקת לוקוציטים.
- אנליטיקה: מספק נתוני וידאו ותמונה בעתי richesse (high-content) להשוואה סטטיסטית של תגובות חיסוניות תחת תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: שומר על רלוונטיות למחלה על ידי מידול תגובות דלקתיות חריפות in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרי חיסון מגוונים והערכת תרופות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תגובה חיסונית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימוי in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות של go/no-go עבור מועמדים למודולציה חיסונית על ידי אספקת קריאות תפקודיות ישירות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ותרכובות המותאם לסיכון, בהתבסס על התנהגות תאי חיסון בזמן אמת.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים זעיר-פולשניים ובמיקרוסקופיה דו-פוטונית.
- נדרשת גישה למכשור דימות מתקדם ותוכנות אנליטיות.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי ניתוח ודימות בין הצוותים השונים.
- ייתכן שיידרשו התאמות עבור זני עכברים שונים או סמני תאי חיסון שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות שיקולי רווחת בעלי חיים ומורכבות טכנית של דימוי בחיים.
