Name: מערכת Microbiomechanical ללמוד היווצרות דליות, השחזור של אקסונים נוירון המרכזית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למד שיטת נוזל בלחץ ליצירת דליות בריריות באקסונים של נוירונים היפוקמפיים מתורבתים. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנוני פלסטיות עצבית ופיתוח אסטרטגיות טיפול בפציעות מוח טראומטיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל הניסויים נערכו בהתאם נבחרת מוסדות של בריאות בעלי חיים שימוש לקווים המנחים. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (R01NS093073 ו- R21AA024873) ג. ג. א.

<ol><li>Nikić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li>
<li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+in+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li>
<li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li>
<li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li>
<li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li>
<li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury%3A+therapeutic+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/23/1/015002">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002(2013).</li>
<li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li>
<li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li>
<li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li>
<li>Campàs, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הנוהל של assay microbiomechanical הזה הוא ישר קדימה. זה יפיק תוצאות אמינות, אם כל השלבים שלה מתבצעות בזהירות. ישנם מספר שלבים מרכזיים שישבשו, אם מבוצעת באופן לא תקין, איסוף נתונים מוצלחת. השלבים הקריטיים להתחיל במעלה הזרם של היישום בפועל של הגירוי והמתנשף. ניתוח זהיר culturing, טיפול של התרבות נוירון ראשי הינם בעדיפות עליונה. אם הנוירונים בתרבית אינם בריאים, הם שלא יגיב באופן עקבי, מאז הם אולי כבר כבר כבר זיהמו למתח. במורד הזרם של התרבות, הגדרת הראשונית כיול של המנגנון והמתנשף לספק לחץ עקבי, יניעו varicosities אבל לא יגר...

היווצרות דליות, או נפיחות/פלאיירים, לאורך אקסונים, הוא מאפיין בולט של הקשורים ניוון מוחיים נצפו הפרעות רבות או פציעה של מערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה, אלצהיימר, פרקינסון, וטראומטית פגיעה במוח1,2. למרות ההשפעות פיזיולוגיות משמעותיות של varicosities עצב על הפצת פוטנציאל הפעולה, הסינאפסית3, איך נוצרים את varicosities נותר עלום. לאחרונה, שימוש assay microbiomechanical החדש שהוקם על נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית של מכרסמים, מצאנו כי גירוי מכני יכול לגרום varicosities של הנוירונים הללו עם מאוד מסקרן תכונות. ראשית, דליות אינדוקציה היא מהירה (< 10 s) תהליך זה הוא הפיך באופן בלתי צפוי. שנית, דליות חניכה תלוי בכח הנעוצה לחץ: הלחץ גבוה יותר, מהר יותר הקבלה. שלישית, דליות חניכה תלוי גיל עצביים. האקסונים של נוירונים הצעירים מופיעים קשובים יותר מכאניים, בהשוואה לאלו של נוירונים בוגרים. רביעית, הצורה varicosities לאורך האקסונים של נוירונים בהיפוקמפוס, בעוד דנדריטים של האקסון הראשונית מקטעים של נוירונים אלה מציגים ללא שינוי בתנאי והמתנשף אותו. לפיכך, המחקר שלנו גילה תכונה הרומן של קוטביות עצביים. ממצאים אלה עם מערכת במבחנה הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. באמצעות מודל ויוו עבור פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הראינו כי עצב varicosities התפתח בצורה רב נקודתית בקליפת המגע של העכברים מיד לאחר הפגיעה סגור-הגולגולת, עקבי עם שלנו במבחנה תוצאות4. חשוב לציין כי שלנו מוכתמים, הדמיה של העכברים mTBI מספקים רק זריקה הצמד של שינויים מורפולוגיים עצביים, מאז ביצוע ויוו הדמיה בצילום מואץ של מורפולוגיה העצבית במהלך השפעה מכני הוא עדיין לא ריאלי.
מערכת זו נשיפת-נוזל מותר לנו לא רק ללכידת תכונות ייחודיות המשויכים היווצרות דליות מפגינות מכני, אלא גם כדי לקבוע את מנגנון המשמש כבסיס. על ידי בדיקות שונות פתרונות חוץ-תאית, חוסמי ראשית של מועמדים שונים של תעלות יונים mechanosensitive, אלקטרופיזיולוגיה הסלולר, זיהינו כי הקטיון פוטנציאליים קולטן ארעי ערוץ תת V חבר 4 (TRPV4) ערוץ זה הוא חדיר2 + Ca, Na+ ומופעל על-ידי נשיפת אחראי בעיקר על גילוי ראשוני מכאניים במהלך היווצרות דליות עצב4. זה אושר עוד יותר בגישה נוקאאוט siRNA. . יחדיו, מערכת חדשה זו assay שפיתחנו עם התרבות נוירון בהיפוקמפוס, הוא חשוב מאוד ללמוד את המאפיינים micromechanical של הנוירונים מרכזי, במיוחד בשילוב עם טכניקות אחרות.
מערכת זו micromechanical הקמנו הוא ייחודי, שונה מערכות קיימות קודם לכן בכמה היבטים עיקריים. ראשית, מערכת זו, הנוירונים לחוות out-של-plane מכאניים בצורות של הטיה של דחיסה. במהלך ההשפעה מכני, תהליכים עצביים יישארו מצורפים השטח coverslip, אל תזוז. הדבר שונה מאופן אחרים ניסיוני מערכות מעורבים בעיקר כיפוף ומתיחות בתוך המטוס (או מתח), למשל, אפשרות סטיה של אקסונים ארוזות כמו העברת מחרוזות5,6 או מתיחה אקסונים גדל על micropatterned ערוצים וממברנות מתיחה7,8. יתר על כן, למרות varicosities עצב יכולה להיגרם גם על אלה מבחני כמו במערכת שלנו נשיפת-נוזל, תהליך הגדרות אלה לוקח הרבה יותר זמן (מ- 10 דקות עד מספר שעות6,7,8) ומופיע בלתי הפיך. בסופו של דבר, המערכת שלנו באמצעות נשיפת נוזלים מקומיים מאפשרת הבחינה של התכונות המרחבי של היווצרות דליות (למשל., דנדריטים, הדנדריטים, סומה, עצב מקטעי הראשונית, מסופי עצב), מלבד התכונות הזמנית שלו. באמצעות מערכת זו, גילינו מספר בלתי צפויים וייחודיים תכונות היווצרות דליות עצב, במיוחד התפרצות מהירה, איטית הפיכות ו האקסון-דנדריט קוטביות.
המערכת שנדון בו הנייר הזה הוא תואם עם טכניקות רבות של מולקולרית ותא ביולוגיה. למשל, כדי לחקור את ההשפעות של לחץ מכני על מורפולוגיה העצבית ותפקוד, זה יכול לשמש יחד עם מיאלין coculture, זמן לשגות הדמיה של העברת אנרגיה תהודה פלורסנט (סריג), קרינה פלואורסצנטית גמורה (TIRF), הדמיית סידן, תיקון קלאמפ הקלטה. בנייר זה, אנו מתמקדים מרכיבי הליבה של המערכת. נוירון בהיפוקמפוס תרבות, ההתקנה נשיפת-נוזל, ברזולוציה גבוהה בצילום מואץ דימות להעברה עצב ו סידן הדמיה מומחשים מפורטות להלן.

<table><tbody><tr><td>כיסויים 12 מ"מ&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>לצלחת 24 בארות&nbsp;</td></tr><tr><td>כיסויים 25 מ"מ&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>12-545-102&nbsp;</td><td>לצלחת 6 בארות&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>פולי-די-ליזין</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>קולגן זנב חולדה&nbsp;</td><td>רוש&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פי 10 PBS&nbsp;</td><td>אבחון לאומי&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>אנזים פרוטאז&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>ל-גלוטמין&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין 100x (P/S)</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>מלחי ארל MEM&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>נוירו-בזאלי&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>ארבינוזיל ציטוזין (Ara-C)</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>מדיית Opti-MEM&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>מגיב טרנספקציה&nbsp;</td></tr><tr><td>מוטות בורוסיליקט&nbsp;</td><td>וורלד דיוק אינסטרומנטס בע"מ&nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>לתפיחות פיפטה&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות גומי&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>מזרק ובוכנה מפלסטיק 10 סמ"ק</td><td>בקטון דיקינסון&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור&nbsp;</td><td>סאטר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>צלחת תרבית תאים C70-500</td><td></td></tr><tr><td>(35 מ"מ x 10 מ"מ)</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>F14201</td><td>להדמיית סידן&nbsp;</td></tr><tr><td>מבנה מיטו-YFP&nbsp;</td><td>טאקארה ביו בע"מ&nbsp;</td><td></td><td>להעברת תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>מבנה YFP-N1&nbsp;</td><td>טאקארה ביו בע"מ&nbsp;</td><td></td><td>להעברת תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>דגם P-1000 חולץ מיקרופיפטה בוער/חום&nbsp;</td><td>סאטר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&nbsp;</td><td>עדשת Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp; &nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>המטרה&nbsp;</td></tr><tr><td>עדשת שמן Apo TIRF 100x/1.49&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>המטרה&nbsp;</td></tr></tbody></table>

מערכת microbiomechanical ללמוד היווצרות דליות, השחזור של אקסונים נוירון המרכזית

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Varicosities עצב הם המבנים מוגדלות לאורך המוטות של אקסונים עם רמה גבוהה של הטרוגניות. הם נמצאים לא רק את המוח עם מחלות ניווניות או פציעות, אלא גם במוח רגיל. כאן נתאר מערכת micromechanical החדש שהוקם לזירוז במהירות, באופן אמין ו הפיכה varicosities עצב, ומאפשר לנו להבין את המנגנונים השולטים היווצרות דליות והרכב החלבון הטרוגנית. מערכת זו מייצגת אמצעים חדשניים כדי להעריך את ההשפעות של הלחץ הטיה של דחיסה על תאים subcellular שונים של נוירונים, שונה ממערכות אחרות במבחנה המתמקדים בעיקר ההשפעה של מתיחות. חשוב, בשל התכונות הייחודי של המערכת שלנו, לאחרונה גילינו דבר הרומן מציג כי היישום של נוזל בלחץ יכול במהירות, הפיכה לגרום varicosities עצב דרך ההפעלה של ערוץ פוטנציאלי קולטן ארעי. מערכת biomechanical שלנו יכול להיות מנוצל בנוחות בשילוב עם התרופה זלוף, הדמיה תא חי, סידן ההדמיה וה תיקון קלאמפ הקלטה. לכן, בשיטה זו יכול להיות מאומץ ללמוד mechanosensitive יון ערוצי תחבורה עצב רגולציה, שלד התא עצב dynamics, סידן איתות, פגיעה מוחית הקשורים טראומטי שינויים מורפולוגיים.

לפני שש־בש, אקסונים בד כ מראה קטנה היווצרות דליות. נשיפת הבאים עם שלנו רגיל לחץ (גובה2O mmH 190), ההתחלה אקסונים לפתח רבים varicosities, כמו חרוז. היווצרות של varicosities הוא הפיך באופן חלקי, כפי שמוצג על ידי מחוזות הדנדריטי לאקסון חוזרים למצבם טרום פצפוצי בעקבות תקופת התאוששות 10 דקות (איור 2א-ב). לאחר תקופה ארוכה של השחזור (&gt; 20 דקות), אקסונים קצת להתאושש לחלוטין. מיקום שיוצרת פיפטה והמתנשף וכן מיקום מדויק המזרק-190 מ מ מעל ה...

פרוטוקול זה מתאר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בלחץ נוזלים גישה עבור אינדוקציה מהיר ולא הפיכה של varicosities בנוירונים.

מערכת Microbiomechanical ללמוד היווצרות דליות, השחזור של אקסונים נוירון המרכזית

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

המטרה הכוללת של מערך נוזל בלחץ זה היא לייצר נפיחויות חוזרות ועקביות לאורך האקסונים של נוירונים מתורבתים. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הפגיעה המוחית, כגון המנגנונים שמאחורי שינויים מורפולוגיים תת-תאיים בתאי עצב בעקבות פגיעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהשיטה מייצרת שינויים מורפולוגיים עקביים וחוזרים על עצמם המתאוששים עם הזמן.זו טכניקה חשובה מאוד שפיתחנו במעבדה. הסיבה לכך היא שאנו יכולים לא רק להשתמש במערכת כדי לזהות מנגנון מולקולרי השולט בשינוי מורפולוגיה של אקסונים הנגרמים על ידי מתח מכני כצורה חדשה של פלסטיות עצבית, אלא גם להשתמש במערכת ככלי סינון לזיהוי תרופות חדשות ואסטרטגיית טיפול בפגיעה מוחית קלה או טראומטית. כדי להתחיל בהליך זה, הנח קופסה אחת או יותר של כיסויים בגודל 12 מילימטר או 25 מילימטר לתוך זכוכית המכילה 70% חומצה חנקתית, ודגר את הכיסויים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.למחרת, העבירו את כל הכיסויים לכוס של ארבעה ליטר מלאה ב-2.5 ליטר מים מזוקקים כפולים. נער את הכוס המכילה את הכיסויים למשך שעה ב-100 סל"ד, ואל תשכח להשתמש בגומיות כדי להחזיק את הכוס בזמן הטלטול. לאחר מכן, העבירו את הכיסויים הנקיים לבקבוק יבש עם מכסה המתכת.אופים את הכיסויים בתנור בחום של 225 מעלות צלזיוס למשך שש שעות. לאחר מכן, הניחו להם להתקרר לטמפרטורת החדר ואחסנו אותם בכלי פלסטיק מעוקר עד לשימוש. כעת, הנח כיסוי אחד לכל באר של צלחת של 24 בארות.הוסף 30 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי כיסוי על כיסוי 12 מילימטר וסובב. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל באר. ניתן להשתמש בצלחת באופן מיידי או לאחסן בארבע מעלות צלזיוס ב-PBS סטרילי עד שבוע.ביום הנתיחה, הסר PBS מהצלחת. יבש באוויר והנח את הצלחת תחת אור UV למשך שעתיים עד ארבע שעות. כדי לנתק את נוירוני ההיפוקמפוס לצורך תרבית, יש להפשיר את תמיסת האנזים פרוטאז ולחמם מראש את מדיום הציפוי ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס המנותח עם SLDS. לאחר מכן, הסר אותו והוסף שני מיליליטר של תמיסת אנזים פרוטאז ודגר את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את ההיפוקמפוס עם חמישה עד 10 מיליליטר של מדיום ציפוי פעמיים והוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום ציפוי.להפריד את ההיפוקמפוס לתאים בודדים על ידי יצירת מערבולת קטנה באמצעות פיפטה עם קצה פלסטיק של מיליליטר אחד. פיפטה למעלה ולמטה כ -40 פעמים נמנעות מהיווצרות בועות חמצן עד שהתמיסה הופכת לעכורה ולא נשארות חתיכות גדולות של אקספלנט. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים בכוח הכבידה פי 1, 125 למשך שלוש דקות.הסר את הסופרנטנט כשהתאים שקועים במדיום ותלה מחדש את התאים ב -145 מיליליטר של מדיום ציפוי. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מתלה התאים לכל באר לצלחת של 24 בארות. דגרו את התאים במדיום הציפוי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עד ארבע שעות.לאחר מכן, הסר את אמצעי הציפוי והחלף אותו באמצעי תחזוקה טרי. לאחר יומיים, החלף מחצית מהמדיום בשני RSC מיקרו-מולאריים מומסים במדיום תחזוקה כדי לעכב צמיחה של תאי פיברובלסטים, אנדותל וגליה. לאחר מכן, לאחר חשיפת התאים ל-RSC למשך יומיים, החלף את המדיום במדיום תחזוקה טרי.כדי לבצע טרנספקט להדמיה של מורפולוגיה של תאים, יש לדלל את המבנה מהמלאי במיקרוגרם אחד למיקרוליטר בתווך Opti-MEM ובמערבולת. לאחר מכן, יש לדלל מגיב טרנספקציה בתיווך ליפוזום במדיה ובמערבולת Opti-MEM. לאחר מכן, הכינו דילול בנייה אחד ודילול טרנספקציה אחד לכל באר.לאחר מכן, הכינו תערובת אחד לאחד של המבנה ומדיום Opti-MEM ומגיב טרנספקציה ומדיום ומערבולת Opti-MEM. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר 20 דקות, הוציאו מחצית מהמדיום מכל באר והעבירו את המדיום הזה לצינור חרוטי נקי.שמור את הצינור בחממה, ואז הוסף 100 מיקרוליטר מהתערובת שהוכנה בשלב הקודם למדיום הנותר בבאר. אפשר לתאים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 עד 30 דקות. במהלך הדגירה מוסיפים נפח אחד של מדיום תחזוקה טרי למדיום בצינור החרוטי ומניחים את התערובת באותה חממה.לאחר הדגירה, הסר את המדיומים המכילים את תמיסת הטרנספקציה מהבארות והחלף אותה בתערובת אחד לאחד של אמצעי תחזוקה ישן וטרי בצינור החרוטי. בהליך זה, הכנס את הפיפטה לחלק העליון של הבורג של המיקרומניפולטור כדי להחזיק אותה במקומה. הברג את בורג המתכת השטוח המחובר לזרוע המיקרומניפולטור כך שיחזיק את הקצה הלא מושך של הפיפטה ממש מעל המקום שבו מחובר צינור הגומי.זווית את הפיפטה בזווית של 45 מעלות כאשר פני הנוירון מכילים כיסויים. הפעל את פילטר התפרחת. פתח את הצמצם וודא שניתן לראות נקודה פלואורסצנטית נכנסת דרך המטרה.בעזרת המיקרומניפולטור, הזיזו את הפיפטה למצב שמיישר את הקצה עם הנקודה הפלואורסצנטית והורידו את הפיפטה למצב ממש מעל גובה צלחת תרבית התאים. ברגע שהוא במקומו, הפעל את האור המועבר וכבה את התפרחת. בעזרת פינצטה, העבירו כיסוי אחד כשהתאים פונים לכיוון הפיפטה מלוח תרבית התאים לצלחת תרבית התאים המכילה 2 מיליליטר של מאגר האנק בטמפרטורת החדר.באמצעות כפתור המיקוד העדין ומטרה של פי 20, התמקד במישור כארבע סיבובים מלאים מעל התאים. לאחר מכן, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את קצה הפיפטה כך שיהיה ממוקד ובמרכז השמאלי של המטוס כפי שנראה דרך העיניות. ברגע שהפיפטה נמצאת במקומה, מקדו את המיקרוסקופ במישור המכיל את אזור העניין.בהדמיה של שבעה div, נוירונים בהיפוקמפוס של עכברים שעברו טרנספטציה של GFP הראו אקסון לפני ואחרי נשיפה, כמו גם תקופת התאוששות של 10 דקות לאחר מכן. הנה הקימוגרף של הדמיית זמן-lapse של אותו נוירון. חיצים אדומים מציינים את הדליות שנוצרו לאחר 150 שניות של נשיפה של 190 מיליליטר H2O, החל מ-30 שניות.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הקלטת תאים שלמים, הדמיית FRET ו-TIRF והדמיית סידן על מנת לענות על שאלות נוספות כמו ההשפעות של לחץ מכני על איתות עצבי וחשמלי וסידן, סחר בחלבונים ואינטראקציות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בפגיעה מוחית פוטו-טראומטית להסביר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס היווצרות דליות אקסונליות בתאי עצב חיים.אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבצע את הניסויים כדי לחקור תחושות מכניות של תאי עצב מרכזיים.

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר תחבורה אקסונלית בנוירונים מוטוריים באמצעות מערכת תא מיקרופלואידית. זה כרוך בגידול רקמות חוט השדרה העוברי של עכבר בבארות מצופות פולימר עם מדיום מזין כדי לגרום לצמיחה אקסונלית. התנועה של אברונים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי בהדמיה חיה, מאשרת את ההובלה האקסונלית הדו-כיוונית.

מעקב אחר הובלה אקסונלית של אברונים בנוירונים מוטוריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

סרטון זה מדגים את השראת הדליות האקסונליות על ידי הפעלת גירוי מיקרומכני על נוירונים. המערכת מורכבת ממיקרופיפטה המחוברת למזרק המכיל חיץ באמצעות צינורות. באמצעות מיקרומניפולטור, המיקרופיפטה ממוקמת מעל הנוירונים. לאחר מכן מופעל לחץ נוזל כדי לגרום לדליות באקסונים.

גרימת דליות אקסונליות עם גירוי מיקרומכני על נוירונים

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.

Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em&gt; בVivo</em

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse של עירור שני פוטונים כדי לדמיין בו זמנית את הדינמיקה של פגיעות אקסון ומיאלין בזמן אמת. פרוטוקול מוצע זה מאפשר מחקרים של גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד שיכולים להשפיע על גורל האקסון המיאליני המרכזי לאחר פציעה ולתרום לנכות קלינית קבועה.

Ex Vivo חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

כתב היד הזה מפרט את ייצור של רקמות מיקרו- רקמות מהונדסות ברשתות עצביות: מבנים תלת-מימדיים בגודל מיקרון המורכבים משטחים אקסונליים ארוכי טווח המקיפים אוכלוסייה נוירונית מצטברת (s), המצופים בהידרוגול צינורי. אלה הפיגומים החיים יכולים לשמש ממסרים תפקודית לשחזר או לווסת מעגלים עצביים או כמו מיטות בדיקה ביופידלית מחקה נוירונטומי חומר אפור לבן.

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

הובלה axonal היא מנגנון מכריע. לבריאות תא העצב המוטורי בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה מפורטת למעקב אחר התחבורה סיבי של תאים חומצי והמיטו, בתאי עצב מוטוריים באמצעות מיקרופלואידיג צ'יימברס.

הובלה אקונלית של אורגלות בתרביות תאי עצב מוטוריים באמצעות מערכת צ'יימברס מיקרופלואידיג

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

למד שיטת נוזל בלחץ ליצירת דליות בריריות באקסונים של נוירונים היפוקמפיים מתורבתים. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנוני פלסטיות עצבית ופיתוח אסטרטגיות טיפול בפציעות מוח טראומטיות.

מערכת Microbiomechanical ללמוד היווצרות דליות, השחזור של אקסונים נוירון המרכזית

גלה סרטונים נוספים