Name: בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למדו לבודד ולגדל תאי פיטום מצפק עכברים ולאפיין אותם פונקציונלית באמצעות הדמיית סידן Fura-2 ומבחני שחרור בטא-הקסוזאמינידאז. שיטות אלו מאפשרות ניתוח מקבילי של מספר רב של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להכיר ג'וליה Geminn לקבלת סיוע טכני בארצות culturing והכנה תא פיטום. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז לחקר שיתופי Transregional (TR-SFB) 152.

<ol><li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+mast+cells%3A+negative%2C+as+well+as+positive%2C+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li>
<li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li>
<li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li>
<li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7508174">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li>
<li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+as+%22tunable%22+effector+and+immunoregulatory+cells%3A+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li>
<li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+Ca%282%2B%29+signaling+in+mast+cells%3A+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li>
<li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li>
<li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150(2014).</li>
<li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-specific+Cre%2FloxP-mediated+recombination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li>
<li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+cell-derived+mast+cells%3A+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3838314">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+release+of+beta-hexosaminidase+and+beta-glucuronidase+from+purified+rat+serosal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells.</a> J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).</li>
<li>Schafer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+anaphylatoxin+receptor+expression+can+enhance+IgE-dependent+skin+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).</li>
<li>Maurer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+promote+homeostasis+by+limiting+endothelin-1-induced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity.</a> Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).</li>
<li>Maurer, M., Church, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H%281%29-antihistamines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li>
<li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li>
<li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366(2017).</li>
<li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li>
<li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li>
<li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2531691">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li>
<li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell+mediators%3A+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569(2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

דגמי MC יכול לשמש בהצלחה ללמוד MC degranulation, כימוטקסיס, הדבקות, כמו גם באשר להסבר תאיים איתות התמרה חושית המסלולים המעורבים הפעלה MC. יש חוקרים שימוש אנושי MCs מודלים, כגון קווים מונצחים (LAD2 ו- HMC1) או MCs אנושי הנגזר כבל דם ובתאים (CD133 +) ודם היקפיים ובתאים (CD34 +). אחרים יעדיפו מכרסמים MC מודלים, כגון מונצחים (חולדה basophilic לוקמיה RBL - 2H 3 MC קו) או ראשי תרבותי (עכבר עצם מח-נגזר MCs BMMCs, PMCs) מודלים. מאתר MCs הראשי יכול לשמש כדי לנתח את הפונקציה MC אינספור דגמים העכבר "הנוק-אאוט", אשר הגישה תקן הזהב ח...

MCs תפקיד בולט במהלך תגובות חיסוניות מולדת ולא נרכשת. באופן ספציפי, MCs להשתתף ברצח של פתוגנים, כגון חיידקים, טפילים, ולבזות גם פפטידים אנדוגני רעיל או הרכיבים של venoms (עבור ראה סקירה גאלי ואח . 20081). תפקיד פיזיולוגי MCs חסינות מולדת, מסתגלת הוא הנושא של ויכוחים. לכן, הסתירות נתונים רבות במחקרים המתבצעים באמצעות מודלים שונים של העכבר חשוכת-MC דורשים הערכה מחדש שיטתית של פונקציות אימונולוגי של MCs מעבר אלרגיה2. MCs בוגרת מותאמים בעיקר רקמות ואיברים כגון עור, ריאות, בטן, נמצאים בדרך כלל רק במספרים קטנים בדם. MCs שואבים מבשרי hematopoietic, כגון MC אבות, והשלם שלהם בידול ההבשלה ב microenvironments של רקמות vascularized כמעט כל1. T-תא-derived factor אינטרלויקין (IL)-3 מקדם באופן סלקטיבי את הכדאיות, התפשטות, הבידול של אוכלוסיה pluripotent של העכבר MCs שלהם אבות hematopoietic3. תא גזע פקטור (SCF) המיוצר על ידי בתאי הרקמות מבנית ומשחק תפקיד מכריע MC פיתוח, הישרדות, הגירה, הפונקציה4. המאפיינים של MCs בודדות עשויות להשתנות בהתאם יכולתם לסנתז ולאחסן פרוטאזות או proteoglycans שונים. בעכברים, נבדלים של MCs כביכול רקמת חיבור מסוג MCs הרירית על פי שלהם לוקליזציה אנטומיים, מורפולוגיה ותוכן של הפארין ו פרוטאזות5.
ב MCs, גידול של חינם Ca cytosolic2 + ([Ca2 +]אני) היא הכרחית על degranulation וייצור של eicosanoids, כמו גם עבור הסינתזה של ציטוקינים והפעלה של גורמי שעתוק בתגובה אנטיגן, שונים secretagogues6. יעד במורד הזרם של גירויים אלה הוא phospholipase C, אשר הידרוליזה phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate diacylglycerol (DAG), אינוזיטול טריפוספט-1,4,5. דאג מפעיל חלבון קינאז C ו- IP3 משחרר יונים של Ca2 + מ רשתית תוך-פלזמית. דלדול של חנויות אלה מפעיל Ca2 + זרם דרך קרום פלזמה Ca2 + ערוצים, מובילים כדי לאחסן ערך סידן המופעלים (SOCE). תהליך זה ברמיזות האינטראקציה של Ca2 +-חיישן, אינטראקציה סטרומה המולקולה 1-(Stim1), רשתית תוך-פלזמית עם Orai17 , כמו גם דרך ההפעלה של ערוץ פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPC) הקנונית חלבונים (עבור סקירה ראה Freichel. et al. 20148) ב קרום פלזמה.
ללמוד תפקיד פיזיולוגי של הערוצים הללו, מספר תרופתי (יישום של חוסמי ערוצים) או גישות גנטיות משמשים בדרך כלל. במקרה האחרון, דיכוי של ביטוי חלבון מושגת על ידי מיקוד mRNA (נוקאאוט) או דנ א גנומי עריכה עם מחיקת גלובלי או רקמות ספציפיות9 אקסון קידוד נקבובית ויוצרים יחידת משנה של ערוץ (הסתרה). הזמינות של חוסם עם ירידה לפרטים מספיק עבור הערוצים הללו הוא מוגבל. בנוסף, הגישה תמונות ציפורים דורש זהירות השליטה שלה ולייעל באמצעות, למשל-מערביות, כתם ניתוח, היא הקשו על ידי אי זמינות של נוגדנים ספציפיים עבור החלבון ערוץ יישוב במקרים רבים. לפיכך, השימוש של נוקאאוט העכבר מודלים עדיין נחשב תקן הזהב לניתוח כזה. מודל המועדפת במבחנה על חקירת פונקציות MC היא טיפוח של PMCs זה יכול להיות מבודד שמחוץ כאוכלוסייה לבגרות מלאה (לעומת הבחנה MCs במבחנה מ, למשל., תאים במח העצם)10 . לעומת מח עצם נגזר MCs (BMMCs), אשר גם משמשות ללמוד MC פונקציה במבחנה, הגירוי של FcεRI ובטא-ההקסוזאמינידאז שחרור גדל 8-fold ו 100-fold ב PMCs, בהתאמה. במאמר זה נתאר שיטת בידוד ואת טיפוח של מאתר PMCs, אשר מאפשר להשיג לאחר 2 שבועות של culturing מספר גבוה של רקמת חיבור טהור הקלד MCs, מספיקים לצורך ניתוח נוסף.
למרות התקדמותו האחרונה של פיתוח, יישום של סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים, השימוש שלהם עדיין מוגבל על ידי קשיים בלידה של גנים לתאים היעד, באופן ספציפי, בתאים הפערים מיוחדים כגון ראשי MCs בתרבית. בנוסף, קבוצה זו של אינדיקטורים פלורסנט למדידות [Ca2 +]אני עדיין חסרה רציומטרי צבע עם טווח דינמי גבוה. מסיבות אלו, השיטה המועדפת על רציומטרי [Ca2 +]אני מידה הוא עדיין השימוש הפלורסנט "Fura-2"11.
כיום, הכי נפוץ הגישה על ההערכה של הפעלת MC, degranulation המדידה של β-ההקסוזאמינידאז פעילות. Β-ההקסוזאמינידאז, מתווך אלרגי, הוא אחד מרכיבי גרגר של MC זה שפורסמו במשותף עם היסטמין ביחס קבוע MCs12. Β-ההקסוזאמינידאז ניתן בקלות ובדייקנות למדוד באמצעות התגובה שלה עם מצע ספציפיים, אשר מייצרת כמות למדידה של מוצר colorigenic יצירותי ב assay ערכי צבע מוחלטים microplate. במאמר זה, מדווח יישום שיטה זו לניתוח של PMCs degranulation בתגובה מגוון רחב של גירויים.
צבירה של זיקה גבוהה קולטן IgE plasmalemmal (FcɛRI) מפעילה ב MCs רב-תכליתי תאיים איתות שביל, המוביל אל שחרור של גרגר הפרשה תוכן במרחב שמסביב חוץ-תאית. בנוסף אנטיגן ספציפי, הרבה גירויים אחרים יכולים להפעיל MCs לשחרר את מערך מגוון של מגשרים immunomodulatory, כגון anaphylatoxins המשלים (למשל., C3a, C5a)13, endothelin פפטיד את מצר את כלי הדם 1 (ET1)14 , כמו כן כמו רבים cationic חומרים ותרופות מעוררות תגובות pseudoallergic (למשל., icatibant)15 על ידי איגוד MRGPRX216. תאיים המעורבים MCs MRGPR-induced degranulation איתות המסלולים מאופיינים לקוי לעומת בתיווך FcɛRI איתות תאיים; המסלולים הללו רק החל להילמד באופן אינטנסיבי במהלך האחרון כמה שנים17 לאחר ה-זיהוי הקולטן16. במידה רבה, תעלות היונים קרום פלזמה מעורב ערך סידן ואחריו MRGPRX2 גירוי להישאר להיות מובן. לכן, המאמר הנוכחי מתמקד גם סידן תאיים באיתות, degranulation של MCs מגורה עם אגוניסטים MRGPR.

<table><tbody><tr><td>RPMI Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Thermo Scientific</td><td>R92157</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>PMC2115</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2272</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים נגד DNP&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D-8406</td><td></td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>תרמו מדעי</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת 48/80&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2313</td><td></td></tr><tr><td>4-(1,1,3,3-טטרמתילבוטיל)פניל-פוליאתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>4-ניטרופניל 2-אצטמידו-2-דאוקסי-ובטא;-D-גלוקופירנוסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N9376</td><td></td></tr><tr><td>תא הדמיה</td><td>של CoverWell סיגמא-אולדריץ'</td><td>GBL635051</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות, תחתית בצורת V&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות, תחתית שטוחה</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות מיקרוטיטר עם תוכנת "i-control"&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Nano Quant, צלחת תחתונה שטוחה M200 Pro</td><td></td>אינסופית</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>יונומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפלסטיק</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבות (25 ס"מ)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>69160</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי כפתור משקפיים עגול; &oslash; 25 מ"מ; מס' 1</td><td>Menzel</td><td>CB00250RA1</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td>Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td><td>Zeiss</td><td>440260-9900</td><td></td></tr><tr><td>סט מסננים HC Fura 2&nbsp;</td><td>AHF</td><td>H76-521</td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam MRm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור מונוכרומטי</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Imaging Acquisition Program</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision 4.8.2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מערכת יישום פתרון מוזן בכוח הכבידה</td><td>מותאם אישית 4</td><td>ערוצים</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפלסטיק</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>ספסל צנטריפוגה</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 1.0R</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם ca2 +-הדמיה, מבחני degranulation

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

תאי פיטום (MCs), כחלק של המערכת החיסונית, לשחק תפקיד מרכזי בהגנה על המחשב המארח נגד פתוגנים מספר, אתחול של התגובה החיסונית אלרגית. ההפעלה של MCs דרך cross-linking של משטח IgE מאוגד לקולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI), וכן באמצעות הגירוי של מספר רצפטורים אחרים, יוזם את עליית חינם תאיים Ca2 + רמת ([Ca2 +]אני) זה מקדם את השחרור של מתווכים דלקתיים ואני אלרגית. זיהוי מולקולרי המרכיבים המעורבים איתות המסלולים האלה חיונית להבנת ברגולציה של הפונקציה MC. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול הבידוד של רקמת חיבור מאתר סוג MCs על ידי שטיפת הצפק, טיפוח של MCs הצפק (PMCs). של מודלים שונים של העכבר נוקאאוט על ידי מתודולוגיה זו תרבויות של MCs מייצגים גישה שימושי לזיהוי של החלבונים המעורבים MC מסלולי איתות. בנוסף, אנו גם לתאר את פרוטוקול תא בודד Fura-2 הדמיה כמו טכניקה חשוב עבור כימות של Ca2 + איתות ב MCs. מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית ניטור של [Ca2 +]אני הוא אמין, נפוץ גישה לימוד Ca2 + איתות האירועים, כולל ערך סידן המופעלים באמצעות החנות, אשר הוא בעל חשיבות עליונה עבור הפעלת MC. לניתוח של MC degranulation, נתאר assay שחרור של β-ההקסוזאמינידאז. הכמות של β-ההקסוזאמינידאז שוחרר לתוך המדיום תרבות נחשב סמן degranulation כל שלושה שונים הפרשה קבוצות משנה שמתואר MCs. β-ההקסוזאמינידאז בקלות ניתן לכמת את התגובה שלה עם מצע colorigenic ב צלחת microtiter assay ערכי צבע מוחלטים. טכניקה מאוד לשחזור זו היא חסכונית ואינו דורש שום ציוד מיוחד. בסך הכל, פרוטוקול שסופקו מדגים תשואה גבוהה של MCs ביטוי אופייני MC סמני פני השטח, הצגת תכונות אופייניות פנוטיפי מורפולוגיים של MCs ולאחר הוכחת תגובות מאוד לשחזור secretagogues ב Ca2 +- מבחני הדמיה ו degranulation.

PMCs הם בודדו אותנו מהמתרחש פראי סוג 3 עכברים (C57BL/6N) על ידי שטיפה בקרום הבטן ואת עוד יותר בתרבית בינוני RPMI בתוספת עם FCS 20%, 1% עט-דלקת בנוכחות גורמי גדילה (IL-3-10 ng/mL) ו- SCF ב 30 ננוגרם למ"ל תחת סטרילי humidified תנאים- 37 ° C ו- 5% CO2. המדיום השתנה בימים 2 ו- 9 לאחר הבידוד התא. המורפולוגיה תא נותחו באמצעות שידור אור DIC הדמיה (ראה איור 1A, B). תא ניגוד בין צפיפות הפגינו תא טוב הכדאיות. לאחר 2 שבועות של culturing בתנאי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד ולטפח מאתר תאי פיטום הצפק. אנו גם מתארים שני פרוטוקולים עבור שלהם אפיון פונקציונלי: הדמיה פלורסנט תאיים חינם Ca2 + ריכוז ואת וזמינותו degranulation בהתבסס על ערכי צבע מוחלטים כימות β-ההקסוזאמינידאז שוחרר.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות התוך-תאי על תאים מעוררים, כגון אילו תעלות יונים קריטיות להפעלת תאי חיסון ושחרור מתווך. היתרונות העיקריים של טכניקות אלה הם הפשטות היחסית שלהן והאפשרות לניתוח בו זמנית של מספר רב של תאים. מי שתדגים דימות סידן Fura-2 בתאי פיטום תהיה קתרין אולנשלאגר, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, יש לרסס את העכבר המורדם באתנול 70% ולקבע אותו על גוש קצף כשהצד הגבי שלו כלפי מטה באמצעות סיכות. בעזרת מספריים קהים, הסר את העור מעל בטן העכבר והימנע מפגיעה בחלל הצפק. לאחר מכן, הזרקו שבעה מיליליטר של מדיום RPMI קר כקרח לחלל הצפק על ידי החדרת מחט 27 בזהירות לצפק.אין לנקב איברים כלשהם, והשתמש בנקודה באזור השומן האפידידימלי כדי להפחית את הסיכון לניקוב איברים. לאחר ההזרקה, יש לנער את העכבר למשך דקה אחת כדי לנתק את תאי הצפק למדיום RMPI. אל תנער את העכבר חזק מדי כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים וזיהום חלל הצפק בדם.לאחר מכן, עשה שימוש חוזר במזרק על ידי ציודו בצינורית חדשה בגודל 20. העבירו את האיברים הפנימיים לצד אחד על ידי הטיית גוש הקצף והקשה עליו בעדינות על הספסל כדי להקל על השאיפה הבינונית מהצד השני. לאחר מכן, הכנס שיפוע מחט בגודל 20 כדי לשאוב את הנוזל מהבטן בעדינות ובאיטיות כדי למנוע סתימה על ידי האיברים הפנימיים.אסוף כמה שיותר נוזלים. לאחר מכן, הסר את המחט מהמזרק והעביר את תרחיף התאים שנאסף בצינור איסוף על קרח. השלך צינור דגימה אם יש זיהום דם גלוי.צנטריפוגה את הצינור עם מתלה תאים נקי ב -300 גרם למשך חמש דקות. מתחת למכסה מנוע סטרילי, שאפו את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדורי הדגימה במדיום PMC קר והעבירו את תרחיף התאים לבקבוק תרבית תאים בגודל 25 סנטימטר רבוע.לאחר מכן, הוסף את גורמי הגידול IL-3 ו-SCF לריכוזים הסופיים של 10 ננוגרם למיליליטר ו-30 ננוגרם למיליליטר, בהתאמה. דגרו על התאים למשך כ-48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להליך הבא. בימים 12 עד 15, אם מתוכננים ניסויים כלשהם עם גירוי של קולטני IgE פלסמליים, טפל בתאים למשך הלילה עם 300 ננוגרם למיליליטר של IgE anti-DNP במדיום תרבית סטנדרטי.להכנת הדמיית Fura-2, יש לדלל את תמיסת מלאי Fura-2, AM בסידן HBSS לריכוז סופי של חמישה מיקרומולר על מנת להכין את מאגר הטעינה. לאחר מכן, מערבבים 500 מיקרוליטר ממאגר הטעינה עם 500 מיקרוליטר של מתלה תא PMC. הכניסו את התערובת לתוך תא ההדמיה ודגרו על התאים למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.הגדר את מערכת היישומים המוזנת בכוח הכבידה עם פתרונות שונים בהתאם לפרוטוקול הגירוי. לאחר מכן, התקן את מערכת היישומים על במת המיקרוסקופ ההפוך. הכן יעד טבילה בשמן בעל צמצם גבוה פי 40 על ידי הנחת טיפה קטנה של שמן טבילה.הנח את תא ההדמיה עם התאים הטעונים במערכת היישומים ואבטח אותו כדי למנוע תנועה במהלך ההקלטה. לאחר מכן, הפעל את האור המועבר והתמקד בתאים. לאחר מכן, התחל את תוכנית רכישת ההדמיה במצב רכישה פיזיולוגית.פתח את חלון ההתקנה והתאם את המיקוד ואת זמן הרכישה האופטימלי. צלם תמונת הפניה וסמן את התאים כהחזר על ההשקעה. סמן את ההחזר על ההשקעה האחרון באזור שבו אין תאים והגדר אותו כרקע.לאחר מכן, השלם את ההגדרה והתחל את המדידה בקצב רכישה של חמש שניות. לאחר מכן, הוסף פתרונות במספר המחזור המתאים בהתאם לתכנון הניסוי. כדי למדוד את העלייה הנגרמת על ידי אנטיגן של ריכוז הסידן התוך-תאי, יש למרוח את תמיסת המזרק-2 לאחר מחזור 20 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 150.כדי למדוד את העלייה הנגרמת על ידי תרכובת 48/80 של ריכוז הסידן התוך-תאי, יש למרוח את תמיסת המזרק-שלוש לאחר מחזור 20 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 150. כדי למדוד את העלייה בריכוז הסידן התוך תאי המעורר על ידי SOCE, יש למרוח את תמיסת המזרק-ארבע לאחר מחזור 10, למרוח את תמיסת המזרק-חמש לאחר מחזור 70, למרוח את תמיסת המזרק-ארבע לאחר מחזור 120, למרוח את תמיסת המזרק-אחד לאחר מחזור 150 ולהפסיק את הרישום לאחר מחזור 220. בתוכנית הרכישה, לחץ ברצף על הכפתורים התחל חותך, סמן הכל, המר הכל, מדידות פיזיולוגיה, אישור ולאחר מכן אישור שוב.שמור את הקבצים כטבלאות וכאוספי תמונות לניתוח לא מקוון. כדי למדוד שחרור בטא-הקסוזמינידאז, העבירו 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לבאר לצלחת באר עם תחתית V של 96 בארות. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת גירוי או בקרה לכל באר.לאחר מכן, דגרו על התאים למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, עצרו את התגובה על ידי הנחת צלחת 96 הבארות על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות בחום של 120 גרם.העבירו 120 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצלחת שטוחה של 96 בארות והניחו אותה על קרח. הימנע בזהירות מלגעת בכדורי התא, אך שאף לחלוטין את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 125 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכדורי התא.דגרו את כדורי התא למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשעו אותם מחדש לאחר הדגירה על ידי פיפטינג חוזר ונשנה. פיפטה 25 מיקרוליטר של תמיסת pNAG של ארבעה מילי-מולרים בבארות הנדרשות של צלחת חדשה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. הוסף 25 מיקרוליטר מכל סופרנטנט ו -25 מיקרוליטר מכל ליזאט תא בנפרד לתמיסת ה- pNAG המוכנה.דגרו את קבוצות התגובה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, פיפטה 150 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לכל באר כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, נתח את ספיגת האור של דגימת הצלחת עם קורא מיקרו-לוחות ב-405 ננומטר עם התייחסות של 630 ננומטר לחיסור רקע אוטומטי.בתוכנית הרכישה, סמן את התיבה התייחסות, ובתפריט אלמנט תוכנית הספיגה, בחר 630 ננומטר לחיסור רקע אוטומטי. בדיקת שחרור בטא-הקסוזמינידאז בוצעה כדי לבדוק את יכולתם של ה-PMCs המבודדים שעוברים דה-גרנולציה עם קישור צולב של קולטני IgE בעלי זיקה גבוהה או גירוי של קולטני MRG PRB2. התאים נוספו לצלחת של 96 בארות בתחתית V ועוררו על פי תוכנית זו למשך 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.לאחר צנטריפוגה והסרת הסופרנטנט, הכדורים עברו ליזה. תכולת הבטא-הקסוזמינידאז של סופרנטנטים בודדים וליזטים של כדורים נותחה לאחר מכן על ידי תגובותיהם עם pNAG במהלך דגירה של שעה ב-37 מעלות צלזיוס. כמות תוצרי התגובה זוהתה באופן קולורימטרי וחושב אחוז הבטא-הקסוזמינידאז המשוחרר.השחרור הספונטני היה נמוך מאוד, בעוד שהתגובות לגירויים חזקים של דה-גרנולציה, כגון 10 יונומיצין מיקרו-מולרי ותרכובת 48/80 ב-50 מיקרוגרם למיליליטר, היו מעל 40% ו-60% בהתאמה. תגובות הדגרנולציה לגירוי DNP היו תלויות במינון בטווח הריכוזים של 10 עד 300 מיליגרם למיליליטר. יחד, נתונים אלה מצביעים בבירור על מצב תפקודי טוב של ה-PMCs המבודדים.באמצעות טכניקה זו, תקבל אוכלוסייה טהורה ביותר של תאי פיטום רקמת חיבור בוגרים של עכברים שמקורם בצפק תוך שבועיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תנאים סטריליים במהלך בידוד התאים ותרבית כדי למנוע זיהום חיידקי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מדידות זרם יונים אלקטרופיזיולוגיות על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות למסלולי כניסת סידן בתאי פיטום.לאחר פיתוחה, טכניקת הדמיית הסידן התוך-תאית Fura-2 סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של תאי מסה לחקור את התלות בסידן של דה-גרנולציה של תאי פיטום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי הדמיית סידן Fura-2 ובדיקת דה-גרנולציה של בטא-הקסוזמינידאז עם תאי פיטום. אל תשכח שעבודה עם קרינת UV עלולה להיות מסוכנת לעיניים ולעור, ויש להימנע מחשיפה מיותרת בעת ביצוע הליך זה.

isolation-peritoneum-derived-mast-cells-their-functional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

סרטון זה מדגים בדיקה קולורימטרית כדי לקבוע את פעילות הגרגיר של תאי פיטום. האנזים המשוחרר על ידי תאי הפיטום מבצע הידרוליזה של המצע ומייצר תוצר צבעוני. פעילות הפירוק של תאי הפיטום נמדדה כאחוז השחרור של אנזימים מחוץ לתא מנורמל עם תכולת האנזימים הכוללת בתא.

בדיקת פירוק תאי פיטום כדי לחקור את ההשפעה של כימיקל מטרה

סרטון זה מדגים שיטת שטיפת הצפק לבידוד תאי פיטום בוגרים מסוג רקמת חיבור מחלל הצפק של עכברים בוגרים. עם בידוד תערובת של תאי חיסון ראשוניים מחלל הצפק, מתבצעת התרבות סלקטיבית של תאי פיטום בתנאי תרבית מתאימים.

טכניקה לבידוד תאי פיטום ראשוניים מחלל הצפק המורין

degranulation תא פיטום, השחרור של מתווכים אלרגיים, הוא חשוב באלרגיה, אסתמה, והגנה טפילה. כאן אנו מדגימים טכניקות 1 להערכת השפעות של תרופות וtoxicants על degranulation, מתודולוגיה מנוצל לאחרונה להפגין השפעה המעכבת החזקה של סוכן אנטיבקטריאלי triclosan 2.

Assay Microplate כדי להעריך את ההשפעות כימיות על degranulation תא התורן RBL-2H3: השפעות של Triclosan ללא שימוש בממס אורגני

המטרה של הפרוטוקול הנוכחי הייתה לפתח שיטה שתאפשר ניתוח הגנומי תפקודי של הפרשת תא פיטום. הפרוטוקול מבוסס על הערכה כמותית של שחרורו של גן כתב ניאון cotrasfected עם הגן של עניין וזמן אמת ניתוחים של המורפולוגיה של גרגר ההפרשה.

חוקר תא פיטום הפרשת הגרגרים; מיוסינתזה לExocytosis

אנו מתארים שיטה ליצירת תאי פיטום שמקורם במבחנה, חריטה שלהם לעכברים חסרי תאים תורניים, וניתוח של פנוטיפ, מספרים והפצה של תאי פיטום חרוטים באתרים אנטומיים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את הפונקציות של תאי פיטום ב vivo.

ניתוח הפונקציות של תאי פיטום ב Vivo באמצעות 'תא התורן לדפוק ב' עכברים

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד את התאים המונונרורים השוכנים בתוך המעי הגס של הנקודתיים על ידי העיכול אנזימטית של הרקמה באמצעות קולגן. פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל של תאים מוניוצלולים וכתוצאה מכך השעיית תא בודד אשר בתורו יכול לשמש עבור immunophenotyping קלדה חזקה.

בידוד של לינה קינאין תאים מונמוננקה מקולון מורלין באמצעות קולגנאז

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

מאמר זה מתאר 1 נוהל בידוד לתאי אנדותל אנושיים מן הוורידים הטבור ולאחר מכן מראה כיצד להשתמש בתאים אלו כדי לבחון גלגול נויטרופילים בתנאי זרימה. באמצעות תא בנפח נמוך זרימת עשוי פולימר עם מאפיינים אופטיים של הזכוכית, חי תאים הדמיה הניאון של אוכלוסיות תאים נדירות הוא גם אפשרי.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

למדו לבודד ולגדל תאי פיטום מצפק עכברים ולאפיין אותם פונקציונלית באמצעות הדמיית סידן Fura-2 ומבחני שחרור בטא-הקסוזאמינידאז. שיטות אלו מאפשרות ניתוח מקבילי של מספר רב של תאים.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca^{2 +}-הדמיה, מבחני Degranulation

גלה סרטונים נוספים