Name: וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: למד טכניקות שונות של צביעת שלילי למיקרוסקופ אלקטרונים להדמיית מבנים מולקולריים ביולוגיים. השיטות מדגימות הכנת רשתות פחמן ושימוש בכתמי לנתנידים לקבלת תמונות ברורות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. אנחנו מאוד אסירי תודה. אל פיטר פרש על דיונים מועילים, סקירה ביקורתית של כתב היד. ברצוננו להודות לכל חברי צוות המעבדה Biostructure אסטבורי לדיונים מועיל ולמעבדות של ניל Ranson, של סטיבן Muench. עבודה זו מומן על ידי המועצה האירופית למחקר (האיחוד FP7/2007-2013) / ERC להעניק הסכם 322408. C-חלבון הופק באמצעות המשאבים המסופקים על ידי מענק קרן לב (BHF פ ג/13/83/30485). אנו מודים גם טרסט עבור ציוד מימון לתמוך מיקרוסקופ אלקטרונים בלידס (090932/Z/09/Z ו- 094232/Z/10/Z). CS ממומן על ידי מענק Wellcome אמון ISSF.

<ol><li>Merk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+Cryo-EM+Resolution+Barriers+to+Facilitate+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery.</a> Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Ha, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+complete+COG+tethering+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the complete COG tethering complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 758-760 (2016).</li>
<li>Burgess, S. A., Walker, M. L., Thirumurugan, K., Trinick, J., Knight, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+negative+stain+and+single-particle+image+processing+to+explore+dynamic+properties+of+flexible+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of negative stain and single-particle image processing to explore dynamic properties of flexible macromolecules.</a> J Struct Biol. 147 (3), 247-258 (2004).</li>
<li>Fabre, L., Bao, H., Innes, J., Duong, F., Rouiller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative-stain+single+particle+EM+of+the+maltose+transporter+in+nanodiscs+reveals+asymmetric+closure+of+MalK2+and+catalytic+roles+of+ATP%2C+MalE+and+maltose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Negative-stain single particle EM of the maltose transporter in nanodiscs reveals asymmetric closure of MalK2 and catalytic roles of ATP, MalE and maltose.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+negative-staining+protocol+of+electron+microscopy+for+apoE4+POPC+lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">An optimized negative-staining protocol of electron microscopy for apoE4 POPC lipoprotein.</a> J Lipid Res. 51 (5), 1228-1236 (2010).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol Proced Online. 6 (1), 23-34 (2004).</li>
<li>Haschemeyer, R. H., Myers, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaschemeyer%2C+RH+%22Negative+Staining+in+Principles+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%22">Negative Staining in Principles and Techniques of Electron Microscopy</a>. 2, Van Nostrand. 101-147 (1972).</li>
<li>Massover, W. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304399193900508">Positive staining of protein molecules for electron microscopy: polyiodination of the apoferritin shell in ferritin.</a> Ultramicroscopy. 52, 383-387 (1993).</li>
<li>Harris, J. R., Bhella, D., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.microscopy-analysis.com/magazine/issues/recent-developments-negative-staining-transmission-electron-microscopy">Recent Developments in Negative Staining for Transmission Electron Microscopy.</a> Microsc Microanal. 20, 17-21 (2006).</li>
<li>Hosogi, N., Nishioka, H., Nakakoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lanthanide+salts+as+alternative+stains+to+uranyl+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lanthanide salts as alternative stains to uranyl acetate.</a> Microscopy (Oxf). 64 (6), 429-435 (2015).</li>
<li>Zhao, F., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J Struct Biol. 141, 43-52 (2003).</li>
<li>Cao, B., Xu, H., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+as+a+tool+to+image+bioinorganic+nanohybrids%3A+the+case+of+phage-gold+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy as a tool to image bioinorganic nanohybrids: the case of phage-gold nanocomposites.</a> Microsc Res Tech. 74 (7), 627-635 (2011).</li>
<li>Imai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+shows+superposition+and+large+scale+flexibility+within+cytoplasmic+dynein+motors+moving+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct observation shows superposition and large scale flexibility within cytoplasmic dynein motors moving along microtubules.</a> Nat Commun. 6, 8179(2015).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+from+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li>
<li>Kendall, A., McDonald, M., Stubbs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+determination+of+the+helical+repeat+of+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Precise determination of the helical repeat of tobacco mosaic virus.</a> Virology. 369 (1), 226-227 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Bio. 415 (2), 406-418 (2012).</li>
<li>Bremer, A., Henn, C., Engel, A., Baumeister, W., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Has+negative+staining+still+a+place+in+biomacromolecular+electron+microscopy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Has negative staining still a place in biomacromolecular electron microscopy?</a> Ultramicroscopy. 46, 85-111 (1992).</li>
<li>Garewal, M., Zhang, L., Ren, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-62703-275-9_6">Lipid-Protein Interactions. Methods Mol Biol (Methods and Protocols)</a>. Kleinschmidt, J. 974, Humana Press. 111-118 (2012).</li>
<li>Walker, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-headed+binding+of+a+processive+myosin+to+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two-headed binding of a processive myosin to F-actin.</a> Nature. 405 (6788), 804-807 (2000).</li>
<li>Orlova, E. V., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Macromolecular+Assemblies+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Macromolecular Assemblies by Electron Microscopy.</a> Chem Rev. 111 (12), 7710-7748 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כתב יד זה מתאר שיטות מרובות עבור צביעת שלילי של דגימות של מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות מגוון של צביעת ריאגנטים, כולל שני ריאגנטים לנתניד הרומן (TmAc ו- ErAc). רבים מן השלבים של תהליך צביעת שלילי חייב להיות אופטימיזציה עבור דוגמאות בודדות כולל הבחירה של הכתם, כמות כביסה הנדרשים, אם בכלל, הטכניקה blotting. כתב יד זה ובכך מספק בסיס microscopists לפתח זרימות עבודה משלהם להתמודדות עם השלילי-צביעה של מערכות מאתגר.
הבחירה של כתם היא מאוד לטעום התלויים. דגימות צמחים רגישים במיוחד pH נמוך עשוי להיות מושפל UA ו/או UF, למרות המאפיינים לשבועיים של אלה כתמי19. במקרים אלה, לנתניד מבוסס כתמים כגון TmAc או ErAc עשוי להיות מתאים יותר, למרות רמת ה-pH הכללי של התכשיר חייב להישמר מתחת נקודה איזואלקטרית של החלבון לדוגמה כדי לסייע במניעת מכתים חיובי. זה יכול להתבצע על ידי acidifying את הכתם עם חומצה אצטית במידת הצורך. לקבלת דוגמאות רגיש pH נמוך במיוחד, כתמים tungstate או molybdate anionic עשוי להיות יעיל יותר. למרות הכתמים האלה נמצאו כדי לגרום להיווצרות חפצים במקרים מסוימים, כגון היווצרות של rouleaux ב ליפופרוטאין דוגם20. שוב, אולי ה-pH של הכתם צריכים להיות מותאמים, הפעם כדי מעל נקודה איזואלקטרית של המדגם, כדי למנוע כתמים חיובי.
כביסה של המדגם לפני צביעת עשוי להיות נחוץ אם המאגר שבו נשמר את הדגימה יש רכיב גבוה של מלח או פוספט. במקרים רבים, כביסה יכול להתבצע עם הנדסה גנטית מים אך עבור דגימות יותר רגישים, אשר עשוי לפגוע או עוברים שינויים מבניים כאשר הם נחשפים מים לבד, כביסה יתכן שיהיה צורך לבצע עם מאגר הנפיצה של עוצמת יוניים נמוכה8. אפילו בתנאים מבוקרים בקפידה, כביסה יכול לגרום כמה מבניים סידורם מחדש על פני השטח פחמן21.
השיטה שבאמצעותה רשת מוכן מבחינת מדגם ספיחה, סופג, צביעת יכול גם להשפיע באופן משמעותי על תצפית. השיטה המתאימה ביותר היא לכן, שוב, מאוד לטעום התלויים. C-חלבון, לדוגמה, הוא ציין כאל מבנה טבעתי הכדוריים בעקבות צד-כתם מכתים, אבל נראה לי חפץ של תהליך צביעת, כפי גילה כאשר רשתות מוכנות בשיטת יתנגש (או בשיטת שטיפה מהירה) (איור 3 ). בשיטות יתנגש ומהירה שטיפה, הזמן שהדגימה יש לקיים אינטראקציה עם הפחמן תמיכה השטח לפני קיבוע הוא ממוזער15. המדגם גם חוויות פחות כוחות מ מניסקוס נסוגים על סופג לפני קיבוע. משמעות הדבר היא כי ביצוע שינויים מבניים הדגימה שעלולות להתרחש בעת הקליטה ממושך זמן על הסרט פחמן או דרך פעולה נימי הן מזעריות. השיטה שטיפה מהירה יכולה לשמש גם לניתוח זמן לפתור של דגימות. המדגם ניתן לערבב עם ליגנד או כתוסף בתוך טיפ פיפטה ערכה תקופה של זמן לפני יישום רשת או רק באופן זמני על פני הרשת לפני קיבוע בתוך אלפיות השנייה.
העומק של כתם הנדרשים לאספקת תמונות אופטימלית של הדגימה מסוים הוא שוב תלוי מדגם2. אם הכתם הוא רדוד מדי, מולקולות עלולים להיפגע על ידי כשקרן האלקטרונים אבל אם הכתם סמיך מדי תכונות מבניות יכול ללכת לאיבוד. עומק הכתם מושפע על ידי גורמים רבים כגון hydrophilicity של פני השטח רשת, שויון של השכבה פחמן, הסכום של כתם חלה על הרשת, משך הזמן הכתם נמצא בקשר עם הרשת לפני סופג, היקף סופג והפעם זה טא kes עבור הרשת כדי יבש לחלוטין. רשת שלעולם לא יהיה ריפודי כתופיים של כתם על פני כולו, לכן אזורים של הרשת המתאים עבור הדמיה צריך לבחור בקפידה. אכן, רשתות להשתנות לעיתים קרובות איכות גם כאשר מוכן באותו יום תחת באותם התנאים. דוגמא טובה איך בו וריאציה לעומק הכתם משפיע על המראה של מולקולות ואת עומק הכתם המתאים עבור הדמיה ניתנת על ידי ברג'ס ואח5.
למרות שלילי מכתימים שיטה מאוד תכליתי מהירה, פשוטה, לא כל דגימות ביולוגיות נתונות ויזואליזציה בשיטה זו. הרכבות שביר יכול לכווץ או לפרק על ספיחה, מכתים או ייבוש על רשת EM22. צביעת שלילי יכול גם להוביל שיטוח של מולקולות, זירוז אוריינטציות המועדפת של מולקולות על הסרט תמיכה7פחמן.
כתם שלילי הוא כלי רב ערך עבור הערכה של דגימות בזכות עצמו, וגם לפני ניתוח הקפאה-EM אבל רבים של כוחות פיזיים שהמדגם מפגשים במהלך התהליך הם הבינו. לכן, הגישה הטובה ביותר לשימוש היא מאוד לטעום התלויים, צריכה להיקבע על ידי משפט--שגיאה ולא לימדתי בעקבות פרוטוקול קבוע.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57199/variations-on-negative-stain-electron-microscopy-methods-tools-for">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems</a>. An&#160;author&#160;name&#160;was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Matthew G. Iadaza
to:
Matthew G. Iadanza

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/57199/variations-on-negative-stain-electron-microscopy-methods-tools-for">Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems</a>. An&#160;author&#160;name&#160;was updated.

Erratum: Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

למרות תשומת לב לאחרונה הרזולוציה המהפכה הנובע התקדמות משמעותית הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ1 (הקפאה-EM), שלילית כתם EM שרידים טכניקה חזקה והוא מרכיב חיוני של ארגז הכלים של אלקטרון microscopists. צביעת שלילי נותרה השיטה הטובה ביותר עבור הערכה מהירה של מדגם לפני מיטוב תנאי הקפאה-רשת2. חדות גבוהה ואת המהירות של רשת הכנת דוגמאות מוכתם שלילי הופך אותו לאידיאלי עבור הערכת מדגם טוהר, ריכוז, הטרוגניות, גמישות הסתגלותי3. מבנים רבים ביולוגית אינפורמטיבי נבעה שחזורים כתם שלילי, למרות הרזולוציה של הטכניקה מצטמצם ~ 18 Å רזולוציה4,5,6, ו כמה דגימות להניב תוצאות טובות יותר בכתם הקפאה-EM עבור מגוון רחב של סיבות7.
בכתם שלילי EM, החלקיק עניין הספוחה על פני רשת EM, עטוף בקליפה מטריקס אמורפי של אלקטרון כתם צפופה המורכבת. ניגוד היחסית גבוהה המיוצר בין הרקע לבין החלקיק מעניינים, עם החלקיק להיות אלקטרונים פחות צפוף מאשר הכתם שמסביב8. החלקיקים מופיעים אזורים בהירים בגלל כוחם פיזור האלקטרונים נמוכה יחסית הכתם שמסביב צפופה, אשר מחליקי האלקטרונים יותר נראית כהה. תכונות substructural של חלקיקים יכול להסיק מכל בחינה מפורטת של תמונות תוצאות כמו כתם לחדור לתוך הבקיע בכל ולייצר את הניגודיות לא סדירה פרט9.
מתחיל תהליך צביעת שלילי עם הכנת מצע תמיכה בו החלקיקים מדגם נלכדים, השכבה של הכתם מיובשים נתמך. המצע התמיכה הנפוצות ביותר היא שכבה של פחמן אמורפי, לפעמים נתמך על ידי שכבה דקה של פוליוויניל (למשל Formvar) או פולימר ניטרוצלולוזה (למשל Collodion). מצעים אלה ניתן לרכוש מסחרית או מוכן ללא צורך במיקור חוץ באמצעות פרוטוקולים המתוארים להלן.
לאחר המצע תמיכה מוכן, ניתן להחיל את הדגימה, הפתרון עודף מחק את. דוגמאות המחבוש במאגר מתאים עבור מכתים שלילי. עדיף למנוע השימוש של מאגר פוספט, ריכוז המלח גבוה, אשר יכולים להצמיח פוחת משקעים גבישיים זה ניתן להסתיר את הדגימה. צמצום סוכנים, דטרגנטים, סוכרוז, גליצרול, ריכוזים גבוהים של נוקלאוטיד יש גם להימנע ככל הם גם משפיעים על איכות הכתם4. כאשר הרכב המאגר לא ניתן לשנות, שטיפת המשטח של הרשת EM עם מים או מאגר מתאים יותר לאחר ספיחה, לפני צביעת עשוי להפחית את היווצרות של מאגר הקשורים חפצים ולשפר באופן כללי על רקע הכתם. אם מאגר חפצים חשודים, זה יכול להיות אינפורמטיבי כתם רשת מאגר בלבד כדי לקבוע אם הרכיבים מאגר הם המקור של הממצאים שנצפו.
לאחר המדגם הספוחה, מחק ואני שטפתי במידת הצורך, ריאגנט מכתימים מוחל. מגוון רחב של ריאגנטים נמצאו להיות כתמים שליליים יעיל (טבלה 1), אבל הכתם להיבחר כדי להתאים את הדגימה. 'הילה' של הכתם צורות סביב החלקיק בשל שני העקירה של מולקולות כתם על ידי האזורים הידרופוביות של חלבונים ודחיה מאת טעונה קבוצות. לכן, הכתם להיבחר כך המדינה פרוטונציה של כל קבוצות טעונות פוטנציאליים על החלבון היא זהה לזו של הכתם על ה-pH עבודה. מול האשמות על פני השטח של החלבון יכול לתרום מכתים חיובית השפעה, אשר למרות טכניקה שימושית משלו נכון10 אינו בתוך הטווח של מאמר זה. ריאגנטים מכתימים שליליות הנפוצות ביותר הן uranyl אצטט uranyl formate. הכתמים האלה יש גודל גרעין קטן יחסית (4-5 Å)9 לספק תמונות ברזולוציה גבוהה מעל כתמים אחרים כגון פוספו-טונגסטטים (8-9 גודל גרגר Å)9,11, אמוניום molybdate11, וחלק מבוסס לנתניד כתמי12. Uranyl אצטט, formate משמשים גם מקבע, שמירה על אינטראקציות חלבון-חלבון רבים ב מילי-שניות זמן בקנה מידה13, למרות ה-pH נמוך של הכתם, הנטייה שלו, כדי לזרז ב- pH פיזיולוגיים. עלולים לפגום דגימות14 . למרות השירות שלהם, המלחים uranyl מציגים גם אתגרים לוגיסטיים כפי שהם הם רעילים והן רדיואקטיבי במתינות, אשר עשויים לדרוש טיפול מיוחד, אחסון, ודרישות לרשות, אשר מוביל חלק מהמשתמשים לחפש חלופות לא רדיואקטיבי.
יש מגוון גדול של שיטות המתואר לשם הכנת הרקע, דוגמת יישום, ו מכתים של רשתות EM. השיטה המתאימה ביותר לשימוש מדגם תלויות, יכולים להיות קשה לאמת כאשר בהתמודדות עם מערכת חדשה. כתב יד זה מתאר שתי שיטות של הכנת הרקע ואת שלוש שיטות סופג; בצד סופג, יתנגש5ורפיד שטיפה15. סופג צד הוא הפשוט ביותר של שיטות המתוארות. השיטה יתנגש והן בשיטת שטיפה מהירה קשים יותר ליישם אבל להגביל את משך הזמן קשר המדגם עם הסרט תמיכה לפני קיבוע, הוכחו להפחיתם להיווצרות כתם, פריטים כמה דוגמאות5. המטרה של כתב יד זה היא לפיכך לספק זרימת עבודה ראשונית עבור בהתמודדות עם הפריט החזותי של מערכות מאתגר על ידי EM שלילית-כתם.

<table><tbody><tr><td>200 רשת נחושת EM רשתות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4776-1VL</td><td>ניתן להשתמש גם בחומרים אחרים ו/או בגדלים של רשת</td></tr><tr><td>אמוניום מוליבדט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>מאייד פחמן</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>9620</td><td>Cressington 208 או שווה ערך</td></tr><tr><td>תמיסת קולודיון 2% באמיל אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>9817</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 פינצטה בלחץ שלילי</td><td>World Precision Instruments</td><td>501202</td><td>או פינצטה אחרת לפי העדפת</td></tr><tr><td>ארביום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>325570</td><td></td></tr><tr><td>גדוליניום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>325678</td><td></td></tr><tr><td>דפי נציץ. 75x25x0.15 מ"מ.</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG250-1</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות, לבן חלבי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12607976</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10018130</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>פסטר פיפטה (זכוכית)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>10343663</td><td>או</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td> שווה ערך <td>פישר סיינטיפיק</td><td>11904325</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>נייר</td><td></td> זכוכית חנות <td>לחומרי בניין</td><td>נייר זכוכית רטוב ויבש עם חצץ עדין יותר ש 200 (600 מוצע)</td></tr> <tr><td>סמריום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>325872</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.06462</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספוטונגסטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6395</td><td></td></tr><tr><td>רשת נירוסטה, 150x150 מ"מ (חתוך לגודל).</td><td>AGAR Scientific</td><td>AGG252</td><td></td></tr><tr><td>Thulium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>367702</td><td></td></tr><tr><td>מוט פחמן דו-שלבי חד יותר, עבור מוטות 1/4 אינץ'</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>57-10</td><td>או שווה ערך למאייד פחמן בשימוש</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td></td><td>טהורים במיוחד</td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Formate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>שומן ואקום</td><td>Fisher Scientific</td><td>12719406</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Whatman #1 נייר סינון.</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1001 090</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>Whatman #40 נייר סינון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10674122</td><td>או שווה ערך</td></tr></tbody></table>

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems

מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי (EM) מאפשר התבוננות פשוטה ומהירה יחסית של מקרומולקולות, מתחמי macromolecular באמצעות הניגוד שיפור ריאגנט הכתם. ולמרות שהוא מוגבל מבחינה ברזולוציה מקסימלית של ~ 18-20, כתם שלילי EM שימושי למגוון רחב של בעיות ביולוגיות ומספק גם אמצעי מהיר של הערכת דגימות של הקפאה-מיקרוסקופ (הקפאה-EM). כתם שלילי זרימת העבודה היא שיטה פשוטה; הספוחה היא הדגימה על גבי מצע, ואז כתם הוא מוחל, מחק, מיובשים כדי לייצר שכבה דקה של אלקטרון כתם צפוף שבו מוטמעים החלקיקים. דוגמאות בודדות יכול, לעומת זאת, להתנהג בדרכים שונות במידה ניכרת תחת משתנים התנאים מוכתמים. זה הוביל לפיתוח מגוון רחב של טכניקות להכנת מצע, שלילי מכתים ריאגנטים, ורשת כביסה החיוורים ומכתים טכניקות. קביעת השיטה המתאימה ביותר עבור כל דגימה בודדת צריך להיעשות על בסיס מקרה לגופו, microscopist חייבת להיות לך גישה למגוון רחב של טכניקות שונות כדי להשיג את התוצאות כתם שלילי האיכותי. פרוטוקולים מפורט עבור שתי שיטות הכנה של סובסטרט שונים, שלוש טכניקות שונות סופג הינם מסופקים, ושיחות דוגמה מדגם המציג תוצאות שונה במידה ניכרת בהתאם שיטת מוצג. בנוסף, הכנת כמה נפוץ ריאגנטים מכתימים שלילי, שני חדשניים מבוססי לנתניד כתמים, מתואר עם דיון בנוגע לשימוש של כל אחד.

כל ריאגנטים מכתימים נבדק הפיק מכתים שלילי במידה מסוימת, עם UF מניב את הדגימות עם הניגוד הגדול בין חלקיקים החדה, מפורט ביותר. עבור דוגמאות מוטבעות עמוק (איור 1) לנתניד מבוסס כתמים ErAc ו- TmAc המיוצר מכתים שלילי של איכות שוות ערך ל UA כפי שפטו את חדות לעין וחדות של החלקיקים מוכתם, עם TmAc בהפקת ברורה, תמונות חדות יותר יותר ErAc. למרות גודל גרגרים גדולים יותר TmAc הופך לכאורה בהגדלה גדולה, כאשר חלקיקי נגיף פסיפס הטבק (TMV) היו מוכתמים 1% TmAc ~ 23 Å חוזר של החלקיק TMV17 , עדיין היה נראה בבירור בעין וכן שכבת meridional שורה ב- התמרת פורייה של תמונת raw. אף אחד השני לנתניד הכתמים נבדק, ErAc, SmAc, או GdAc, הצליחו לפתור תכונה זו. מחלקה ממוצעים נוצרו על-ידי חילוץ מקטעים חופפים חלקיקים TMV איפה חזור לוליינית היה גלוי. הקטעים שחולצו היו ואז מיושר, מסווג באמצעות RELION18 משופרת בתכונת תקופתי (איור 2).
כמה דוגמאות הן רגיש במיוחד לשיטת מכתים, כגון השריר נגזר C-חלבון. C-חלבון, אשר מורכב של מחרוזת גמיש Ig ותחומים כמו Fn, מייצרת תמונות שונות באופן משמעותי על ידי EM שלילית-כתם תלויה בשיטה של צביעת בשימוש (איור 3). באמצעות השיטה צד-סופג, התמוטט מבנים דמויי טבעת שנצפו, ואילו כשהוא מוכתם על ידי שטיפה מהירה או מצליף שיטות, חלבון C נצפית כסדרה של תחומים הדומות חרוזים על חוט.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מגיב</td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>ה-pH</td>
			<td>סוג</td>
		</tr>
<tr>
<td>אמוניום Molybdate</td>
			<td>1 - 2%</td>
			<td>5 – 7</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>ארביום אצטט (ErAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>אצטט גדוליניום (GdAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tungstate מתילאמין</td>
			<td>2%</td>
			<td>6 – 7</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>סמריום אצטט (SmAC)</td>
			<td>1%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן silicotungstate</td>
			<td>1 – 5%</td>
			<td>5-8</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>נתרן phosphotungstate</td>
			<td>1-3%</td>
			<td>5-8</td>
			<td>Anionic</td>
		</tr>
<tr>
<td>תוליום אצטט (TmAc)</td>
			<td>1 – 2%</td>
			<td>6</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uranyl אצטט (UA)</td>
			<td>1 – 3%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uranyl Formate (UF)</td>
			<td>0.75-1%</td>
			<td>3 – 4</td>
			<td>Cationic</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: כמה נפוץ שלילי מכתימים ריאגנטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig1.jpg"> איור 1: דוגמה micrographs של נגיף פסיפס הטבק צבעונית עם ריאגנטים כתם שלילי שונים (א) 1% UF (B) TmAc 2.5% (ג) 2.5% ErAc. (ד) 1% UA (E) 2.5% GdAc, (נ) 2.5% SmAc. גודל ברים הם 100 ננומטר. נציג תמונות ושכפול מרובים עם אזורים מרובים עם תמונה לכל שכפול. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig2.jpg"> איור 2: צביעת מוזאיקת הטבק עם אצטט תוליום (א) , בהגדלה של אזור של מיקרוסקופ של TMV, מוכתם של 1% TmAc. סולם בר הוא 20 ננומטר. (B) שיעור ממוצע של מקטעי TMV שחולצו. (ג) התמרת פורייה של התמונה בפאנל A מראה שכבה קו השתקפויות ~ 23 Å. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57199/57199fig3.jpg"> איור 3: השפעות סופג שיטה על קונפורמציה של חלבון C. (א) C-חלבון מוכתם UA באמצעות שיטת חשופה בצד שיטת יתנגש (B) . הפאנל העליון קנה מידה בר הוא 50 ננומטר, המייצג התחתון של סולם לוח ה-20 ננומטר. נציג תמונות ושכפול מרובים עם אזורים מרובים עם תמונה לכל שכפול. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57199/57199fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כתם שלילי EM היא טכניקה חזקה להמחשת המבנה macromolecular, אבל טכניקות צביעת שונים יכול לייצר תוצאות שונות באופן תלוי מדגם. הנה מספר גישות מכתימים שלילי מתוארים בפירוט כדי לספק זרימת עבודה ראשונית בהתמודדות עם הפריט החזותי של מערכות מאתגר.

Negative stain electron microscopy (EM) allows relatively simple and quick observation of macromolecules and macromolecular complexes through the use of ...

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים מספר וריאציות שונות על טכניקות להכנת דגימות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת כתמים שליליים. כתם שלילי הוא הדרך הטובה ביותר להעריך במהירות את איכות דגימת EM. חשוב להכיר בכך שטכניקות שונות להכנת רשת עובדות טוב יותר עבור דוגמאות מסוימות.הטכניקה המתאימה ביותר לכל דגימה נתונה חייבת להיקבע על ידי ניסוי וטעייה. כדי להתחיל, הכינו את רשתות ה-EM בשיטת יריעות הפחמן והכינו את ריאגנטים לצביעה שלילית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הנח רשת EM מצופה יריעת פחמן הפונה כלפי מעלה על שקופית מיקרוסקופ.הגדר את המגלשה ליחידת פריקת זוהר והתייחס לרשת למשך 30 שניות לפחות ב-10 מיליאמפר כדי להפוך את הרשת להידרופילית. בסיום, הסר את הדגימה מיחידת הפריקה. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה בלחץ שלילי כדי לאחוז בקצה הרשת.כדי להכתים בשיטת כתמי הצד, יש למרוח תחילה שלושה עד חמישה מיקרוליטר מהדגימה על משטח התמיכה. אפשר לדגימה לספוג למשטח הרשת למשך 10 שניות עד דקה אחת, ולאחר מכן גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית למשוך את הנוזל. לאחר מכן, הניחו 50 טיפות מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד או תמיסת חיץ נדיפה מתאימה על דף סרט מעבדה.גע בעדינות במשטח הפחמן של הרשת לטיפה והרם טיפה קטנה על פני הרשת. לאחר מכן, גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית למשוך את הנוזל. לאחר מכן, הניחו שתי טיפות של 50 מיקרוליטר של מגיב מכתים על דף סרט מעבדה.גע בעדינות במשטח הפחמן של הרשת לטיפה והרם טיפה קטנה על המשטח העליון של הרשת. אם הכתם נודד לחלק האחורי של הרשת, אז סרט הפחמן נשבר ויש להשליך אותו. לאחר 10 עד 15 שניות, גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית לשאוב את הנוזל.חזור על שלב הצביעה הזה פעם נוספת ואז אפשר לרשת להתייבש באוויר. כדי להכתים את הדגימה בשיטת ההחלקה, אחזו בקצה הרשת בזוג פינצטה בלחץ שלילי ומרחו שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דגימה על משטח התמיכה. החזיקו את הפינצטה ביד אחת, סובבו את הרשת כך שתהיה בערך 45 מעלות פונה הצידה והזיזו במהירות את פרק כף היד כדי להעיף את רוב הטיפה שנמצאת על גבי הרשת.לאחר מכן, השתמש בפיפטה מזכוכית של פסטר כדי למרוח טיפת תמיסת כביסה על משטח התמיכה. החלק את הטיפה וחזור על הפעולה כמה פעמים כדי לשטוף את הדגימה. לאחר מכן, מרחו טיפה של מגיב מכתים על משטח התמיכה ושוב העבירו את הטיפה.חזור על שלב הצביעה הזה פעם עד שלוש, תלוי בעומק הכתם הנדרש להדמיה של הדגימה. הסר כתם עודף על ידי נגיעה בקצה הקרוע של פיסת נייר סינון לקצה הרשת ולאחר מכן אפשר לרשת להתייבש באוויר. כדי להכתים את הדגימה בשיטת השטיפה המהירה, צייר תחילה 30 עד 70 מיקרוליטר כתם לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.סובב את חוגת עוצמת הקול כדי לשאוב חמישה מיקרוליטר אוויר ואז שאב חמישה עד 30 מיקרוליטר של מגיב הכביסה, ואחריו פער אוויר קטן נוסף, לפני עוד חמישה מיקרוליטרים של דגימה. אחזו בקצה הרשת בעזרת פינצטה בלחץ שלילי והטו את הרשת בזווית של כ-45 מעלות כלפי הפנים. בתנועה מהירה אחת, הוציאו את כל תכולת קצה הפיפטה על פני רשת ה-EM המצופה בפחמן.הסר כתם עודף על ידי נגיעה בקצה הקרוע של פיסת נייר סינון לקצה הרשת ואפשר לרשת להתייבש באוויר. הבחירה האידיאלית עבור כתם שלילי תלויה מאוד במדגם. הכתם הנפוץ ביותר הוא אורניל אצטט, אך ניתן להשתמש גם בכתמי לנתניד.עבור דגימות מוטמעות עמוק, כתמים מבוססי לנתניד, תוליום אצטט וארביום אצטט, יצרו צביעה שלילית באיכות שווה לאורניל אצטט, כפי שנשפט על ידי הניגודיות והחדות לכאורה של החלקיקים המוכתמים, כאשר תוליום אצטט מייצר תמונות ברורות וחדות יותר מאשר ארביום אצטט. גודל הגרגר הגדול של תוליום אצטט מתגלה בהגדלה גבוהה, המוצג כאן כאשר דגימה של חלקיקים סיביים של פסיפס טבק הוכתמו ב-1% תוליום אצטט. באמצעות תוליום אצטט, החזרה של 23 אנגסטרום של החלקיק הסיבי של פסיפס הטבק נראית בבירור בעין.אף אחד מכתמי הלנתנידים האחרים שנבדקו לא הצליח לפתור תכונה זו. דגימה נוספת שקשה לדמות היא חלבון C שמקורו בשריר. דגימה זו מייצרת תמונות שונות באופן משמעותי בהתאם לשיטת הצביעה.כאשר הוא מוכתם בשיטת כתם צד, הוא מופיע כמבנה כדורי דמוי כנף שהתמוטט. כאשר מכינים רשתות בשיטת ההחלקה, חלבון C נצפה כסדרה של תחומים הדומים לחרוזים על חוט. זה מייצג טוב יותר את מבנה חלבון C בפועל.לאחר השליטה, לוקח רק כדקה להכין דגימה מוכתמת שלילית. חשוב לזכור שכל דגימה מגיבה אחרת לכל טכניקת צביעה. עבור דגימות חדשות, יש לקבוע את הגישה הטובה ביותר באופן ניסיוני.אל תשכח כי ריאגנטים לצביעת אורניל הם רעילים ומעט רדיואקטיביים. ודא שהם מושלכים בזרם פסולת מתאים.

variations-on-negative-stain-electron-microscopy-methods-tools-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

דגימות חלבון חזותי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי כתם (EM) הפך פופולרי שיטת ניתוח מבניות. זה שימושי עבור ניתוח מבניות כמותיים, כגון חישוב שחזור 3D של מולקולות הנלמד, וגם לבחינה איכותית של איכות ההכנות חלבון. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להכנת רשתות EM, מכתים את המדגם באופן חזותי את המדגם אלקטרון במיקרוסקופ. משתמשי המחשב השני יכול לעקוב אחר הפרוטוקולים הללו בקלות לנצל שלילי כתם EM כמו assay שגרתי, בנוסף מבחני ביוכימיים אחרים, להערכת דגימות חלבון שלהם.

לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

סרטון זה מתאר הליך להכתמה שלילית של אקסוזומים מטוהרים. האקסוזומים המוכתמים באופן שלילי מצולמים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. טכניקה זו מסייעת לדמיין את המורפולוגיה של אקסוזומים.

צביעה שלילית של אקסוזומים מטוהרים: הליך להמחשת מורפולוגיה אקסוזום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

יותר ממחצית מחלבונים הם חלבונים קטנים (מסה מולקולרית &lt;200 KDA) שקוראים תיגר על שתי הדמיה מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזורים תלת ממדים. מכתים שלילי אופטימלי הוא פרוטוקול תפוקה גבוהה חזקה ולהשיג ניגודיות גבוהה ויחסית ברזולוציה גבוהה (~ 1 ננומטר) תמונות של חלבונים סימטריים קטנים או מתחמים בתנאים פיסיולוגיים שונים.

מכתים שלילי אופטימלי: פרוטוקול תפוקה גבוהה לבחינת מבנה חלבון קטן וסימטרי על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.

ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשילוב שני דוגמת עיבוד טכניקות, בלחץ גבוה מקפיא מדגם בסיוע מיקרוגל עיבוד, ואחריו שרף מינימלי הטבעה לרכישת נתונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה קרן (שיקרתי-SEM) יון ממוקד. הוכח באמצעות העכבר העצב הטיביאלי מדגם Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשילוב יעיל של פנים בלוקים סדרתיים וקרן יון ממוקדת סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני כדי למקד את אזור העניין. זה מאפשר חיפוש יעיל, בשלושה ממדים, ואיתור אירועים נדירים בתחום השקפה גדול.

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

למד טכניקות שונות של צביעת שלילי למיקרוסקופ אלקטרונים להדמיית מבנים מולקולריים ביולוגיים. השיטות מדגימות הכנת רשתות פחמן ושימוש בכתמי לנתנידים לקבלת תמונות ברורות.

וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

גלה סרטונים נוספים