שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להבדיל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאים דמויי הפטוציטים באופן המתאים להקרנה בתפוקה גבוהה. קשה לגדל תאי כבד במעבדה, אולם הם יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים המספקים פלטפורמת סינון לזיהוי טיפולים למחלות כבד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר מספר בלתי מוגבל של הפטוציטים מכל חולה עם מחלת כבד המסכמים את המחלה במעבדה.

ההליך קל יחסית להקמה, גם ללא ידע נרחב בביולוגיה של תאי גזע. יכולת השחזור שלו מאפשרת לחוקרים לסנן אלפי תרכובות ללא צורך ברובוטיקה מורכבת. ריי ליו, פוסט-דוקטורנט, ופייג' למפרכט, סטודנטית לתואר שני, ידגימו את ההליך היום.

ראשית, יש לדלל את חלבון ההיתוך Ecad ל-15 מיקרוגרם למיליליטר עם תמיסת מלח פוספט של Dulbecco, או DPBS, המכילה סידן ומגנזיום. מצפים צלחות תרבית רקמות מתלה 100 מילימטר בחמישה מיליליטר של מטריצה מדוללת ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, הסר את המצע והחלף בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית iPSC.

אחזר בקבוקון של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים בהקפאה מחנקן נוזלי. מפשירים ב-37 מעלות צלזיוס עד שיישאר גביש קרח קטן. לאחר מכן, פיפטה בעדינות את התאים לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר ממדיום התרבית.

צנטריפוגה את התאים ב -300 גרם למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש בעדינות את התאים עם חמישה מיליליטר של מדיום בתוספת עשרה מיקרומולר של Y-27632, מעכב סלקטיבי של חלבון קינאז הקשור ל-Rho, המכיל סליל מפותל. כעת, הסר את מדיום התרבות מכלי תרבית רקמת ההשעיה המצופים ב-Acad והוסף חמישה מיליליטר מהתאים.

לאחר שה-iPSCs מגיעים לסביבות 80% מפגש, הסירו את מצע התרבית ושטפו פעם אחת עם DPBS ללא סידן ומגנזיום. שאפו את ה-DPBS והוסיפו כמות מספקת של תמיסת 0.02% EDTA כדי לכסות את הכלים. לאחר מכן, דגרו על התאים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר.

ברגע שהתאים מתחילים להשתחרר, הסר את תמיסת ה-0.02% EDTA והציף את הצלחת בעשרה מיליליטר של מדיום M כדי לשחרר את התאים. סייע בניתוק iPSCs על ידי פיפטינג עדין. העבירו 1/10 מהתאים המרחפים לכל צלחת תרבית רקמה מצופה Equid טרייה המכילה חמישה מיליליטר של מדיום M.

דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני, והחליפו את המדיום מדי יום. אחזר בקבוקון אחד של 250 מיקרוליטר של מלאי מטריצה קרה כקרח בריכוז של שני מיליגרם למיליליטר והפשיר אותו על קרח. לאחר מכן, שלב את המטריצה המופשרת עם עשרה מיליליטר DMEM/F12 קר על ידי ערבוב עדין באמצעות פיפטה מקוררת מראש כדי ליצור ריכוז סופי של 0.05 מיליגרם למיליליטר.

העבירו 100 מיקרוליטר מהמטריצה המדוללת לכל באר של צלחת תרבית רקמות של 96 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה לפחות. לאחר הדגירה, השליכו את המטריצה והחליפו ב -50 מיקרוליטר מדיום M לבאר, וחזרו על אותו הליך ציפוי עם שאר הצלחות.

כעת, תרבית את ה-iPSCs על צלחות של 100 מילימטר עד שהתאים מתקרבים למפגש של 80%. כדי לקצור את ה-iPSCs מכל צלחת של 100 מילימטר, שאפו את מדיום התרבית ושטפו עם חמישה מיליליטר DPBS. החלף את השטיפה בשלושה מיליליטר של תמיסת ניתוק תאים, כגון Accutase.

לאחר מכן, דגרו כשתי דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. ברגע שהתאים מתחילים להתנתק, קצרו על ידי הוספת שבעה מיליליטר של מדיום M. פיפטה מספר פעמים כדי לפרק את מושבות התאים לאשכולות קטנים של כשלושה עד שישה תאים.

לאחר מכן, אספו את ה-iPSCs לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות. בסיום, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מדיום M. מחלקים באופן שווה את התאים על צלחות מצופות מטריצה של 96 בארות על ידי פיפטינג של 50 מיקרוליטר של תאי מתלה לכל באר באמצעות פיפטה רב-ערוצית.

לאחר מכן, תרבית התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני וחזור על הליכי זריעת התאים עם שאר הלוחות. בדוק את לוחות 96 הבארות במיקרוסקופיה כדי לוודא שהתאים מכסים לפחות 70% משטח כל באר בודדת. ליום הראשון עד היום השני של התמיינות, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות מבוסס RPMI לכל באר.

לאחר מכן, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחמצן הסביבה ו-5% פחמן דו חמצני למשך יומיים עם שינוי בינוני יומי. ליום השלישי עד היום החמישי של ההתמיינות, החלף את מדיום התרבית ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות מבוסס RPMI בתוספת 2% B27 ו-100 ננוגרם למיליליטר של NA פעיל. תרבו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחמצן הסביבה ו-5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים עם שינוי בינוני יומי. ביום הבידול החמישי, טפל בכל באר עם 100 מיקרוליטר של תמיסת EDTA 0.02% למשך 30 שניות והסר את התמיסה מיד.

הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום בידול טרי מבוסס RPMI וחזור על אותו הליך עבור שאר הצלחות. לבידול בין ימים שישה עד עשרה, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות מבוסס RPMI. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמישה ימים עם שינוי בינוני יומי.

לבידול בין הימים 11 עד 15, החלף את מדיום התרבית ב-100 מיקרוליטר של מדיום התמיינות מבוסס RPMI, בתוספת 2% B27 ו-20 ננוגרם למיליליטר HGF. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-4% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמישה ימים עם שינוי בינוני יומי. לבידול בין הימים 16 עד 20, החלף את מדיום התרבית במדיום תרבית תאי הפטוציטים בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של oncostatin-M.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחמצן הסביבה ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמישה ימים עם שינוי בינוני יומי. בסיום ההתמיינות ביום ה-20, החלף את מדיום התרבות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי הפטוציטים טריים בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של oncostatin-M. לאחר דגירה של 24 שעות, מוציאים את מדיום התרבות לצלחת טרייה של 96 בארות ומאחסנים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

חזור על אותו הליך איסוף עבור שאר הצלחות. הוסף 90 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאי הפטוציטים טריים בתוספת oncostatin-M לכל באר של צלחת 96 הבארות. הוסף עשרה מיקרוליטר מכל תרכובת שנבחרה מתמיסת מלאי עבודה שהוכנה בעבר.

הוסף DMSO ל-0.2% לבארות הבקרה כדי להתאים לריכוז הסופי בדגימות המטופלות. לאחר הדגירה של 24 שעות, אוספים את מדיום התרבות לצלחת טרייה של 96 בארות ומאחסנים בחום של 20 מעלות צלזיוס. חזור על אותו הליך איסוף עבור שאר הצלחות.

לאחר חמישה ימי טיפול, התאים מבטאים חלבונים המתבטאים באופן אופייני באנדודרם הסופי. לאחר חמישה ימים נוספים של התמיינות, האנדודרם הופך לגורל כבד, והתאים מבטאים FOXA2 ו-HNF 4a. לאחר הוספת HGF, התאים מבטאים חלבונים המצויים בהפטוציטים עובריים, ובסיום ההתמיינות התאים מאמצים מורפולוגיה קובואידית עם גרעין המכיל גרעינים בולטים וציטופלזמה גדולה עם טיפות שומנים מרובות.

צביעה חיסונית לזיהוי HNF 4a ואלבומין ביום ה-20 של ההתמיינות מראה כי התפלגות חלבוני ההפטוציטים הללו דומה בכל הבארות. iPSCs שימשו לסריקת תרכובות להורדת APOB כדי לספק דוגמה לשימוש בהפטוציטים שמקורם ב-iPSC לסריקת מולקולות קטנות. גורם ה-z של בדיקת APOB הוא 0.73, מה שמאשר את התאמת השימוש בפלטפורמה לגילוי תרופות.

היחס לאחר התרופה ולפני התרופה של APOB נקבע עבור כל תרכובת. זיהוי פגיעות הושג על ידי ניתוח z-score. זוהו 24 פגיעות פוטנציאליות עם יחס APOB בין 0.86 ל-0.44.

לאחר אי הכללת תרכובות שהייתה להן השפעה שלילית על כדאיות התא, נמצאו שתי תרכובות הניתנות לשחזור להורדת APOB. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 25 יום אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להכין מדיום טרי מדי יום.

ריכוז שגוי של רכיבים עקב השפלה ישנה את יכולת התאים להתמיין. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות לחקור טיפול טיפולי במחלות כבד באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבית ולתחזק תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם ולבצע התמיינות כבד בצורה לחוצה על פני השטח להקרנה בתפוקה גבוהה.

אל תשכח שעבודה עם תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש ללבוש תמיד את ציוד המגן האישי, כגון כפפות וחלוק מעבדה, בזמן ביצוע הליך זה.