שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאסוף ולמדוד באופן מדויק וניתן לשחזור רוק של עכברים בעקבות גירוי פילוקרפין. מדידת ייצור רוק במכרסמים היא הליך מאתגר, ונוטה לשונות גבוהה. שיטה זו פשוטה וניתן לחזור עליה על אותה חיה בנקודות הזמן המרובות של המחקר כולו.

שיטה זו יכולה לא רק למדוד את נפח הרוק המיוצר, היא יכולה לשמש גם לאיסוף הרוק לניתוח נוסף של מולקולות ביו-אקטיביות שעשויות להיות מופרשות ברוק. בסופו של דבר, זה יהיה שימושי מאוד בעת חקירת תסמונת סיוגרן, פיברוזיס של בלוטת הרוק או התחדשות בלוטות הרוק במערכות מודל מכרסמים. לצורך הליך זה, יש להכין ולהקפיא אליקוטים של פילוקרפין הידרוכלוריד, בני לא יותר משלושה חודשים.

אין להקפיא מחדש את כל החומרים המופשרים. התחל בהכנת צינורות מיקרופוגה של 0.6 מ"ל. אגרוף בזהירות חור קטן בתחתית הצינורות בעזרת מחט מחוממת בגודל 18.

צור צינור אחד לכל עכבר. לאחר מכן, הגדר את הצינורות הללו לצינורות של 2 מ"ל. סטריליות אינה דאגה.

לאחר מכן, בשיטות אספטיות, חותכים ספוגיות גליליות לאורכי שני סנטימטרים. לאחר מכן, חותכים כל חתיכה של שני סנטימטרים באלכסון כדי ליצור שתי ספוגיות בצורת חרוט. הנח ספוגית חרוטית אחת בכל אחד מצינורות המיקרופוגה המוכנים.

לאחר מכן, שקלו כל צינור של 0.6 מ"ל עם הספוגית היבשה שלו. כעת, העבירו את העכברים למחקר לכלוב נקי חדש. הם עשויים להיות מאוחסנים יחד.

במשך השעתיים הבאות, תנו להם מי קרח, אבל לא אוכל. רגע לפני סיום פרק הזמן של השעתיים, הכינו את תמיסת Pilocarpine העובדת על ידי דילול כמות של 100x מלאי במי מלח סטריליים עד פי 1. מערבל את הצינור, ושמור את התמיסה על קרח.

כדי להתחיל, שקלו כל עכבר כדי לחשב מינונים. לאחר מכן, הרדימו את העכברים עם זריקות תוך-צפקיות של קטמין בתוספת קסילזין. אם לאחר ארבע דקות עכבר אינו מורדם, התאם את המינון.

כעת, מרחו משחה תלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, העבירו את המינון המחושב של פילוקרפין לעכבר באמצעות מסלול תוך-צפק, והגדירו את הטיימר לשתי דקות. במהלך מרווח זה של שתי דקות, הכנס את העכבר לצינור ריסון של 50 מ"ל, כך שרק הראש והאוזניים יבלטו החוצה.

מקם את הצינור בזווית של 45 מעלות, כשראש העכבר כלפי מטה, ומשטח הגחון פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, אבטח את הצינור בעזרת סרט. מיד לאחר שתי הדקות, הרם את הלסת התחתונה כדי לפתוח את הפה, והכניס בעדינות מלקחיים סגורים, מילימטר עד שניים לתוך הפה.

ודא שהלשון מונחת על הזרוע העליונה של המלקחיים. ביד השנייה, השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי להחזיק את הספוגית היבשה שנשקלה מראש קרוב לקצה החרוטי שלה. לאחר מכן, החלק בעדינות את הקצה החרוטי של הספוגית לתוך הפה, ומשוך את המלקחיים תוך השארת קצה הספוגית בחלל הפה.

כעת, אחזו וסובבו את הספוגית עד שהיא יוצרת מגע מקסימלי עם הפה, וכדי שלא תיפול. הקצה הרחב של הספוגית חייב להישאר מחוץ לפה. שמור את המקלון במצב זה למשך רבע שעה.

לאחר רבע שעה, סובב בעדינות את הספוגית כדי לאסוף רוק שלא נספג. לאחר מכן, העבירו את הספוגית הספוגה ברוק בצינור המיקרופוגה של 0.6 מ"ל. מכסים את הצינור ומכניסים אותו לצינור של 2 מ"ל, המונח על קרח.

כעת, העבר את העכבר בחזרה לכלוב התאוששות. ספקו ג'ל דיאט או כדורי מזון לחים בכלוב כדי לעזור לו להתייבש מחדש. ניתן לתת גם זריקה תת עורית של 0.2 מ"ל מי מלח איזוטוני כדי להאיץ את ההחלמה.

לאחר איסוף כל דגימות הרוק, שקלו אותן כדי לקבוע את מסת הרוק שנאסף. חתכו את המכסים מצינורות 2 מ"ל המכילים את הצינור הקטן יותר של דגימת הרוק, ולאחר מכן העמיסו אותם לצנטריפוגה מקוררת, וסובבו אותם במשך שתי דקות ב-7,500 גרם ובארבע מעלות צלזיוס. הרוק יתאגד לתוך צינור שני מ"ל.

לאחר מכן, מדוד את נפחי הדגימות באמצעות מיקרופיפטה. ייצור הרוק נמדד בשש עכברים שחורים בני 11 שבועות C57 בשיטה המתוארת. במינון של 1 מיקרוגרם פילוקרפין לגרם משקל גוף, חלק מהעכברים החלו להראות סימני מצוקה.

היה קשר טוב בין תגובת מינון טובה בין פילוקרפין לייצור רוק. הייתה גם התאמה משמעותית בין משקל הרוק לנפח. באמצעות הטכניקה המתוארת, נמצאו הבדלים בין זן לזן ברוק.

זן העכברים 129 S6 ייצר את כמות הרוק הנמוכה ביותר. בניסוי לאיתור תת-תפקוד של בלוטות הרוק, הוזרקו ליפופוליסכרידים כדי להפעיל תגובה חיסונית מולדת. במהלך התגובה, עכברים ייצרו פחות רוק.

טקטיקה נוספת לגרימת תת-תפקוד של בלוטות הרוק הייתה להזריק לעכברים אלום אדג'ובנטי בתוספת נוגדנים נגד Ro52. בקרת הרכב טופלה רק עם אלום. ניתן היה לזהות זאת גם בטכניקה המתוארת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד באופן מדויק וניתן לשחזור את ייצור הרוק בעכברים. לאחר השליטה, ניתן להעריך עשרה עכברים תוך כשעתיים וחצי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עקבי ביותר בכל שלב, החל מהזרקות תוך צפקיות, ועד להנחת המקלון וניהול מרווחי זמן לכל שלב.

אל תשכח שפילוקרפין הידרוכלוריד פועל על מערכת הלב וכלי הדם, וגורם לברדיקרדיה וליתר לחץ דם. לכן, הזרקת פילוקרפין בעכברים צריכה להיעשות בזהירות.