וריאציות על שלילי כתם מיקרוסקופ אלקטרונים שיטות: כלים בהתמודדות עם אתגר מערכות

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים מספר וריאציות שונות על טכניקות להכנת דגימות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת כתמים שליליים. כתם שלילי הוא הדרך הטובה ביותר להעריך במהירות את איכות דגימת EM. חשוב להכיר בכך שטכניקות שונות להכנת רשת עובדות טוב יותר עבור דוגמאות מסוימות.

הטכניקה המתאימה ביותר לכל דגימה נתונה חייבת להיקבע על ידי ניסוי וטעייה. כדי להתחיל, הכינו את רשתות ה-EM בשיטת יריעות הפחמן והכינו את ריאגנטים לצביעה שלילית כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הנח רשת EM מצופה יריעת פחמן הפונה כלפי מעלה על שקופית מיקרוסקופ.

הגדר את המגלשה ליחידת פריקת זוהר והתייחס לרשת למשך 30 שניות לפחות ב-10 מיליאמפר כדי להפוך את הרשת להידרופילית. בסיום, הסר את הדגימה מיחידת הפריקה. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה בלחץ שלילי כדי לאחוז בקצה הרשת.

כדי להכתים בשיטת כתמי הצד, יש למרוח תחילה שלושה עד חמישה מיקרוליטר מהדגימה על משטח התמיכה. אפשר לדגימה לספוג למשטח הרשת למשך 10 שניות עד דקה אחת, ולאחר מכן גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית למשוך את הנוזל. לאחר מכן, הניחו 50 טיפות מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד או תמיסת חיץ נדיפה מתאימה על דף סרט מעבדה.

גע בעדינות במשטח הפחמן של הרשת לטיפה והרם טיפה קטנה על פני הרשת. לאחר מכן, גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית למשוך את הנוזל. לאחר מכן, הניחו שתי טיפות של 50 מיקרוליטר של מגיב מכתים על דף סרט מעבדה.

גע בעדינות במשטח הפחמן של הרשת לטיפה והרם טיפה קטנה על המשטח העליון של הרשת. אם הכתם נודד לחלק האחורי של הרשת, אז סרט הפחמן נשבר ויש להשליך אותו. לאחר 10 עד 15 שניות, גע בקצה הרשת בגיליון נייר סינון ואפשר לפעולה נימית לשאוב את הנוזל.

חזור על שלב הצביעה הזה פעם נוספת ואז אפשר לרשת להתייבש באוויר. כדי להכתים את הדגימה בשיטת ההחלקה, אחזו בקצה הרשת בזוג פינצטה בלחץ שלילי ומרחו שלושה עד חמישה מיקרוליטרים של דגימה על משטח התמיכה. החזיקו את הפינצטה ביד אחת, סובבו את הרשת כך שתהיה בערך 45 מעלות פונה הצידה והזיזו במהירות את פרק כף היד כדי להעיף את רוב הטיפה שנמצאת על גבי הרשת.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה מזכוכית של פסטר כדי למרוח טיפת תמיסת כביסה על משטח התמיכה. החלק את הטיפה וחזור על הפעולה כמה פעמים כדי לשטוף את הדגימה. לאחר מכן, מרחו טיפה של מגיב מכתים על משטח התמיכה ושוב העבירו את הטיפה.

חזור על שלב הצביעה הזה פעם עד שלוש, תלוי בעומק הכתם הנדרש להדמיה של הדגימה. הסר כתם עודף על ידי נגיעה בקצה הקרוע של פיסת נייר סינון לקצה הרשת ולאחר מכן אפשר לרשת להתייבש באוויר. כדי להכתים את הדגימה בשיטת השטיפה המהירה, צייר תחילה 30 עד 70 מיקרוליטר כתם לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר.

סובב את חוגת עוצמת הקול כדי לשאוב חמישה מיקרוליטר אוויר ואז שאב חמישה עד 30 מיקרוליטר של מגיב הכביסה, ואחריו פער אוויר קטן נוסף, לפני עוד חמישה מיקרוליטרים של דגימה. אחזו בקצה הרשת בעזרת פינצטה בלחץ שלילי והטו את הרשת בזווית של כ-45 מעלות כלפי הפנים. בתנועה מהירה אחת, הוציאו את כל תכולת קצה הפיפטה על פני רשת ה-EM המצופה בפחמן.

הסר כתם עודף על ידי נגיעה בקצה הקרוע של פיסת נייר סינון לקצה הרשת ואפשר לרשת להתייבש באוויר. הבחירה האידיאלית עבור כתם שלילי תלויה מאוד במדגם. הכתם הנפוץ ביותר הוא אורניל אצטט, אך ניתן להשתמש גם בכתמי לנתניד.

עבור דגימות מוטמעות עמוק, כתמים מבוססי לנתניד, תוליום אצטט וארביום אצטט, יצרו צביעה שלילית באיכות שווה לאורניל אצטט, כפי שנשפט על ידי הניגודיות והחדות לכאורה של החלקיקים המוכתמים, כאשר תוליום אצטט מייצר תמונות ברורות וחדות יותר מאשר ארביום אצטט. גודל הגרגר הגדול של תוליום אצטט מתגלה בהגדלה גבוהה, המוצג כאן כאשר דגימה של חלקיקים סיביים של פסיפס טבק הוכתמו ב-1% תוליום אצטט. באמצעות תוליום אצטט, החזרה של 23 אנגסטרום של החלקיק הסיבי של פסיפס הטבק נראית בבירור בעין.

אף אחד מכתמי הלנתנידים האחרים שנבדקו לא הצליח לפתור תכונה זו. דגימה נוספת שקשה לדמות היא חלבון C שמקורו בשריר. דגימה זו מייצרת תמונות שונות באופן משמעותי בהתאם לשיטת הצביעה.

כאשר הוא מוכתם בשיטת כתם צד, הוא מופיע כמבנה כדורי דמוי כנף שהתמוטט. כאשר מכינים רשתות בשיטת ההחלקה, חלבון C נצפה כסדרה של תחומים הדומים לחרוזים על חוט. זה מייצג טוב יותר את מבנה חלבון C בפועל.

לאחר השליטה, לוקח רק כדקה להכין דגימה מוכתמת שלילית. חשוב לזכור שכל דגימה מגיבה אחרת לכל טכניקת צביעה. עבור דגימות חדשות, יש לקבוע את הגישה הטובה ביותר באופן ניסיוני.

אל תשכח כי ריאגנטים לצביעת אורניל הם רעילים ומעט רדיואקטיביים. ודא שהם מושלכים בזרם פסולת מתאים.