Name: פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למדו שיטת הטבעה בפרפין וחיתוך דק של ביופילמים חיידקיים לניתוח ביטוי גנים במיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת שימור מורפולוגיה מקורית והדמיה ברזולוציה גבוהה של מבני ביופילם ותבניות ביטוי גנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF הקריירה פרס 1553023 ופרס NIH/NIAID R01AI103369.

1. גידול של Pseudomonas aeruginosa Biofilms המושבה
<ol><li>הכנת לוחות בינוני-Bilayer<ol>
<li>להכין עם 10 גרם/ליטר טריפטון, אגר 10 גרם/ליטר (ראה טבלה של חומרים) פתרון במים יונים.</li>
		<li>אוטוקלב במשך 20 דק מגניב ל 50-60 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.</li>
		<li>שופכים 45 מ של הפתרון אגר-טריפטון לתוך תבשיל מרובע 100 מ"מ x 100 מ"מ (ראה טבלה של חומרים) באמצעות צינור חרוטי 50-mL. לאפשר את אגר לגבש (~ 20-30 דקות). שופכים שכבה שנייה, 15-mL על גבי השכבה הראשונה. תן לחזק בן לילה, הסרת עיבוי של העפעפיים במידת הצורך על ידי מנגב עם טישו נטולת מוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תצפיתנות כלי Biofilms המושבה<ol>
<li>פסים הזנים של ריבית מן המקפיא מניות על פלטות אגר LB13 , דגירה בחושך 12-16 h ב- 37 מעלות צלזיוס ו- 80-100% לחות יחסית.</li>
		<li>עבור כל זן או שכפול, להשתמש מושבה בודדת ועד לחסן 2 מ ל LB דגירה בחושך 12-16 קמ"ש ב 37 ° C עם רועדת-250 סל"ד.</li>
		<li>תת תרבות על ידי דילול מטריים לתוך טריים LB ואת המקננת בחושך 2.5-3 h ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-250 סל"ד.</li>
		<li>למדוד צפיפות אופטית באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהתאים עם LB סטרילי כדי להשיג השעיה תא עם מנת יתר500 nm של ~ 0.5.</li>
		<li>בהתאם המושבה הרצוי גודל, µL pipet 2.5-10 של התא השעיה על צלחת בינונית-bilayer (להכין בשלב 1.1) ולאפשר במקום להתייבש במשך ~ 20 דק. עוזב את המכסה פטרי אג'ר ליד להבה פתוחה יכול להקל על ייבוש.</li>
		<li>דגירה מושבות ספוט-25 ° C ו- 80-100% לחות, בחושך עד 4 ימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. הכנת הפתרון מקבע
<ol><li>להכין את הפתרון לשבועיים ביום של מדגם קציר. לדלל 37% פורמלדהיד (FA) ב- PBS 1 x כדי ריכוז סופי של 4% הפא. התראה: הפא הוא תנודתי, רעיל. ללבוש ציוד מגן ולעבוד בשכונה-fume מאוורר היטב.</li>
	<li>מיד לפני שימוש, להתמוסס L-ליזין הידרוכלוריד ב 4% פא (להכין בשלב 2.1) בטמפרטורת החדר כדי ריכוז סופי של 50 מ מ L-ליזין HCl.</li>
</ol>3. ישירה ליישום של מקבע המושבה Biofilm [אופציונלית]
הערה: מצאנו כי biofilm מורפולוגיה נשמר בצורה הטובה ביותר כאשר הכיסוי אגר נוספת לפני קיבוע. עם זאת, שלב זה מהווה גם שינוי בתנאים סביבתיים יכולים להשפיע על ביטוי גנים. כתב פלורסנט ביטוי דפוסי צריכה ולכן אפשר יהיה לאמתו באמצעות פרוטוקול נפרד שבו הצעד קיבוע מבוצע לפני התוספת של הכיסוי אגר, כפי שמתואר כאן.
<ol><li>ביום של קיבעון, והוא פועל בשכונה-fume מאוורר היטב, pipette מקבע את מוכנה בשלב 2 ישירות אל פני השטח אגר סביב הקצה של המושבה, ולאפשר לו להגיע לפריפריה של המושבה בלי השוקע זה. חלים רק כמו הרבה מקבע כמו יש צורך מלא להקיף את המושבה, כ-500 µL. להתיר את מקבע לנטרל לתוך המושבה, אגר המקיפים.</li>
	<li>ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה ומדיה שמסביב, בערך 20-30 דקות, הפא שיורית אינה גלויה על הצלחת, חזור על שלב 3.1. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב.</li>
	<li>ברגע מקבע כבר מלא נספג לתוך המושבה, מדיה שמסביב חזור על שלב 3.1, הפעם החלת מקבע פני השטח של המושבה ישירות. לאפשר זה מקבע לנטרל לתוך המושבה, על אגר שמסביב, ממשיך לשלב 4 רק אחרי הכל מקבע כבר נספג, אינה גלויה על הצלחת.</li>
</ol>4. overlaying מושבות עם אגר
<ol><li>ביום של קיבעון, להכין 10 גרם/ליטר פתרון אגר מים יונים, החיטוי במשך 10-20 דקות להתמוסס. מגניב באמבט מים כדי 50 הלעפה תרוטרפמט</li>
	<li>שופכים בעדינות 15 מ"ל של הפתרון אגר מדיום הגידול ואת המושבה. לאפשר את אגר ליצירת ג'ל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות (איור 1B).</li>
	<li>השימוש סכין גילוח חדה לחתוך של צ'אק מרובע, 3-שכבה עם המושבה למינציה בין שתי השכבות העליון. אם הכנת דוגמאות מרובים, ודא כי כל צ'אק הוא חתך לגודל דומה.</li>
	<li>הסר בעדינות אגר עודף הצ'אק המכיל מושבת.</li>
	<li>כדי להרים את שתי השכבות העליונות של אגר (המכיל את המושבה) מן השכבה התחתונה של הצ'אק (איור 1C), להרטיב ראש שטוח מרית 1 x PBS או מים ולהוסיף בעדינות בין הרבדים העליונים והתחתונים. המושבה למינציה צריך להפריד בין השכבה התחתונה. יש להיזהר לא לעוות או לכופף את המושבה למינציה בעת הרמת זה מבסיסו.</li>
</ol>5. קיבוע
<ol><li>עובד בברדס fume מאוורר היטב, להעביר מיד המושבה למינציה (קרי, צ'אק 2-שכבה) לתוך קלטת ההטבעה (ראה טבלה של חומרים), שכותרתו עם עט סימון עמיד כימי. למקם את הקלטת ההטבעה למבוטחים שקופיות זכוכית (ראה טבלה של חומרים) המכיל את מקבע שהוכנו בשלבים 2.1-2.2. ודא כי ישנם אין בועות אוויר לכוד בתוך בקלטת ההטבעה.</li>
	<li>דגירה המדגם לשבועיים בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>6. דוגמת עיבוד: מאגר לשטוף, התייבשות, סליקה, הסתננות
<ol><li>לאחר קיבוע בין לילה, לשטוף את הדגימה פעמיים ב- PBS 1 x על 1 h. לקבלת תוצאות מיטביות, להפוך לאוטומטיות המגון ריאגנט להשתמש במהדורה הפונקציה של מעבד רקמות אוטומטית (ראה טבלה של חומרים) מוגדר קביעת ערך נמוך. אם המעבד לא זמין, ניתן להפעיל עיבוד ידני.</li>
	<li>פעל לשטוף את מאגר על-ידי התייבשות באמצעות סדרת דילולים אתנול (EtOH) ב- PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) מדורגת 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מייבשים ב שלושה שוטף של 100% EtOH על 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>נקה המדגם מיובש ב שלושה שוטף של סוכן ניקוי על בסיס שמן תפוז 100% (ראה טבלה של חומרים) עבור 1 h כל בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לחדור הדגימה שנוקה פעמיים עם שעווה מותכת שעווה (ראה טבלה של חומרים), מחומם ל 55˚C, כבר שעתיים כל אחד.</li>
</ol>7. דוגמאות הטבעה
<ol><li>ממלאים תבנית שעווה מותכת פרפין מחומם ל הלעפה תרוטרפמט 55. השתמש מרית מחוממת שטוחים, להעביר במהירות את הצ'אק הסתנן מ בקלטת ההטבעה לתבנית שעווה, המבטיח הצ'אק. מונח מקביל לבסיס התבנית. למנוע הפעלת לחץ יתר על גבי הצ'אק. שעווה בתבניות ייתכן תלת-ממדי מותאמת אישית מודפס, או אינם זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).</li>
	<li>אפשר שעווה לגבש בין לילה-הלעפה תרוטרפמט 4. ניתן לאחסן דגימות יצוק ומצופה בשעווה מוצק ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט.</li>
	<li>לאחר השעווה התחזק, לסלק את הדגימה של העובש ולחיתוך שעווה עודפת מ מסביב הדגימה. עם סכין גילוח. להשאיר עודף שעווה הארכת מקצה אחד של המדגם, מקביל למישור חלוקתה, זה יכול לשמש כדי. תהדק את זה לתוך האזמל הקטן (ראה טבלה של חומרים). גם יוצאים נדן ווקס, כ 1 מ מ עבה, סביב המדגם, להחליק את הפנים שלה.</li>
</ol>8. חלוקתה
<ol><li>חום באמבט מים כדי הלעפה תרוטרפמט 42. תהדק את המדגם לתוך האזמל הקטן עם פני השטח של המושבה מונחה בניצב על קצה הלהב (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>חתוך את הדגימה במרווחים 50-מיקרומטר עד הגיעה למטוס הרצוי של המושבה, שממנו ייאספו מקטעים.</li>
	<li>חותך רצועה של המספר הרצוי סעיפים בעובי 10-מיקרומטר באמצעות מיקרוטום של הגדר מהירות אופטים של 75-80 סל"ד ואת זווית סיווג של 6-10˚ להשתמש במכחול שקצהו הקנס כדי לנתק את רצועת הכלים של הלהב.</li>
	<li>באמצעות טיפת מים בקצה של פסטר פיפטה (מועדפת) או מלקחיים, להעביר בעדינות את רצועת הכלים המים הרותחים. להיות זהירים כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת המקטע.</li>
	<li>מיד להוסיף שקופית לאמבט מים ומקם אותה מתחת לרצועת הכלים בזווית של 45˚.</li>
	<li>לגעת בקצה הצר של רצועת הכלים אל השקופית, רק מתחת לתווית עמומה. רצועת הכלים צריך לדבוק.</li>
	<li>משוך את השקופית מהאמבטיה מים, התאמת הזווית להיות בניצב למשטח של המים, ומאפשר הכלים כדי להשתטח נגד השקופית לאורכו. למנוע השמנה עודף מים מתחת לרצועת הכלים.</li>
	<li>בעדינות לעמוד השקופית אל סופג נטולת רקמות, הפתילה המים העודפים מהסעיף.</li>
	<li>להניח את השקופית על מגבת נייר, ולאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה בחושך. ניתן לאחסן שקופיות ללא הגבלת זמן-4 הלעפה תרוטרפמט בחושך.</li>
</ol>9. חום-תיקון התייבשות, הרכבה
<ol><li>מחממים תנור מפולס כדי הלעפה תרוטרפמט 45. מחממים את השקופית למשך 30-60 דקות. השעווה להיות מותך למחצה ולשטח נגד השקופית.</li>
	<li>בעדינות להרים את השקופית מ הכיריים ושים אותה שטוח על משטח חלק, מפולס, בטמפרטורת החדר, באמצעות טיפול להבטיח כי שעווה מותכת לא למשוך בכל צד של השקופית, עד שהשעווה עפור (~ 1 דקה).</li>
	<li>באמצעות הדיוור שקופיות זכוכית, שעווה מבטל את השקופיות ארבע שוטף של הבהרת סוכן עבור 5 דקות כל אחד, באמצעות ליניקת ביכנר כדי להסיר את הפתרון בין שוטף.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב-100% EtOH עבור 1 דקות כל אחד.</li>
	<li>נתרענן השקופיות בסדרה מדורגת של אתנול בסדר ההפוך של עיבוד (95%, 70%, 50% ו- 25%) 1 דקות, ולאחריו שוטף 1-מין שני ב- 1 x PBS.</li>
	<li>מיד הר הסעיפים במדיום באגירה טריס הרכבה (ראה טבלה של חומרים) ולהחיל על coverslip, הימנעות המבוא של בועות אוויר. לאפשר הרכבה בינוניים עד פולימריזציה ללילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>ברגע polymerized, חותם את coverslip אל השקופית באמצעות לק ברורה. ניתן לאחסן שקופיות אטום ללא הגבלת זמן בחושך-הלעפה תרוטרפמט 4.</li>
</ol>

<ol><li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035(2012).</li>
<li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li>
<li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li>
<li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li>
<li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li>
<li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836(2015).</li>
<li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-642-53833-9_3">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li>
<li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li>
<li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538(2017).</li>
<li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysogeny+at+mid-twentieth+century%3A+P1%2C+P2%2C+and+other+experimental+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li>
<li>Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?</a> Protoplasma. , (2017).</li>
<li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li>
<li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments%3A+fixation+of+pure+actin+filament+pellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li>
<li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דגימות רקמה הטבעה-פרפין, דק-חלוקתה היא טכניקה היסטולוגית הקלאסי מאפשר הדמיה של מבנה מיקרו-מורפולוגי, משמש בדרך כלל על רקמות האיקריוטים ולאחר הוחלה בהצלחה מסוימת על חיידקים דגימות8 ,9. בעוד cryoembedding מאפשר שמירה חזקה של אות אנדוגני, immunofluorescent, פרפין הטבעת היא כלל עדיף כפי ומוצריה יותר מורפולוגיה16. בהתאמת בשיטה זו עבור יישום כדי חיידקים פתוגנים המועברים במזון, התמקדנו מאפיינים ייחודיים למערכת שלנו. התאים ואת מטריצה של רקמות לעי...

רוב החיידקים יש את היכולת ליצור biofilms, קהילות של תאים מחוזק ע י מטריצות מתוצרת עצמית. ניתן לגדל Biofilms בסוגים רבים של כיוונונים פיזית, עם משטרים שונים של הוראה התזונתי, המצע. מבחני ספציפי עבור ביופילמים נוטים להניב מבנים multicellular לשחזור, ואת לארכיטקטורות נפוצות שנצפו phylogenetically מגוון מינים הקהילה או ברמה מאקרוסקופית. כאשר חיידקים גדלים כמו מושבות בינוני מוצק תחת אווירה, מורפולוגיה מאקרוסקופית מוסרת מידע אודות היכולת לייצור מטריקס, לעיתים קרובות עולה בקנה אחד עם אחרים תכונות 1,2,3. הארכיטקטורה הפנימית של מושבות חיידקים יכולים גם לספק רמזים לגבי כימיה biofilm ספציפיים, פיזיולוגיה, אבל היה קשה לאפיין. היישומים האחרונים של טכניקות cryoembedding ו- cryosectioning למושבות חיידקים אפשרו הדמיה והדמיה של תכונות ספציפיות החלטה חסרת תקדים 4,5,6. עם זאת, מחקרים ברקמות בעלי חיים הראו כי פרפין הטבעה ומוצריה מעולה של מורפולוגיה בהשוואה cryoembedding 7 שימש כדי להמחיש חיידקים רקמות 8,9. לכן פיתחנו פרוטוקול קיבוע, פרפין הטבעה של דק חלוקתה של מושבת חיידקים biofilms. כאן, אנו נתאר את הכנת Pseudomonas aeruginosa PA14 המושבה-biofilm דק סעיפים 10,11, אבל אנחנו גם בהצלחה החלת טכניקה זו biofilms הנוצרת על-ידי החיידק Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ו ויבריו cholerae12.
התהליך של הטמעה-פרפין, דק-חלוקתה biofilms עוקב אחר פשוט הגיון. ראשית, biofilms עטוף בשכבה של אגר לשמר מורפולוגיה במהלך העיבוד. שנית, עטוף-biofilms טובע לשבועיים כדי crosslink מקרומולקולות, לשמר את micromorphology. אלה מכן מיובש עם אלכוהול, פינה עם הממס יותר לא קוטביים הינם הסתננו ואז עם פרפין נוזלי. לאחר שחדר, הדגימות מוטבעים לגושי שעווה על חלוקתה. סעיפים לחתוך, רכוב על שקופיות, ואז ולמיומנות כדי להחזיר אותם למצב יותר מקורי. מנקודה זו, ניתן צבעונית או מכוסה הרכבה בינונית לבדיקה מיקרוסקופית.
פרוטוקול זה מייצר חלקים דקים של חיידקים פתוגנים המועברים במזון מתאים לבדיקה היסטולוגית. המושבה biofilm substructures גלויים כאשר סעיפים דקים שהוכן בשיטה זו הם צילמו על ידי מיקרוסקופ אור. Biofilms יכול להיות גם גדל על כתמי פלורסנט המכיל מדיה ספציפיים עבור תכונות בודדות או צבעונית בשלב התייבשות, מייד לפני הרכבה (שלבים 9.5-9.6). לבסוף, ניתן לתכנן חיידקים כדי לייצר חלבונים פלורסנט אופנה מכוננת או מוסדר ומאפשר בחיי עיר הדיווח של התא הפצה או גנים ביטוי בתוך קהילות אלה. השתמשנו בשיטות אלה כדי לקבוע המושבה biofilm עומק תא הפצה, הפצה מטריקס, דפוסי הצמיחה, ייתכן גנים.

<table><tbody><tr><td>5 3/4 אינץ' פיפטה פסטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-6A</td><td>נרכש מחנויות ביולוגיות אוניברסיטאיות&nbsp;</td></tr><tr><td>אגר&nbsp;</td><td>טקנובה&nbsp;</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק שואב בוכנר (ואקום)&nbsp;</td><td>פיירקס</td><td>5340</td><td>נרכש מחנויות ביוגרפיות אוניברסיטאיות&nbsp;</td></tr><tr><td>עט סימון עמיד כימית</td><td>VWR</td><td>103051-182</td><td>יצרן: לק</td></tr><tr><td>שקוף Leica&nbsp;</td><td></td><td></td><td>חנות קנתה</td></tr><tr><td>קונגו אדום מחוון כיתה</td><td>VWR</td><td>AAAB24310-14</td><td>יצרן: אלפא Aesar</td></tr><tr><td>Coomassie Blue&nbsp;</td><td>VWR</td><td>EM-3340</td><td>יצרן: EMD Millipore</td></tr><tr><td>TRIS-buffered מדיום הרכבה (עם DAPI)&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50 247 04</td><td>יצרן: אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td></tr><tr><td>הטמעת עובש&nbsp;</td><td></td><td></td> תבנית הטבעה <td>פנימית מודפסת בתלת מימד</td></tr><tr><td>(מסחרית)&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 200P</td><td>Decon Labs, Inc.&nbsp;</td><td>2701</td><td>נרכש מחנויות ביולוגיות אוניברסיטאיות&nbsp;</td></tr><tr>חנות <td>מברשת</td><td></td><td></td> עדינה <td>נקנתה, מברשת צבע</td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית 60x22 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-519-21C</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית לחות Mailer&nbsp;</td><td>טד פלה</td><td>21043</td><td>20 שקופיות&nbsp;</td></tr><tr><td>Histoclear-II, חומר ניקוי על בסיס שמן תפוז&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50 899 90150</td><td>יצרן: National Diagnostics&nbsp;</td></tr><tr><td>Histosette, הטמעת Casette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15 182 701A</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP386 100</td><td></td></tr><tr><td>להבי מיקרוטום בפרופיל נמוך</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22 210 048</td><td>יצרן: Sturkey&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89080-004</td><td>חבילת פרומו</td></tr><tr><td>טיפים למיקרופיפטה&nbsp;</td><td>ראה סעיף</td><td>הערות ראה סעיף הערות</td><td>עמ' 10 (פישר סיינטיפיק, 02 707 469), עמ' 200 (VWR, 89079-474), עמ' 1250 (VWR, 89079-486)</td></tr> <tr><td>Microtome&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>905200U/00016050</td><td>דגם: HM355S, יצרן: מיקרום, לא קטלוג, קטלוג ספקים # 905200U/00016050</td></tr><tr><td>פורמלדהיד, 37% מימי (פורמלין)Ricca</td> <td>Chemical</td><td>RSOF0010-500A</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Xtra (שעוות פרפין)</td><td>VWR</td><td>15159-486</td><td>יצרן: McCormick Scientific&nbsp;</td></tr><tr><td>ריבוע כלי פטרי 100x100x15 מ"מ</td><td>מוצרים חד פעמיים למעבדה&nbsp;</td><td>D210-16</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי&nbsp;</td><td>EMD כימיקלים&nbsp;</td><td>PX1405-1</td><td>רכיב של מי מלח חוצץ פוספט, מוכן בבית&nbsp;</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P380-500</td><td>רכיב של מי מלח חוצץ פוספט, מוכן בבית&nbsp;</td></tr><tr><td>סכיני גילוח&nbsp;</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>נרכש מחנויות ביולוגיות אוניברסיטאיות&nbsp;</td></tr><tr><td>מחמם שקופיות&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0865259</td><td>ללא קטלוג, קטלוג ספקים # 12857D</td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td>רכיב של מי מלח חוצץ פוספט, מוכן בבית&nbsp;</td></tr><tr><td>נתרן פוספט&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9296.500</td><td>, רכיב של מי מלח חוצץ פוספט, מוכן בבית&nbsp;</td></tr><tr><td>שקופיות היסטולוגיה של סופרפרוסט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים לציפה רקמות&nbsp;</td><td>NC0815797 פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>יצרן: טד פלה, קטלוג ספקים # 28156-B</td></tr><tr><td>מעבד רקמות אוטומטי&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>813160U/Q#00009061</td><td>דגם: מעבד רקמות STP120</td></tr><tr><td>טריפטון&nbsp;</td><td>טקנובה&nbsp;</td>תמצית שמרים <td>T9012</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Teknova&nbsp;</td><td>Y9010</td><td></td></tr></tbody></table>

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

חלוקתה באמצעות הטבעה פרפין היא טכניקה הוקמה באופן כללי במערכות האיקריוטים. כאן, אנו מספקים שיטה הקיבעון, הטבעה, ואת חלוקתה של biofilms בשלמותם המושבה חיידקים באמצעות perfused פרפין. להתאים שיטה זו לשימוש על המושבה biofilms, אנחנו פיתח טכניקות לשמירה על כל דגימה על מצע הגידול שלה, למינציה זה עם overlayer אגר, נוספו ליזין הפתרון מקבע. אלה אופטימיזציות לשפר את שימור הדגימה של שימור תכונות micromorphological. דוגמאות שהוכנו באופן זה נתונות דק חלוקתה והדמיה באמצעות מיקרוסקופ אור, זריחה, שידור. אנחנו החלת טכניקה זו המושבה biofilms של Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis ויבריו cholerae. רמה גבוהה של פירוט הגלויות בדגימות שנוצר על ידי שיטה זו, בשילוב עם זן כתבת הנדסה או השימוש של צבע ספציפי, יכול לספק תובנות מרגש הפיזיולוגיה והפיתוח של קהילות מיקרוביאלי.

שיטה זו יוצרת biofilm דק-סעיפים שבה תכונות מורפולוגיות שונות ואזורי גנים יכולים לדימות על ידי DIC, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, TEM. בעוד DIC הדמיה באמצעות 40 X שמן טבילה המטרה יכול להיות מספיק כדי להראות כמה תכונות מורפולוגיות (איור 2E), מצאנו כי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של זנים מתוכנן חלבון פלואורסצנטי צורונים אקספרס מספקת משופרת ויזואליזציה של התפלגות התא בתוך המדגם (איור דו-ממדי). תמונות של מקטעים בודדים ניתן להשתמש ביריעות...

אנו מתארים קיבעון, פרפין הטבעה וטכניקות דק אופטים עבור biofilms מושבת חיידקים. בדגימות מוכן, דפוסי ביטוי בתיוג וכתבת biofilm ניתן לאבחן באמצעות מיקרוסקופ.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור קטעי ביופילם משובצים בפרפין שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את התפלגות ביטוי הגנים כפי שדווח על ידי ייצור חלבון פלואורסצנטי בתוך מורפולוגיות מקומיות שלמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר קהילות מיקרוביאליות כגון כיצד ביטוי של גנים ספציפיים בייצור חומרים אקסופולימריים מופץ בהקשר של ארכיטקטורת ביופילם מקומית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של ביטוי גנים בתוך המורפולוגיה השמורה של חתכי ביופילם תוך שהיא ניתנת לטיפולים במורד הזרם כגון צביעה של מאפיינים מובהקים והדמיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופ קונפוקלי או אלקטרונים.לאחר הכנת תמיסת טריפטון אגר על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בצינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לשפוך 45 מיליליטר מהתמיסה לכלי מרובע בגודל 100 מילימטר על 100 מילימטר. הניחו לאגר להתמצק במשך כ-20 עד 30 דקות. יוצקים שכבה שנייה של 15 מילימטר על גבי השכבה הראשונה, ואז נותנים לה להתמצק למשך הלילה, ובמידת הצורך משתמשים ברקמה נטולת מוך כדי להסיר עיבוי מהמכסים.לאחר מכן, כדי לזהות ביופילמים של מושבות, לאחר גידול מושבת P.Aeruginosa בודדת ממלאי קפוא על פי פרוטוקול הטקסט, פיפטה 2.5 עד 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים על צלחת דו-שכבתית בינונית. מושבות עשויות להיות מודגרות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של 80 עד 100% למשך

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

הסרטון הבא מתאר כיצד לשמר מורפולוגיה של רקמה באמצעות קיבוע פורמלין והטבעה של פרפין.

שימור רקמות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE): שיטה לחקר מורפולוגיה של רקמות

מקור: Bucher, T., ואחרים, מתודולוגיות לחקר Biofilms של B. subtilis כמודל לאפיון מעכבי ביופילם של מולקולות קטנות. J. Vis. Exp.(2016)הסרטון הזה מדגים את הכנת מושבות ביופילם חיידקיות בוגרות להדמיה ברזולוציה גבוהה. הוא עוסק בשלבי קיבוע, ייבוש, התקנה וציפוי מתכת לשימור והדגשת מורפולוגיית ביופילם.

הכנת מושבות ביופילם חיידקיות לניתוח מורפולוגי

סרטון זה מתאר שיטה לגידול וניתוח איכותי של ביופילמים חיידקיים על קורים פטרייתיים באמצעות מיקרוסקופיה. ביופילמים חיידקיים נוצרים לעתים קרובות על משטחים פטרייתיים וכוללים תהליכי אינטראקציה חיידקיים-פטרייתיים רבים, כגון שיתוף פעולה מטבולי, תחרות או טריפה.

שיטה להכנת דגימות כדי לדמיין חיידקים יוצרי ביופילם על קורים פטרייתיים

מחקר זה מציג את הפיתוח של מתודולוגיות הניתנות לשחזור לחקר מעכבי ביופילם והשפעותיהם על Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לגדול ואיכותי לנתח biofilms חיידקים על עובש פטרייתי על ידי מיקרוסקופ confocal אלקטרונים.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים, חזקים ומשלימים לביצוע הדמיית צביעה ורזולוציה תת-תאית של מודלים קבועים של תרביות תאים תלת-ממדיות בטווח של 100 מיקרומטר עד מספר מילימטרים, ובכך מאפשרים הדמיה של המורפולוגיה, הרכב סוג התא והאינטראקציות ביניהם.

צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה מודולרי מסוג BSL-2 המשלב בדיקות ביומסה קריסטל-סגולה, קינטיקת פאזה-ניגודיות טיים-לאפס, מיפוי קונפוקלי תלת-ממדי/מטריצות, מבנה SEM אולטרה-סטרוקטיבי, ומודול זיהום אוגר ב-vivo לטיפוח, כמות, אפיון וחקר תפקיד פונקציונלי של ביופילם לפטוספירה , ומאפשר הערכה סטנדרטית של מוטנטים והתערבויות אנטי-ביופילם במעבדות.

תהליך עבודה מודולרי לניתוח כמותי, מבני ופונקציונלי של ביופילמים של לפטוספירה

המושבה להרכיב (CFC) assay התא assay במבחנה שבה אבות hematopoietic טופס מושבות בינוני חצי מוצק. שילוב של מורפולוגיה המושבה, מורפולוגיה התא cytometry זרימה משמשים כדי להעריך את היכולת של אבות להתרבות להבדיל לאורך שושלות hematopoietic שונים.

יצירת המושבה Cell (CFC) Assay עבור תאים hematopoietic האדם

למדו שיטת הטבעה בפרפין וחיתוך דק של ביופילמים חיידקיים לניתוח ביטוי גנים במיקרוסקופיה. שיטה זו מאפשרת שימור מורפולוגיה מקורית והדמיה ברזולוציה גבוהה של מבני ביופילם ותבניות ביטוי גנטי.

פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים