שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

המטרה הכוללת של שילוב הפרעות RNA בתיווך מיקרו-רנ"א מלאכותי עם אופטוגנטיקה היא לאפיין את ההשפעה של הפלת גנים על תפקוד פרה-סינפטי בתוך מעגלים עצביים שלמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית, כגון התייחסות לתפקיד הפיזיולוגי של חלבונים פרה-סינפטיים במעגלי מוח שלמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנטר העברה סינפטית באופן סלקטיבי בתאי עצב עם ביטוי מופחת של החלבון הפרה-סינפטי הנחקר.

כמו כן, השתמשנו בשיטה הזו כדי לחקור תפקוד פרה-סינפטי בפרוסות מוח חדות. ניתן ליישם אותו גם כדי לתפעל ולחקור את האבטחה העצבית in vivo. תדגים את ההליך כרמלה ויטאלה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.

לאחר תכנון המיקרו-רנ"א ובניית וקטור רקומביננטי לביטוי המיקרו-רנ"א והגשושית האופטוגנטית, הכינו תרביות עצביות ראשוניות מאזור המוח המעניין. לשם כך, עקוב אחר פרוטוקול קורטיקוקולטורציה מבוסס על ידי L.A.Cingolani ושות' עם השינויים הבאים. ראשית, השתמש בצלחות של שש בארות, צלחת חצי מיליון נוירונים לבאר והשתמש ב-2.5 מיליליטר של מדיום התקשרות לבאר.

לאחר דגירה של הצלחת במשך ארבע שעות, עבור ל-3.3 מיליליטר של מדיום תחזוקה לבאר, ואם נצפתה צמיחת יתר של אסטרוציטים הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תחזוקה בתוספת 7.5 מיקרו-מולר של AraC בשלושה עד ארבעה DIVs. בחמישה עד שישה DIVs, הדביקו שלוש בארות עבור כל מיקרו-RNA לבדיקה. השתמש במינון הזיהומי הנמוך ביותר שידביק לפחות 99% מהנוירונים.

מוסיפים את הנגיף ישירות לתאי העצב, מערבבים בעדינות ומניחים את הצלחות בחזרה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ב-17 עד 18 DIVs, ליזה את הנוירונים למיצוי RNA. הטה את הצלחות והשתמש בפיפטות זכוכית כדי להסיר את כל המדיום מכל באר.

לאחר מכן, הוסף מיד 700 מיקרוליטר של מגיב ליזה לכל באר. לאחר ערבוב קצר, העבירו את הליזאט של התא מכל באר ולצינורות נפרדים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 140 מיקרוליטר כלורופורם לכל ליזאט.

יש לכסות ולנער במהירות את השפופרות בחוזקה למשך 15 שניות כדי להפוך את התוכן לתחליב. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השלב המימי העליון המכיל RNA לצינור חדש.

אל תתנו לקצה הפיפטה לגעת בשלב האורגני. לשלב המימי הוסיפו 1.5 נפחים של 100% אתנול, ופיפטו את התמיסה לאט שלוש פעמים לערבוב. לאחר מכן, טהר את ה-RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית, וכמת את התפוקות.

צפו לפחות 3.5 מיקרוגרם לדגימה. היחס לטוהר על פני חלבונים ותרכובות אורגניות צריך להיות לפחות 1.9. לאחר מכן, השתמש בערכה כדי לתמלל מחדש 250, 500 או 1,000 ננוגרם של RNA.

לאחר מכן, כמת את יעילות הנוקדאון עבור הגן האנדוגני המעניין על ידי RTPCR כמותני. לשאוף ליעילות נוקדאון של לפחות 60%עבור פרוטוקול זה השתמש בבעל חיים ש-15 יום לפני או יותר הוזרק RAAV12 למוח על פי פרוטוקול שפורסם בעבר על ידי A.Cetin and Company. בודדו את המוח, וצרו פרוסות מוח חדות עם ויברטום ו-ACFF קר כקרח.

אסוף את הפרוסות של אזור העניין, ומזער את החשיפה שלהן לאור כדי למנוע הפעלת הבדיקה האופטוגנטית. תנו לפרוסות להתאושש במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס באותו ACFF. השתמש בתא שתוכנן במיוחד להחזקת פרוסות מוח.

לאחר מכן, החזירו את הפרוסות לטמפרטורת החדר, שם הן יישארו בריאות במשך שש עד שמונה שעות. כדי להמשיך, העבירו פרוסה לתא ההקלטה, ומזגו אותה בשני מיליליטר לדקה של ACFF. לאחר מכן, בדוק בקצרה את האות של המדווח הפלואורסצנטי המבוטא כדי לוודא את המיקום ועוצמת הזיהום.

לאחר מכן, מלאו אלקטרודת תיקון בתמיסה התוך תאית. כעת, תחת תאורת אינפרא אדום, השיגו תצורה סיטונאית אטומה היטב על תא עצב שמקבל קלט סינפטי מהנוירונים הנגועים. ניתן להשאיר את התנגדות הסדרה ללא פיצוי, אך היא צריכה להיות קבועה ונמוכה.

לדוגמה, אם נוירונים פירמידליים CA3 נדבקו, תיקון נוירונים פירמידליים בדרכי הפרוקסימלי עד המדיאלי של אזור CA1. כאשר התאים מתחילים להיראות מכווצים או נפוחים, כאשר התיקון נעשה קשה, או כאשר הקבוצות אינן יציבות, אז הפרוסות שנבחרו כבר אינן בריאות מספיק כדי לתעד מהן. לאחר מכן, השתמש בפרמקולוגיה כדי לבודד את הזרמים הסינפטיים הנחקרים.

לדוגמה, אם המטרה היא לחקור העברה סינפטית מעוררת, חסום העברה סינפטית מעכבת על ידי הוספת ביקוקולין לאמבטיה. לאחר מכן, עוררו זרמים סינפטיים, כגון זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים, באמצעות לייזר כחול של 473 ננומטר המחובר לסיב אופטי הממוקם על הסומטה של הנוירונים הנגועים. אל תכוון את הלייזר אל הנוירונים.

לדוגמה, הימנע מלשפוך אור על הביטחונות של שאפר. דפולריזציה ישירה של האקסונים אינה רצויה. לאחר מכן, התאם את אורך הגירוי למינימום כדי להפחית את האפשרות לעורר יותר מפוטנציאל פעולה אחד לכל פולס אור.

לאחר מכן, חדדו את עוצמת הלייזר כדי לעורר זרם סינפטי קטן אך ניתן לזיהוי בבירור. לדוגמה, עבור העברה סינפטית מעוררת בין נוירונים פירמידליים CA3 ו-CA1, התאם את עוצמת הלייזר כדי לעורר זרמים סינפטיים של 20 עד 50 פיקואמפים. בסוף הניסוי יש למרוח טטרודוטוקסין בעוצמה של 0.5 מיקרומולר כדי לחסום את תעלות הנתרן.

הרגישות של הזרמים המעוררים אופטית לטטרודוטוקסין מצביעה על כך שהם מונעים על ידי פוטנציאל פעולה. המשיכו לאסוף נתונים עד שלפחות שמונה נוירונים תוקנו למצב נתון מלפחות שלושה בעלי חיים שונים. אלה הנתונים המינימליים הדרושים לניתוח תוצאות.

באמצעות השיטה המתוארת, איזופורמים חלופיים של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג P/Q פרה-סינפטיות הופלו. ערוצים אלה נחשבים כמווסתים את הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר בסינפסות מעוררות CA3 עד CA1. נוצרו ארבעה מבנים שונים המבטאים מיקרו-רנ"א ספציפיים לאיזופורמים; כל אחד מהם בא לידי ביטוי יחד עם רודופסין ערוץ מהיר במיוחד יחד עם החלבון הפלואורסצנטי Td-Tomato.

ראשית, כל מבנה אושר כבעל יעילות וסלקטיביות מספקת בתרביות עצביות ראשוניות של חולדות באמצעות RTPCR כמותי ספציפי לאיזופורם. לאחר מכן, כל מבנה הוזרק להיפוקמפוס של חולדות P18. בסופו של דבר, השפעת המבנים על הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר בסינפסות CA3 עד CA1 נחקרה על ידי גירוי נוירונים פירמידליים CA3 נגועים עם פולסים קצרים של אור 473 ננומטר ועל ידי רישום ה-EPSCs המתקבלים בתצורה סיטונאית מנוירונים פירמידליים של אזור CA1.

הפלה של איזופורמים שונים של חיבור השפיעה על התגובות לגירוי דופק מזווג בכיוונים מנוגדים. נוקדאון של איזופורם A הגביר את הקלת הדופק הזוגי; ואילו הפלת האיזופורם B ביטלה אותו. שילוב אופטוגנטיקה של הפרעות RNA מאפשר למחקר בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית לחקור כיצד חלבונים פרה-סינפטיים מווסתים את הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר במעגלים שלמים.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לאמת מיקרו-רנ"א להפרעות רנ"א וכיצד לשלב אותם עם אופטוגנטיקה כדי לחקור העברה סינפטית בפרוסות מוח חריפות