בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca^{2 +}-הדמיה, מבחני Degranulation

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות התוך-תאי על תאים מעוררים, כגון אילו תעלות יונים קריטיות להפעלת תאי חיסון ושחרור מתווך. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם הפשטות היחסית שלהן והאפשרות לניתוח בו זמנית של מספר רב של תאים. מי שתדגים דימות סידן Fura-2 בתאי פיטום תהיה קתרין אולנשלאגר, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לרסס את העכבר המורדם באתנול 70% ולקבע אותו על גוש קצף כשהצד הגבי שלו כלפי מטה באמצעות סיכות. בעזרת מספריים קהים, הסר את העור מעל בטן העכבר והימנע מפגיעה בחלל הצפק. לאחר מכן, הזרקו שבעה מיליליטר של מדיום RPMI קר כקרח לחלל הצפק על ידי החדרת מחט 27 בזהירות לצפק.

אין לנקב איברים כלשהם, והשתמש בנקודה באזור השומן האפידידימלי כדי להפחית את הסיכון לניקוב איברים. לאחר ההזרקה, יש לנער את העכבר למשך דקה אחת כדי לנתק את תאי הצפק למדיום RMPI. אל תנער את העכבר חזק מדי כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים וזיהום חלל הצפק בדם.

לאחר מכן, עשה שימוש חוזר במזרק על ידי ציודו בצינורית חדשה בגודל 20. העבירו את האיברים הפנימיים לצד אחד על ידי הטיית גוש הקצף והקשה עליו בעדינות על הספסל כדי להקל על השאיפה הבינונית מהצד השני. לאחר מכן, הכנס שיפוע מחט בגודל 20 כדי לשאוב את הנוזל מהבטן בעדינות ובאיטיות כדי למנוע סתימה על ידי האיברים הפנימיים.

אסוף כמה שיותר נוזלים. לאחר מכן, הסר את המחט מהמזרק והעביר את תרחיף התאים שנאסף בצינור איסוף על קרח. השלך צינור דגימה אם יש זיהום דם גלוי.

צנטריפוגה את הצינור עם מתלה תאים נקי ב -300 גרם למשך חמש דקות. מתחת למכסה מנוע סטרילי, שאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדורי הדגימה במדיום PMC קר והעבירו את תרחיף התאים לבקבוק תרבית תאים בגודל 25 סנטימטר רבוע.

לאחר מכן, הוסף את גורמי הגידול IL-3 ו-SCF לריכוזים הסופיים של 10 ננוגרם למיליליטר ו-30 ננוגרם למיליליטר, בהתאמה. דגרו על התאים למשך כ-48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להליך הבא. בימים 12 עד 15, אם מתוכננים ניסויים כלשהם עם גירוי של קולטני IgE פלסמליים, טפל בתאים למשך הלילה עם 300 ננוגרם למיליליטר של IgE anti-DNP במדיום תרבית סטנדרטי.

להכנת הדמיית Fura-2, יש לדלל את תמיסת מלאי Fura-2, AM בסידן HBSS לריכוז סופי של חמישה מיקרומולר על מנת להכין את מאגר הטעינה. לאחר מכן, מערבבים 500 מיקרוליטר ממאגר הטעינה עם 500 מיקרוליטר של מתלה תא PMC. הכניסו את התערובת לתוך תא ההדמיה ודגרו על התאים למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.

הגדר את מערכת היישומים המוזנת בכוח הכבידה עם פתרונות שונים בהתאם לפרוטוקול הגירוי. לאחר מכן, התקן את מערכת היישומים על במת המיקרוסקופ ההפוך. הכן יעד טבילה בשמן בעל צמצם גבוה פי 40 על ידי הנחת טיפה קטנה של שמן טבילה.

הנח את תא ההדמיה עם התאים הטעונים במערכת היישומים ואבטח אותו כדי למנוע תנועה במהלך ההקלטה. לאחר מכן, הפעל את האור המועבר והתמקד בתאים. לאחר מכן, התחל את תוכנית רכישת ההדמיה במצב רכישה פיזיולוגית.

פתח את חלון ההתקנה והתאם את המיקוד ואת זמן הרכישה האופטימלי. צלם תמונת הפניה וסמן את התאים כהחזר על ההשקעה. סמן את ההחזר על ההשקעה האחרון באזור שבו אין תאים והגדר אותו כרקע.

לאחר מכן, השלם את ההגדרה והתחל את המדידה בקצב רכישה של חמש שניות. לאחר מכן, הוסף פתרונות במספר המחזור המתאים בהתאם לתכנון הניסוי. כדי למדוד את העלייה הנגרמת על ידי אנטיגן של ריכוז הסידן התוך-תאי, יש למרוח את תמיסת המזרק-2 לאחר מחזור 20 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 150.

כדי למדוד את העלייה הנגרמת על ידי תרכובת 48/80 של ריכוז הסידן התוך-תאי, יש למרוח את תמיסת המזרק-שלוש לאחר מחזור 20 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 150. כדי למדוד את העלייה בריכוז הסידן התוך תאי המעורר על ידי SOCE, יש למרוח את תמיסת המזרק-ארבע לאחר מחזור 10, למרוח את תמיסת המזרק-חמש לאחר מחזור 70, למרוח את תמיסת המזרק-ארבע לאחר מחזור 120, למרוח את תמיסת המזרק-אחד לאחר מחזור 150 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 220. בתוכנית הרכישה, לחץ ברצף על הכפתורים התחל חותך, סמן הכל, המר הכל, מדידות פיזיולוגיה, אישור ולאחר מכן אישור שוב.

שמור את הקבצים כטבלאות וכאוספי תמונות לניתוח לא מקוון. כדי למדוד שחרור בטא-הקסוזמינידאז, העבירו 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לבאר לצלחת באר עם תחתית V של 96 בארות. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת גירוי או בקרה לכל באר.

לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עצרו את התגובה על ידי הנחת צלחת 96 הבארות על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות בחום של 120 גרם.

העבירו 120 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת שטוחה של 96 בארות והניחו אותה על קרח. הימנע בזהירות מלגעת בכדורי התא, אך שאף לחלוטין את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכדורי התא.

דגרו את כדורי התא למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשעו אותם מחדש לאחר הדגירה על ידי פיפטינג חוזר ונשנה. פיפטה 25 מיקרוליטר של תמיסת pNAG של ארבעה מילי-מולרים בבארות הנדרשות של צלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. הוסף 25 מיקרוליטר מכל סופרנטנט ו -25 מיקרוליטר מכל ליזאט תא בנפרד לתמיסת ה- pNAG המוכנה.

דגרו את קבוצות התגובה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה 150 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, נתח את ספיגת האור של דגימת הצלחת עם קורא מיקרו-לוחות ב-405 ננומטר עם התייחסות של 630 ננומטר לחיסור רקע אוטומטי.

בתוכנית הרכישה, סמן את התיבה התייחסות, ובתפריט אלמנט תוכנית הספיגה, בחר 630 ננומטר לחיסור רקע אוטומטי. בדיקת שחרור בטא-הקסוזמינידאז בוצעה כדי לבדוק את יכולתם של ה-PMCs המבודדים שעוברים דה-גרנולציה עם קישור צולב של קולטני IgE בעלי זיקה גבוהה או גירוי של קולטני MRG PRB2. התאים נוספו לצלחת של 96 בארות בתחתית V ועוררו על פי תוכנית זו למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הכדורים עברו ליזה. תכולת הבטא-הקסוזמינידאז של סופרנטנטים בודדים וליזטים של כדורים נותחה לאחר מכן על ידי תגובותיהם עם pNAG במהלך דגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס. כמות תוצרי התגובה זוהתה באופן קולורימטרי וחושב אחוז הבטא-הקסוזמינידאז המשוחרר.

השחרור הספונטני היה נמוך מאוד, בעוד שהתגובות לגירויים חזקים של דה-גרנולציה, כגון 10 יונומיצין מיקרו-מולרי ותרכובת 48/80 ב-50 מיקרוגרם למיליליטר, היו מעל 40% ו-60% בהתאמה. תגובות הדגרנולציה לגירוי DNP היו תלויות במינון בטווח הריכוזים של 10 עד 300 מיליגרם למיליליטר. יחד, נתונים אלה מצביעים בבירור על מצב תפקודי טוב של ה-PMCs המבודדים.

באמצעות טכניקה זו, תקבל אוכלוסייה טהורה ביותר של תאי פיטום רקמת חיבור בוגרים של עכברים שמקורם בצפק תוך שבועיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים סטריליים במהלך בידוד התאים ותרבית כדי למנוע זיהום חיידקי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מדידות זרם יונים אלקטרופיזיולוגיות על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למסלולי כניסת סידן בתאי פיטום.

לאחר פיתוחה, טכניקת הדמיית הסידן התוך-תאית Fura-2 סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של תאי מסה לחקור את התלות בסידן של דה-גרנולציה של תאי פיטום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי הדמיית סידן Fura-2 ובדיקת דה-גרנולציה של בטא-הקסוזמינידאז עם תאי פיטום. אל תשכח שעבודה עם קרינת UV עלולה להיות מסוכנת לעיניים ולעור, ויש להימנע מחשיפה מיותרת בעת ביצוע הליך זה.