השתלת תאי רקמת שומן-Derived גיליון כדי להפחית את זליגת לאחר קיצור קיבה חלקית במודל של עכברים

מכיוון שהם מניחים השפעה חיובית על ריפוי רקמות, יריעות ASC נבדקו במודלים רבים של מחלות, כגון אוטם שריר הלב. ניסוי זה מראה כי ניתן להשתמש ביריעות ASC תוך בטן ולמרוח על המעי. היתרון העיקרי של יריעות ASC הוא שאין צורך בחומרים סינתטיים.

בנוסף, השתלת יריעות ASC קלה יחסית לביצוע, עם מעט תרגול. יישום חדשני זה של השתלת יריעות ASC פותח כדי למנוע דליפה לאחר כריתת המעי, ומציע צעד ראשון לאסטרטגיה טיפולית חדשה. יריעות ASC המיושמות על אנסטומוזה במעי הוכחו כמבטיחות במניעת דליפה.

ניתן ליישם יריעות ASC גם על איברים תוך-בטניים אחרים, כגון דרכי השתן. התחל בניתוח רקמת שומן בטנית תת עורית אנושית לחתיכות של 0.5 ס"מ, עם להב כירורגי סטרילי בגודל 10, מלקחיים לרקמות אדסון-בראון ומספריים של מצנבאום. שקלו את הכמות הכוללת של רקמה מנותחת בבקבוק זכוכית סטרילי.

יש להוסיף 30 מ"ל של חומר בידוד לבקבוק. ולעכל את רקמת השומן המנותחת באינקובטור שייקר ב-150 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר שעה מחלקים את תמיסת הרקמה המעוכלת לצינורות של 50 מ"ל, וצנטריפוגה את הצינורות למשך 10 דקות בטמפרטורה של 390 גרם.לאחר הצנטריפוגה הסר את הסופרנטנט.

הוסף מדיום כדי להשהות מחדש את כדורי התא, והוסף עוד מדיום תרבית, עד 45 מ"ל. צנטריפוגה את התאים המשולבים למשך חמש דקות ב-390 גרם והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל מדיום תרבית.

ולסנן את מתלה התאים דרך מסנן 100 מיקרון. הוסף 50 ליטר של תמיסת מתילן כחולה של חומצה חומצית 3%, ל -50 ליטר של תרחיף תאים, כדי לכינים כדוריות דם אדומות. לאחר ערבוב התמיסה, פיפטה 10 ליטר על המוציטומטר וספרו את התאים.

צלחת התאים בצפיפות של 40000 תאים לסמ"ר, בבקבוק T175 המכיל מדיום תרבית. ולדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO2 למשך 24 שעות. למחרת, שטפו את התאים במי מלח חמים עם פוספט כדי להסיר פסולת תאים.

לאחר מכן, החלף את המדיום במדיום תרבית FBS של 10%, בתוספת חומצה אסקורבית-2-פוספט טרי וגורם גדילה פיברובלסטים רקומביננטי אנושי שני. דגירה עד שהתאים מגיעים למפגש של 90%. תת-תרבית של תאי גזע שומנים במפגש של 90%, תוך שימוש בתמיסה סטנדרטית של 0.25% טריפסין-EDTA.

לאחר שלוש עד חמש דקות יש לנטרל את תמיסת 0.25%Trypsin-EDTA עם 10 מ"ל מדיום תרבית. מעבירים לצינור צנטריפוגה, וצנטריפוגה את התאים למשך שמונה דקות ב -250 גרם.הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים ב -1 מ"ל של מדיום תרבית. לאחר ספירת התאים עם המוציטומטר, צלחו את התאים בצלוחיות תרבית T175, בצפיפות של 8000 תאים לסמ"ר.

הקפיאו את שאר ה-ASCs בחנקן נוזלי, עם 10% דימתיל סולפוקסיד במדיום תרבית לפני שימוש נוסף. ציפוי מקדים של כלי תרבית מגיבים תרמו בקוטר 3.5 ס"מ, עם 1 מ"ל סרום בקר עוברי. לאחר מכן מניחים את הכלים בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות לפחות לפני הזריעה.

כדי לסייע להידבקות ASC למנה המגיבה לחום, ולהפחית את הסיכון לניתוק מוקדם של יריעות ASC בתרבית, יש לצפות את המנה המגיבה לחום בסרום בקר עוברי לפני זריעת התאים. נסה ASCs כמו קודם, אם יש גושי תאים לאחר טריפסיניזציה, סנן את התאים דרך מסנן של 100 מיקרון לפני הספירה. מוציאים את הכלים מהחממה, ומעבירים לצלחת מחממת בחום של 37 מעלות צלזיוס.

הסר FBS מהצלחת. לאחר השעיית כדור התא ב-LG DMEM, עם 10% FBS, וספירת התאים, יש לדלל 3.52 פעמים 10 ל-6 ASCs ב-2 מ"ל של מדיום תרבית למנה, כדי לזרוע 400,000 תאים לסמ"ר בכל צלחת של 3.5 ס"מ. מחלקים בזהירות את התאים בצורה אחידה ככל האפשר, על ידי הנפת המנה בעדינות.

לאחר מכן, תרבית יריעות ASC במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה עם 5% CO2. ביום ההשתלה, אפשר לכלי התרבות להתקרר לטמפרטורת החדר 40 דקות לפני השתלת in vivo כדי להקל על ניתוק יריעות ASC. לאחר הקירור, הסר את מצע התרבית והחלף אותו ב-1 מ"ל של LG DEM ללא סרום.

כדי להשתיל את יריעת התא, תפסו בעדינות את קצה יריעת ה-ASC בעזרת מלקחיים אטראומטיים והניחו את צד המנה של יריעת ה-ASC על גבי הקו האנטומוטי. טיפול עדין ביריעות ומיקום נכון של יריעות חיוניים כדי להבטיח השתלת יריעות שלמות מוצלחת. מתחו בזהירות את יריעת ה- ASC לכ- 0.25 ס"מ מעל ומתחת לקו האנטומוטי.

עטפו את הסדין סביב המעי הגס, הרימו את המעי הגס, כדי לעטוף את יריעת ה- ASC סביב הצד הגב. חיות ביקורת, שלא קיבלו יריעות ASC מושתלות, מציגות דליפת צואה ליד הקו האנטומוטי, המסומן על ידי החץ הלבן ביום השלישי שלאחר הניתוח. בעלי חיים אלה עם יריעות ASC מושתלות, המסומנות על ידי החץ השחור, הראו דליפת צואה מופחתת והיווצרות מורסה ביום השלישי שלאחר הניתוח.

אותה תוצאה נצפתה שבעה ימים לאחר הניתוח. תמונה זו מציגה חתך מייצג של אתר האנסטומוזה של המעי הגס בבעל חיים מושתל מוכתם ב-H ו-E.ניתן לזהות את מבנה היריעה באתר האנסטומוזיס, עד שבעה ימים לאחר הניתוח. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר דקות אם היא מבוצעת כראוי.

גיליון ASC יידבק באופן ספונטני למשטח התא האפס של המעי הגס, אין צורך להשתמש בדבק או תפר כדי להתאים ליריעת ה- ASC. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ולהשתיל יריעות ASC על אנסטומוזה של המעי הגס בחולדות, למניעת דליפה לאחר כריתת מעי גס חלקית.