פרפין הטבעה ואת חלוקתה דק של מושבת חיידקים Biofilms לבדיקה מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור קטעי ביופילם משובצים בפרפין שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את התפלגות ביטוי הגנים כפי שדווח על ידי ייצור חלבון פלואורסצנטי בתוך מורפולוגיות מקומיות שלמות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר קהילות מיקרוביאליות כגון כיצד ביטוי של גנים ספציפיים בייצור חומרים אקסופולימריים מופץ בהקשר של ארכיטקטורת ביופילם מקומית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח של ביטוי גנים בתוך המורפולוגיה השמורה של חתכי ביופילם תוך שהיא ניתנת לטיפולים במורד הזרם כגון צביעה של מאפיינים מובהקים והדמיה ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופ קונפוקלי או אלקטרונים.

לאחר הכנת תמיסת טריפטון אגר על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בצינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי לשפוך 45 מיליליטר מהתמיסה לכלי מרובע בגודל 100 מילימטר על 100 מילימטר. הניחו לאגר להתמצק במשך כ-20 עד 30 דקות. יוצקים שכבה שנייה של 15 מילימטר על גבי השכבה הראשונה, ואז נותנים לה להתמצק למשך הלילה, ובמידת הצורך משתמשים ברקמה נטולת מוך כדי להסיר עיבוי מהמכסים.

לאחר מכן, כדי לזהות ביופילמים של מושבות, לאחר גידול מושבת P.Aeruginosa בודדת ממלאי קפוא על פי פרוטוקול הטקסט, פיפטה 2.5 עד 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים על צלחת דו-שכבתית בינונית. מושבות עשויות להיות מודגרות בחושך בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בלחות יחסית של 80 עד 100% למשך עד ארבעה ימים. יוצקים בעדינות 15 מיליליטר מתמיסת האגר על מצע הגידול והמושבה ומאפשרים לאגר ליצור ג'ל בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך צ'אק מרובע תלת שכבתי כשהמושבה למינציה בין שתי השכבות העליונות. אם מכינים מספר דגימות, ודא שכל צ'אק נחתך לגודל דומה. הסר בעדינות את כל האגר העודף מהמושבה המכילה צ'אק.

לאחר מכן, הרטיבו את הראש השטוח של מרית ב-PBS או במים והכניסו אותו בעדינות בין שכבות האגר העליונות והתחתונות. העבירו מיד את מושבת הלמינציה לקלטת הטבעה המסומנת בעט סימון עמיד בפני כימיקלים. הנח את קלטת ההטבעה בדואר שקופיות זכוכית המכיל קיבוע שהוכן בעבר.

עבד את הדגימות. השתמש ב-1X PBS כדי לשטוף אותם פעמיים למשך שעה כל אחד. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הפוך את הומוגניזציה של ריאגנטים לאוטומטית באמצעות ההגדרה הנמוכה בפונקציית הסיבוב של מעבד רקמות אוטומטי.

כדי להטמיע את הדגימות, מלאו תבנית שעווה בשעוות פרפין מותכת המחוממת ל-55 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן השתמשו במרית שטוחה ומחוממת כדי להעביר במהירות את הצ'אק שחדר מקלטת ההטבעה לתבנית השעווה כדי להבטיח שהצ'אק מונח במקביל לבסיס התבנית. הניחו לשעווה להתמצק למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. דגימות יצוקות בשעווה מוצקה עשויות להיות מאוחסנות ללא הגבלת זמן בטמפרטורה זו.

לאחר שהשעווה התמצקה, הוציאו את הדגימה מהתבנית והשתמשו בסכין גילוח כדי לקצץ עודפי שעווה מסביב לדגימה. השאירו מעט שעווה המשתרעת מקצה אחד של הדגימה שניתן להשתמש בה כדי להדק אותה לתוך המיקרוטום. חשוב לקצץ את הדגימה המוטבעת בשעווה כך שצורתה תקל על איסוף סרטים ליניאריים חלקים.

פגמים קטנים בחיתוך עלולים לייצר חפצים בסרט ולפגוע בשלמות הקטע. לאחר מכן, מחממים אמבט מים ל 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מהדקים את הדגימה לתוך המיקרוטום כשפני המושבה מכוונים בניצב לקצה הלהב.

חתוך את הדגימה במרווחים של 50 מיקרומטר עד שמגיעים למישור הרצוי של המושבה שממנו ייאספו קטעים באמצעות מיקרוטום המוגדר למהירות חתך של 75 עד 80 סל"ד וזווית מרווח של שש עד 10 מעלות. חותכים סרט במספר הרצוי של קטעים בעובי 10 מיקרומטר. לאחר מכן, השתמש במברשת צבע עדינה כדי לנתק את הסרט מהלהב.

כעת, בעזרת מלקחיים או טיפת מים בקצה פיפטת פסטר, העבירו בעדינות את הסרט לאמבט המים. הכנס מיד מגלשה לאמבט המים ומקם אותה מתחת לסרט בזווית של 45 מעלות. גע בקצה הצר של הסרט בשקופית שמתחת לתווית החלבית.

הסרט צריך להידבק. משוך את המגלשה החוצה מאמבט המים והתאם את הזווית כך שתהיה בניצב לפני המים ומאפשר לסרט להניח שטוח כנגד המגלשה לאורכו. הימנע מלכידת עודפי מים מתחת לסרט.

העמידו בעדינות את המגלשה על טישו סופג נטול מוך המנדף עודפי מים מהקטע. לאחר מכן, הניחו את השקופית על מגבת נייר והניחו לה להתייבש בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. מחממים פלטה חמה מפולסת ל -45 מעלות צלזיוס ומניחים את השקופית על הצלחת למשך 30 עד 60 דקות.

השעווה תהפוך למותכת למחצה ותשתטח כנגד המגלשה. הרם בעדינות את השקופית מהפלטה החמה והניח אותה שטוחה על משטח חלק בטמפרטורת החדר למשך כדקה עד שהשעווה מתמצקת. ודא שהשעווה המותכת לא נמשכת לשני צידי המגלשה.

עם הדגימות בתוך דואר שקופיות זכוכית, הסר את השקופיות בשעווה בארבע שטיפות של חומר ניקוי למשך חמש דקות כל אחת. השתמש בשואב בוכנר כדי להסיר תמיסה בין כביסות. השתמש ב-100% אתנול כדי לשטוף את השקופיות שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת.

לאחר מכן, לאחר ייבוש השקופיות בהתאם לפרוטוקול הטקסט, הרכיב מיד את החלקים במדיום הרכבה עם חוצץ טריס והחל כיסוי. אגר הכיסוי סביב הקטע אינו מגיב עם הקיבוע, ולכן הוא אינו נצמד לשקופית המנגולד. אגר זה יכול לעקור במהלך ההתייבשות ולפגוע בקטע, לכן יש להקפיד לא לעורר את התמיסה במהלך ההתייבשות.

אפשר למדיום ההרכבה להתפלמר בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לאחר הפילמור, השתמש בלק שקוף כדי לאטום את הכיסוי לשקופית. לבסוף, אחסן את השקופיות האטומות ללא הגבלת זמן בחושך בארבע מעלות צלזיוס.

בעוד שהדמיית DIC באמצעות מטרת טבילה בשמן פי 40 יכולה להספיק כדי להראות כמה מאפיינים מורפולוגיים של חתכים דקים של ביופילם, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זנים שהונדסו לבטא באופן קונסטרוקטיבי חלבונים פלואורסצנטיים מספקת הדמיה משופרת של התפלגות התאים בתוך הדגימות. כפי שמוצג בפאנלים אלה, ניתן לתפור תמונות של קטעים בודדים יחד כדי ליצור חתך רוחב של המושבה כולה ולספק הקשר ללוקליזציה של מאפיינים מבניים בתוך המורפולוגיה הכוללת ברמה המקרוסקופית. שימוש בזן המהונדס לבטא חלבון פלואורסצנטי בשליטת מקדם ספציפי מאפשר הדמיה של התפלגות ביטוי הגנים.

בנוסף, ניתן לגדל מושבות על צבעים המכילים מדיום, או להוסיף צבעים לאחר החיתוך לפוליסכרידים הספציפיים של הכתמים. לבסוף, ניתן גם להכין ולצלם דגימות ברזולוציה גבוהה יותר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כפי שמוצג כאן. חשוב כאשר מנסים הליך זה להיות מודעים לנרתיק הדגימות ולפוטנציאל להכניס חפצים פלואורסצנטיים ומבניים באמצעות קיבוע, חתך או התייבשות מחדש שעשויים להשפיע על הפרשנות שלך לנתונים.

הליך זה מאפשר ניתוח תמונה כמותי כגון מתאם פרופילי הביטוי של מדווחים פלואורסצנטיים עם תכונות מורפולוגיות וציר ה-Z של ביופילם. ניתן ליישם פרוטוקול זה על מינים מגוונים של חיידקים יוצרי ביופילם בעלי משמעות רפואית ותעשייתית כגון Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae ו-Bacillus subtilis. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל ולהכין ביופילמים של מושבות לחיתוך באמצעות הטמעת פרפין.