איסוף ועיבוד של בלוטות הלימפה של חיות גדולות לניתוח RNA: הכנת ללימודי Transcriptomic הלימפה של מיני בעלי חיים גדולים

היי, שמי ד"ר רוברט שאוט ואני מדען במרכז הלאומי למחלות בעלי חיים באיימס, איווה. בסרטון JoVE זה, נשתף אתכם במידע על איסוף ועיבוד של בלוטות לימפה מבעלי חיים גדולים לשימוש בניסויי RNA במורד הזרם. לדוגמה, ניסויים אלה עשויים לכלול PCR כמותי על מוצרים מתועתקים הפוכים, או מחקרי ריצוף RNA של טרנסקריפטומים.

בלוטות לימפה הן דגימות שימושיות להערכת התגובות החיסוניות של המארח אך יכולות גם לספק מקור ל-RNA פתוגני למחקר, כמו המקרה של פתוגנים תוך-תאיים הנמצאים בתאי חיסון בתוך בלוטות לימפה. דגימות מבעלי חיים גדולים, כולל מיני חיות משק וחיות בר, מעניינות בחקר מחלות זואונוטיות. כאן, במרכז הלאומי למחלות בעלי חיים, אנו חוקרים זיהומים של חיות עם מינים כמו ברוצלה אבורטוס, שגורמת לברוצלוזיס בבקר ובביזון, ו-E.Coli O157:H7 כנשפך מעקבות המעיים של בקר.

אנו גם נשחזר דגימות רקמה ממינים של חיות בר, כמו צבאים ואיילים. ניתן לאסוף מגוון בלוטות לימפה מבעלי חיים הנגועים במחלות שונות. מחקרים על רקמות במינים מארחים טבעיים אלה רלוונטיים בדרך כלל יותר להתקדמות הטבעית של מחלות מאשר מודלים של עכברים.

עם זאת, תהליך קצירת הרקמות ממינים גדולים הוא בהכרח מסובך יותר מאשר מעכברים, כולל העיכוב הארוך יותר בין המתת חסד לאיסוף רקמות, וגודל גדול יותר של בלוטות לימפה. כאן, נציג פרוטוקול לבידוד בלוטות לימפה גדולות של בעלי חיים למחקר RNA שיהיה אינפורמטיבי לביולוגים מולקולריים המעורבים במחקרים טרנסקריפטומיים של זיהומים בבעלי חיים גדולים, כמו גם לחוקרים וטרינריים המתחילים במחקרים טרנסקריפטומיים. בסרטון זה נדגים נהלים בבלוטות לימפה לבקר.

לפני נקרופסיה, אנו ממליצים להרכיב את החומרים הבאים הספציפיים להליך בידוד רקמות. צינורות מיקרופוגה מלאים בכ-1 מ"ל של חומר משמר רקמת RNA, כמו RNAlater, אזמלים חד פעמיים, מלקחיים נקיים וחיטוי, מחטי ביופסיה, מיכל חד לאזמל ומחטים משומשים, וקרש חיתוך או מגש חד פעמי, בהתאם לרמת ההדבקה של החומרים המעורבים. במקרה זה, נדגים מרכיבי מפתח של ההליך באמצעות בלוטות לימפה שאנו אוספים בדרך כלל מבקר.

הם נגועים בחיידקים הגורמים לברוצלוזיס. אלה בלוטות הלימפה הקדם-שכמה, ובלוטת הלימפה הפרוטיד. בעת ביצוע נתיחה של בעלי חיים גדולים לשחזור RNA, כדאי שיהיו לפחות שלושה משתתפים העובדים על רקמות של בעלי חיים.

דיסקטור 1 יהיה אחראי על חתך בעלי חיים גדולים של חלקים שונים של החיה, דיסקטור 2 ישחזר בלוטות לימפה מחלקים שונים של בעלי חיים בשולחן הנתיחה הראשי, ודיסקציה 3 תעבוד בשולחן נפרד כדי לבודד חלקים מכל בלוטת לימפה, ולהעביר אותם לצינורות עם תמיסה משמרת. נתחיל בזיהוי והסרה של בלוטת הלימפה הקדם-שכמה. באופן אידיאלי, מישוש של בלוטת לימפה, לפני דיסקציה, יעזור לזהות את מיקום בלוטת הלימפה.

למרות שלא תמיד ניתן לזהות, בלוטת הלימפה הקדם-שכמית מוחשית בדרך כלל בחיה בריאה. התחל בהנחת החיה בשכיבה לרוחב. הארך את הכתף על ידי הזזת הגפה הקדמית לאחור בגובה הברך.

תנועה זו תחזיר את הכתף לאחור, ותאפשר מישוש קל של בלוטת הלימפה. הרגישו את נוכחות בלוטת הלימפה כפי שמוצג. לאחר האיתור, וכאשר הכתף עדיין מורחבת, השתמש באזמל או בסכין נתיחה כדי לבצע חתך בעור לאורך קווי המתאר של הכתף.

משוך את העור כדי לחשוף את נקודת שרירי הכתפיים והצוואר. לפעמים נצפה קטע של שומן תת עורי, במיוחד בבעלי חיים עם תנאי יתר. בלוטת הלימפה הקדם-שכמית נמצאת לרוב עם קטעי שומן תת עורי.

כאן תוכלו לראות את שלוש שכבות העור, השרירים והשומן התת עורי. שוב, משש את מיקום בלוטת הלימפה. בניגוד לשומן התת עורי, בלוטת הלימפה תשמור על צורתה כאשר היא מוחשת.

לאחר איתור בלוטת הלימפה הקדם-שכמה, יש לנתח בזהירות את השומן התת עורי ולנתח את בלוטת הלימפה. המראה של בלוטות הלימפה הללו בביזון, בו השתמשנו במחקרי ברוצלוזיס בשל הרגישות של ביזון באזור ילוסטון רבתי לברוצלה, דומה. כאן, אנו מדגימים את המראה של בלוטת הלימפה הקדם-שכמית, כפי שנותחה מהכתף הימנית של ביזון אמריקאי.

בשלב הבא נעבור לבידוד בלוטת הלימפה הפרוטיד. כשהחיה בשכיבה לרוחב, אתר את המפרק הזמני. בעזרת אזמל או סכין נקרופסיה, בצע בזהירות חתך בעור.

התחל גב למפרק, והמשך אנכית לאורך קו הלסת. נתח את העור כדי לחשוף את הרקמה התת עורית. בלוטת הרוק הפרוטיד תהיה גלויה, תחילה בשל גודלה הגדול, מראה פני השטח האונות והצבע האדום.

בעזרת מלקחיים ואזמל, הזיזו את בלוטת הרוק הפרוטיד הצידה כדי למצוא את בלוטת הלימפה הפרוטידית יושבת רק גולגולת ומדיאלית לבלוטת הרוק. כאשר מבודדים את בלוטת הלימפה הפרוטיד, חשוב להפריד את רקמת בלוטות הלימפה מרקמת בלוטת הרוק הפרוטיד. סוגי הרקמות נראים מובחנים, כולל בתוך חתך הרקמה.

ניתן לראות זאת כאן, עם בלוטת הלימפה הפרוטידית משמאל, ובלוטת הרוק הפרוטיד מימין. הקפד לבחון היטב את רקמת בלוטת הלימפה הפרוטיד למרקם לפני עיבוד נוסף. במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לכרות את בלוטת הרוק הפרוטידית על מנת לאתר את בלוטת הלימפה הפרוטיד.

הנה דוגמה לבלוטת פרוטיד שנכרתה מהיגוי, שבה בלוטת הלימפה הייתה משובצת בתוך בלוטת הרוק ולא נראית לפני הסרת הבלוטה. מידע נוסף על זיהוי בלוטות לימפה נבחרות מסופק בכתב היד הראשי. לאחר איסוף בלוטות הלימפה, אתה מוכן לכרות חלקים לשימור.

השתמש באזמל או בסכין נקרופסיה, הסר קטע מבלוטת הלימפה ובצע חתך סגיטלי כדי לפתוח את בלוטת הלימפה. בדוק את פנים בלוטת הלימפה, במיוחד בדגימות מבעלי חיים נגועים, חפש אסימטריה, נגעים, הבדלי צבע וכו '. בבלוטת לימפה קדם-שכמית זו של בקר, תכונות מרובות נראות לעין בלתי.

אלה כוללים זקיקים המהווים בית ללימפוציטים מסוג B, ויחידות קליפת המוח העמוקות, המהוות בית לתאי T. סיבות אלו נראות כהות יותר מהסינוסים המדולריים, שהם בהירים יותר. כאן מתוארת דוגמה נוספת לבלוטת לימפה לא נגועה.

בלוטת לימפה זו היא מביזון צעיר יותר. שימו לב שהזקיקים פחות ברורים בדוגמה זו. על מנת לחתוך רקמות לעיבוד, אפשרות אחת היא לאסוף חתיכות רקמות קטנות מכל בלוטת לימפה בעזרת אזמל לצורך התאוששות RNA לאחר מכן.

עם זאת, אתגר מרכזי אחד בהשוואת פרופילי ביטוי בין דגימות הוא הגודל הגדול של בלוטות לימפה גדולות של בעלי חיים, בהשוואה לבלוטת לימפה של עכבר שניתן לחלץ בקלות בשלמותה לצורך מיצוי RNA. כתוצאה מכך, קטעי רקמה קטנים לא יתפסו באופן שווה את פרופיל התאים על פני בלוטת לימפה. במקום זאת, כדי ללכוד תאים על פני הפרופיל של בלוטת הלימפה, הוציאו טריז בצורת פאי מבלוטת הלימפה, חתכו לחתיכות קטנות בעובי של לא יותר מ-5 מ"מ, והניחו, בעזרת מלקחיים, לתוך צינורות המכילים RNAlater.

לחלופין, השתמש במתודולוגיות ביופסיה כדי לכרות קטעי רקמה מכל בלוטת לימפה. בחר בכלי ביופסיית האגרוף אם תרצה לאסוף חלקים ספציפיים, כגון זקיקים ספציפיים מהצומת, ולאחר מכן להעביר, בעזרת מלקחיים, ל-RNAlater. לאחר שהדגימות הועברו ל-RNAlater, העבירו אותן בחזרה למעבדה ואחסנו ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר חדירה לרקמות.

לאחר מכן, מסכנים את עודפי ה-RNAמאוחר יותר ומאחסנים דגימות רקמה ב-80 מעלות צלזיוס. יתרון בשימוש בתמיסת שימור RNA הוא שחנקן נוזלי אינו נדרש בנתיחה או באיסוף דגימות מהשדה. לפני הגישה לדגימות, מגיב טריזול מראש לצינורות לצורך הומוגניזציה.

לאחר הוצאת הדגימות מהמקפיא, העבירו אותן מיד למגיב טריזול לעיבוד שלאחר מכן, על סמך המלצות היצרן. כאן, חתיכה של 50-100 מ"ג רקמה מועברת למגיב טריזול. הגבל את ההפשרה לפני הוספת טריזול ככל האפשר.

ניתן להשתמש באחסון על קרח יבש כאשר מוציאים מספר דגימות מהמקפיא לעיבוד. הניחו צינורות על ההומוגנייזר, והומוגניזציה במגיב טריזול. כאן, נעשה שימוש בהגדרת מיצוי RNA של שתי דקות.

בסיום, בדוק אם יש מראה מעונן. חזור על הפעולה במידת הצורך. עקוב אחר פרוטוקול היצרן כדי ליצור שכבות מימיות ואורגניות עבור כל דגימה.

הסר את השלב המימי השקוף העליון בעזרת קצה פיפטה. מעבירים לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. לאחר מכן, מערבבים בנפח שווה של 100% אתנול.

מערבבים היטב. הצינור ייראה לרוב מעונן. בעזרת קצה מיקרו-פיפטה, העבירו את הנוזל לעמוד ספין מסחרי מבוסס סיליקה כדי לטהר עוד יותר ולאחר מכן לסלק את ה-RNA שלכם.

כדי להעריך את איכות ה-RNA, טען ליטר אחד או שניים מדגימת ה-RNA המנופחת לספקטרופוטומטר לניתוח. לאחר השלמת ההליך, אנו צופים ביחסי ספיגה של כ-2 עבור יחס 260-280 ויחס 260-230, מה שמעיד על טוהר גבוה עם העברה כימית מינימלית. ניתן יהיה להבחין בזיהום פנול מירידה ביחס הספיגה של 260-230 ננומטר.

במהלך הליך הנתיחה במקרה של בעלי חיים כמו ביזון, צפינו בפרק זמן של לפחות 20 דקות בין המתת חסד להעברת דגימת הרקמה הראשונה לחומר משמר. לעומת זאת, ניתן להסיר בלוטות לימפה של עכבר ולשמר אותן לאחר המתת חסד תוך דקות ספורות. לכן היינו מעוניינים לאפיין את פרופיל הפירוק של בלוטות הלימפה לאורך זמן.

בכתב היד הראשי ריכזנו גם סיכום של פרופילי יציבות RNA במגוון סוגי רקמות אחרים שנבדקו בפרסומים אחרים. בניסויים מייצגים, שנערכו עם בלוטות לימפה ביזון, יציבות ה-RNA הייתה עקבית יחסית במהלך שעה לאחר המתת חסד. כאן, אנו מתארים תמונת ג'ל של RNA כולל מטוהר מחתיכות של רקמת בלוטות לימפה סופראממרי מביזון אמריקאי.

ממצא זה עולה בקנה אחד עם נתונים קודמים עבור סוגי רקמות אחרים שנאספו מהספרות. זה מצביע על כך שניתן לאסוף דגימות באיכות מקובלת לניתוח במורד הזרם של ביטוי גנים אפילו ממינים מאתגרים יותר כמו ביזון ואיילים. עם זאת, חשוב להעריך כי זמנים ארוכים יותר בין מוות לשימור הדגימה יכולים לגרום לשינויים בפרופילי ביטוי ה-RNA, כולל עלייה בפירוק משלושה תעתיקי mRNA בקצה הראשוני.

לכן עדיין חשוב להשתמש בזרימת עבודה מהירה ויעילה לשחזור רקמות על מנת להפחית עיכוב נוסף ברגע שהחיה זמינה לנתיחה, על מנת להשיג את פרופילי ה-RNA התקפים ביותר מבחינה ביולוגית. בנוסף, נציין כי יש לנקוט בזהירות לאורך כל ההליך כדי למנוע החדרת מזהמי RNA לדגימות לאורך כל התהליך, מעבר לאלו שכבר קיימים ברקמות. זה כולל שימוש בכפפות כחלק מציוד המגן האישי הנדרש האחר.

אנו גם מכניסים את תוצר ה-RNA הסופי למספר צינורות על מנת להגביל ככל האפשר את העצירה החופשית של דגימות RNA. לדוגמה, ניתן לאחסן מכסות נפרדות לשימוש בבדיקות בקרת איכות. לסיכום, בסרטון זה סיפקנו מידע חשוב לשימוש בזיהוי, איסוף, דגימה מייצגת ועיבוד של בלוטות לימפה לניתוח ביטוי גנים במורד הזרם.

בעוד שהסרטון המייצג שלנו הודגם עם דוגמאות של בקר וביזונים, עבדנו גם עם בלוטות לימפה ממינים גדולים אחרים, כולל עזים ואיילים. אנו מקווים שתמצא את הסרטון הזה שימושי בעבודתך, בין אם אתה מדען וטרינרי השוקל להשתמש בשיטות טרנסקריפטומיות בעבודתך, או ביולוג מולקולרי המעוניין לצאת לתחום מדעי בעלי החיים הגדולים.