מערכת Microbiomechanical ללמוד היווצרות דליות, השחזור של אקסונים נוירון המרכזית

המטרה הכוללת של מערך נוזל בלחץ זה היא לייצר נפיחויות חוזרות ועקביות לאורך האקסונים של נוירונים מתורבתים. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הפגיעה המוחית, כגון המנגנונים שמאחורי שינויים מורפולוגיים תת-תאיים בתאי עצב בעקבות פגיעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשיטה מייצרת שינויים מורפולוגיים עקביים וחוזרים על עצמם המתאוששים עם הזמן.

זו טכניקה חשובה מאוד שפיתחנו במעבדה. הסיבה לכך היא שאנו יכולים לא רק להשתמש במערכת כדי לזהות מנגנון מולקולרי השולט בשינוי מורפולוגיה של אקסונים הנגרמים על ידי מתח מכני כצורה חדשה של פלסטיות עצבית, אלא גם להשתמש במערכת ככלי סינון לזיהוי תרופות חדשות ואסטרטגיית טיפול בפגיעה מוחית קלה או טראומטית. כדי להתחיל בהליך זה, הנח קופסה אחת או יותר של כיסויים בגודל 12 מילימטר או 25 מילימטר לתוך זכוכית המכילה 70% חומצה חנקתית, ודגר את הכיסויים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

למחרת, העבירו את כל הכיסויים לכוס של ארבעה ליטר מלאה ב-2.5 ליטר מים מזוקקים כפולים. נער את הכוס המכילה את הכיסויים למשך שעה ב-100 סל"ד, ואל תשכח להשתמש בגומיות כדי להחזיק את הכוס בזמן הטלטול. לאחר מכן, העבירו את הכיסויים הנקיים לבקבוק יבש עם מכסה המתכת.

אופים את הכיסויים בתנור בחום של 225 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לאחר מכן, הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר ואחסנו אותם בכלי פלסטיק מעוקר עד לשימוש. כעת, הנח כיסוי אחד לכל באר של צלחת של 24 בארות.

הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי כיסוי על כיסוי 12 מילימטר וסובב. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל באר. ניתן להשתמש בצלחת באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS סטרילי עד שבוע.

ביום הנתיחה, הסר PBS מהצלחת. יבש באוויר והנח את הצלחת תחת אור UV למשך שעתיים עד ארבע שעות. כדי לנתק את נוירוני ההיפוקמפוס לצורך תרבית, יש להפשיר את תמיסת האנזים פרוטאז ולחמם מראש את מדיום הציפוי ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס המנותח עם SLDS. לאחר מכן, הסר אותו והוסף שני מיליליטר של תמיסת אנזים פרוטאז ודגר את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס עם חמישה עד 10 מיליליטר של מדיום ציפוי פעמיים והוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום ציפוי.

להפריד את ההיפוקמפוס לתאים בודדים על ידי יצירת מערבולת קטנה באמצעות פיפטה עם קצה פלסטיק של מיליליטר אחד. פיפטה למעלה ולמטה כ -40 פעמים נמנעות מהיווצרות בועות חמצן עד שהתמיסה הופכת לעכורה ולא נשארות חתיכות גדולות של אקספלנט. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בכוח הכבידה פי 1, 125 למשך שלוש דקות.

הסר את הסופרנטנט כשהתאים שקועים במדיום ותלה מחדש את התאים ב -145 מיליליטר של מדיום ציפוי. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מתלה התאים לכל באר לצלחת של 24 בארות. דגרו את התאים במדיום הציפוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות.

לאחר מכן, הסר את אמצעי הציפוי והחלף אותו באמצעי תחזוקה טרי. לאחר יומיים, החלף מחצית מהמדיום בשני RSC מיקרו-מולאריים מומסים במדיום תחזוקה כדי לעכב צמיחה של תאי פיברובלסטים, אנדותל וגליה. לאחר מכן, לאחר חשיפת התאים ל-RSC למשך יומיים, החלף את המדיום במדיום תחזוקה טרי.

כדי לבצע טרנספקט להדמיה של מורפולוגיה של תאים, יש לדלל את המבנה מהמלאי במיקרוגרם אחד למיקרוליטר בתווך Opti-MEM ובמערבולת. לאחר מכן, יש לדלל מגיב טרנספקציה בתיווך ליפוזום במדיה ובמערבולת Opti-MEM. לאחר מכן, הכינו דילול בנייה אחד ודילול טרנספקציה אחד לכל באר.

לאחר מכן, הכינו תערובת אחד לאחד של המבנה ומדיום Opti-MEM ומגיב טרנספקציה ומדיום ומערבולת Opti-MEM. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, הוציאו מחצית מהמדיום מכל באר והעבירו את המדיום הזה לצינור חרוטי נקי.

שמור את הצינור בחממה, ואז הוסף 100 מיקרוליטר מהתערובת שהוכנה בשלב הקודם למדיום הנותר בבאר. אפשר לתאים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. במהלך הדגירה מוסיפים נפח אחד של מדיום תחזוקה טרי למדיום בצינור החרוטי ומניחים את התערובת באותה חממה.

לאחר הדגירה, הסר את המדיומים המכילים את תמיסת הטרנספקציה מהבארות והחלף אותה בתערובת אחד לאחד של אמצעי תחזוקה ישן וטרי בצינור החרוטי. בהליך זה, הכנס את הפיפטה לחלק העליון של הבורג של המיקרומניפולטור כדי להחזיק אותה במקומה. הברג את בורג המתכת השטוח המחובר לזרוע המיקרומניפולטור כך שיחזיק את הקצה הלא מושך של הפיפטה ממש מעל המקום שבו מחובר צינור הגומי.

זווית את הפיפטה בזווית של 45 מעלות כאשר פני הנוירון מכילים כיסויים. הפעל את פילטר התפרחת. פתח את הצמצם וודא שניתן לראות נקודה פלואורסצנטית נכנסת דרך המטרה.

בעזרת המיקרומניפולטור, הזיזו את הפיפטה למצב שמיישר את הקצה עם הנקודה הפלואורסצנטית והורידו את הפיפטה למצב ממש מעל גובה צלחת תרבית התאים. ברגע שהוא במקומו, הפעל את האור המועבר וכבה את התפרחת. בעזרת פינצטה, העבירו כיסוי אחד כשהתאים פונים לכיוון הפיפטה מלוח תרבית התאים לצלחת תרבית התאים המכילה 2 מיליליטר של מאגר האנק בטמפרטורת החדר.

באמצעות כפתור המיקוד העדין ומטרה של פי 20, התמקד במישור כארבע סיבובים מלאים מעל התאים. לאחר מכן, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את קצה הפיפטה כך שיהיה ממוקד ובמרכז השמאלי של המטוס כפי שנראה דרך העיניות. ברגע שהפיפטה נמצאת במקומה, מקדו את המיקרוסקופ במישור המכיל את אזור העניין.

בהדמיה של שבעה div, נוירונים בהיפוקמפוס של עכברים שעברו טרנספטציה של GFP הראו אקסון לפני ואחרי נשיפה, כמו גם תקופת התאוששות של 10 דקות לאחר מכן. הנה הקימוגרף של הדמיית זמן-lapse של אותו נוירון. חיצים אדומים מציינים את הדליות שנוצרו לאחר 150 שניות של נשיפה של 190 מיליליטר H2O, החל מ-30 שניות.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הקלטת תאים שלמים, הדמיית FRET ו-TIRF והדמיית סידן על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ההשפעות של לחץ מכני על איתות עצבי וחשמלי וסידן, סחר בחלבונים ואינטראקציות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בפגיעה מוחית פוטו-טראומטית להסביר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס היווצרות דליות אקסונליות בתאי עצב חיים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע את הניסויים כדי לחקור תחושות מכניות של תאי עצב מרכזיים.