Name: שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: למד שילוב אופטוגנטיקה עם microRNA מלאכותי לאפיון השפעת נוקאאוט גנטי על פונקציה פרה-סינפטית במעגלים עצביים שלמים. השיטה מאפשרת מעקב סלקטיבי אחרי העברה סינפטית בנוירונים עם ביטוי מופחת של חלבונים פרה-סינפטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Benfenati פ (Istituto איטלקית di Tecnologia, IIT) על תמיכה, כרמלה ויטאלה שעזרת עם ההפגנה. עבודה זו מומן על ידי IIT ו סנט לוק סן פאולו (מענק מס 9734 LAC).

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ביטוי משותף של בדיקה optogenetic של מיר נגד גן presynaptic עניין מציעה גישה רב-עוצמה כדי לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. לגישה ניסויית זו, חשוב לזהות ולאפיין מירס כי הם יעילים מאוד סלקטיבי הורסים את הגן עניין במערכות מקורית. במידת האפשר, מירס עצמאית שניים או יותר נגד mRNA באותו עניין יש להשתמש כדי לשלוט לאפקטים את המטרה בסופו של דבר. חילוץ ניסויים, בהם גן עמידים מיר מופיעה שוב במערכת, יכול לשמש בתור פקד עבור ירידה לפרטים.
שימוש הבונה אותו לבטא את optogenetic של החללית ואת מיר מאפשר לעירור שטיחות רק את הנוירונים presynaptic זה יש תומרנו. זה לא אפשרי עם stimulations חשמל כי הם אינם מבחינים בין הנוירונים נגוע, לבריא, ובכך לייצר תוצאות מעורבות מדולל. מאחר stimulations אופטי יכול לגרום פוטנציאל פעולה מספר15, חשוב לבחור רק את המהירה optogenetic הגששים, בין הרחבת לוח15,19,20,21. בנוסף, זה חיוני כדי להבטיח כי גירוי אופטי לא זירוז של דפולריזציה ישירה של presynaptic עם העיתון ons, כדי למנוע עקיפת חלק מהשלבים של ההעברה הסינאפסית אחד ורוצה לחקור22.
הגישה ניסיוני נתאר כאן, מאפשר להעריך במקביל הרלוונטיות פיזיולוגיים של גנים presynaptic מרובים של עניין בתוך פרק זמן מוגבל (4-6 חודשים). עם זאת, חשוב לזכור כי נפילות לעתים רחוקות להגיע 100%. יתר על כן, rAAVs צריך לבוא לידי ביטוי לפחות שבועיים לאפשר ביטוי תמונות ציפורים ומלא מקסימלי של המכשיר optogenetic, אשר עשוי לייצג אילוץ הזמן כאשר חוקרים מוקדם בתהליכים התפתחותיים. למרות יותר עכברים knockout זמן רב, מותנה מוגבל הנוירונים presynaptic, בדרך כלל לגרום להשלים את ההסרה של הגן עניין, מציעים לכן בגישה המשלימה בתוקף.
יתרון מסוים של הטכנולוגיה מיר הוא שהם מאפשרים הביטוי של מירס מרובים מייצוג המקדם אותו. מאפיין זה משמש בעיקר כדי להגביר את היעילות תמונות ציפורים על-ידי הוספת עותקים מרובים של מיר זהה או שונה מירס נגד גן המטרה זהה. עם זאת ניתן להתרגל גם נוקאאוט גנים מרובים על ידי הבעת מירס נגד יעד שונות הגנים7,23. אולי ניתן להשתמש במאפיין זה כדי להשתיק מספר חלבונים presynaptic לנתח presynaptic איתות המסלולים.
. הנה, שילבנו optogenetics עם מירס מלאכותי כדי לאפיין את ההשפעות של גנים על הפונקציה presynaptic חריפה פרוסות בהיפוקמפוס. בגישה דומה יכול לשמש גם כדי לתפעל בדיקה מעגלים עצביים ויוו. בנוסף, שילוב של מירס מלאכותיים עם chemogenetic גישות תאפשר אחד לחקור מעגלים עצביים על פרקי זמן ארוכים יותר.

פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה כדי לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. חקירת פונקצית presynaptic מעגלים עצביים שלם הוא מאתגר כי רבים presynaptic עם העיתון ons קטנות מדי, רחוק מ את סומה על מנת לאפשר התערבויות אלקטרופיזיולוגיות המולקולריים משולב. למרות התערבות RNA מציע אמצעי וגמישה חלבונים סינפטיים תמונות ציפורים1, גישה זו שימש במשורה לחקור פונקציה presynaptic כי זה קשה לזהות את ההשפעות של שימוש מסורתי נוקאאוט stimulations חשמל, אשר אינם מבחינים בין מניפולציות תמים עם העיתון ons presynaptic2. כאן, אנו נתאר כיצד לשלב microRNA מלאכותיים (מיר)-מתווכת התערבות ב RNA עם טכנולוגיית optogenetic פיתחה לאחרונה כדי להשיג גירוי סלקטיבי של מניפולציה עם העיתון ons presynaptic פרוסות המוח חריפה.
בעוד עכברים knockout מותנה בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפונקציה של חלבונים presynaptic3,4, האסטרטגיה שלנו אינו מחייב בפיתוח ותחזוקה של גנטית שינוי קווים העכבר, יכול גם להיות בקלות מועסק כדי להפיל איזופורמים ספציפי של גנים. באופן יחסי יותר נפוץ בשימוש קצר מכבנה RNAs (shRNAs), מירס מלאכותי, אשר אנו מעסיקים כאן, מציעים יתרונות מפתח עבור נוקאאוט בנוירונים. בניגוד shRNAs, הם יכולים להתבטא תחת השליטה של פולימראז II יזם1. לפיכך, מקדם בודד ניתן להסיע את הביטוי של מיר והן של בדיקה optogenetic, יחד עם כתב פלורסנט. בדרך זו, ניתן לשמור את הגודל של הבונה בגבולות אריזה של וירוסים adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV, איור 1 א'). גם השימוש מבנה יחיד מקדם בודד מפחית השתנות ניסיוני כי זה מאפשר ביטוי של מיר, החללית optogenetic והעיתונאית פלורסנט על יחס קבוע.
אנחנו לאחרונה החלת טכנולוגיה זו לבחון את התפקיד של לחלופין משולבים איזופורמים של תעלות סידן presynaptic ההיפוקמפוס5. אסטרטגיה כזו חל בדרך כלל לומדת את הרלוונטיות פיזיולוגיים של חלבונים presynaptically ביטוי אחרים במעגל המוח בכל עניין.

<table><tbody><tr><td>אקרילאמיד</td><td>סיגמא</td><td>אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד, תמיסה 30%</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורת בעלי חיים רעיל עם כרית חום</td><td></td><td></td> ערכת בדיקת חלבון WPI ATC2000 <td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR ערכת וקטור ביטוי RNAi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>פרוסות מוח Prechamber</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD צילום מבוסס מצלמה</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; </td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים לתרבית תאים</td> MP <td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצע כימילומינסנט</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Western Blotting Reagents, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td>ציטוזין רעיל</td></tr><tr><td>ובטא;-D-arabinofuranoside</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>משחת Gentamicin</td><td>בית מרקחת</td><td></td><td></td>מקומי</tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>הזרקת מיקרופיפטות</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>מלחים וחומרי ניקוי אנאורגניים</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- קריאטין פוספט</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconate</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>לייזר</td><td>טכנולוגיות זוהר</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>ממברנה</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 ומיקרו; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרופיפטה</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr> חומר <tr><td>סיכה לעיניים</td><td>בית מרקחת מקומי</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פוספט</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, מעכב פרוטאז ללא EDTA חלבון קוקטייל</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אלקטרופורזה ומכשירי ספיגה</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III תא</td><td></td></tr><tr><td>Providone יוד</td><td>בית מרקחת מקומי</td><td>Betadine</td><td></td></tr><tr><td>Qiazol מגיב ליזה</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Toxic QuantiTect Reverse ערכת תמלול</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוטקטי</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טטרודוטוקסין</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

שילוב optogenetics עם מיקרו rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את ההשפעה של גנים על פונקציה presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע. אנו מתארים זרימת עבודה כיצד לשלב microRNA מלאכותיים (מיר)-מתווכת התערבות RNA optogenetics כדי להשיג גירוי סלקטיבי של מניפולציה עם העיתון ons presynaptic פרוסות המוח חריפה. הגישה ניסיוני כרוכה בשימוש של מבנה ויראלי יחיד, מקדם מכירות ספציפיים נוירון בודד לנהוג הביטוי של בדיקה optogenetic והן miR(s) מלאכותי נגד presynaptic gene (s). כאשר מזריקים stereotactically באזור המוח של עניין, הבונה ביטוי מאפשר לגרות עם אור באופן בלעדי את הנוירונים עם ביטוי מופחתת gene (s) תחת חקירה. אסטרטגיה זו אינה דורשת את פיתוח ותחזוקה של קווים העכבר מהונדסים, באופן עקרוני ניתן להחיל על אורגניזמים אחרים, כל הגן עצביים של בחירה. אנחנו לאחרונה פירשו אותו לחקור איך נוקאאוט של splice חלופי איזופורמים של תעלות סידן ממותגת מתח מסוג P/Q presynaptic (VGCCs) מסדיר הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי סינפסות מעוררות CA1 פרוסות בהיפוקמפוס חריפה... בגישה דומה יכול לשמש גם כדי לתפעל, בדיקה של מעגלים עצביים בתוך vivo.

ההליכים המתוארים לעיל מספקות שיטה חזקה כדי להעריך כמה הסינאפסית מושפע את נוקאאוט של חלבונים סינפטיים בנוירונים presynaptic. תוצאות נציג על איך נוקאאוט של חלופה אחוי איזופורמים של Ca presynapticv2.1 (P/Q-סוג) VGCCs מסדיר פלסטיות סינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי CA1 הסינפסות סינאפסות הם כדלקמן כדוגמה.
Cav2.1 (P/Q-סוג) הערוצים שלנו VGCCs presynaptic השולט על הסינפסות מהיר ביותר במערכת העצבים המרכזית. חלופי שחבור של exons שבחירה 37 א ו- 37b של יוצרי נקבובית α1 יחידת משנה של Cav2.1 (α1A) מייצרת שני משתנים עיקריים, Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. כדי לקבוע אם Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb] באופן שונה לווסת הסינאפסית ואת הפלסטיות של החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס כפירמידה, לראשונה פיתחנו מירס isoform ספציפיים כדי נוקאאוט באופן סלקטיבי Cav 2.1 [EFa] או Cav2.1 [EFb]5. למרות גודלו קצר (97 bp) ודמיון גבוהה (61.86% זהות באותה רמת נוקלאוטיד) בין exons 37 א, 37b, היינו יכולים לעצב שלוש מיר רצפים נגד עכברוש Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; מיר EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; מיר EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA), ושניים נגד עכברוש Cav2.1 [EFb] (מיר EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; מיר EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) עם החזוי יעילות גבוהה תמונות ציפורים. כפקד שלילי (miR שליטה), השתמשנו על פלסמיד pcDNA6.2 GW/EmGFP-מיר-. שלילי המכיל רצף כיעד ג'ין חוליות ידוע לכל. מבוסס על מסך הראשונה בתאים HEK 293 נגד ערוצי heterologous, אנו נבחר מיר EFa1, מיר EFa3 ומיר EFb2, משובטים קסטות הביטוי שלהם לתוך 3' UTR של וקטור pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, אשר נועד עבור הייצור של rAAVs, איפה סינפסין יזם כוננים הביטוי של channelrhodopsin מרביים של ChETA, החלבון הניאון אדום TdTomato את מיר שנוספו (איור 1). אנחנו גם משוכפל בקלטת ביטוי של מיר EFb2 כדי להגביר את היעילות תמונות ציפורים של מיר הזה.
בשלב הבא, אנו מוכנים rAAV1/2 המבנה 4 לעיל, לכמת והיעילות תמונות ציפורים, סלקטיביות בתרבויות עצביים החולדה הראשית באמצעות isoform ספציפיים לרביעיית-PCR. מיר EFa1 ו מיר EFa3 מופחת mRNA של יליד Cav2.1 [EFa] ~ 70% אבל לא זה של Cav2.1 [EFb], בעוד מיר EFb מופחת mRNA של יליד Cav2.1 [EFb] על ידי ~ 60% אבל לא זה של Cav2.1 [EFa] (איור 2).
אנחנו אז stereotactically מוזרק אחד של ארבע rAAV1/2 אזור CA3 של ההיפוקמפוס של חולדות P18 (איור 3 א-ג), עם נקודות הציון של −2.6 (A-P/M-L/D-V מ- Bregma) / ± 2.9 / −2.9. חמש עשרה עד עשרים וארבע ימים שלאחר ההזרקה, אנו המוכן פרוסות בהיפוקמפוס חריפה rAAV1/2-מוזרק חולדות, המשמש TdTomato זריחה כדי לאשר את הביטוי ואת לוקליזציה של rAAVs (איור 3B). כדי לבדוק אם presynaptic נוקאאוט של Cav2.1 [EFa] או Cav2.1 [EFb] מושפעות הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר ב CA3 כדי CA1 הסינפסות, אנחנו מגורה הנגוע באופן סלקטיבי נוירונים CA3 עם קצר 473 ננומטר לייזר להבזקי האור (2 ms-ארוך ; איור 3C), והקליט את EPSCs שנוצר על ידי תיקון כפירמידה נוירונים ב- proximal כדי בדרכי המדיאלי של האזור CA1 (איור 3C). . מצאנו נוקאאוט של Cav2.1 splice איזופורמים מושפעות התגובות דופק מזווגים גירוי בכיוונים מנוגדים: נוקאאוט של Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1 או מיר EFa3) והציגה את הדופק-לזווג ההנחיה (PPF) ואילו תמונות ציפורים של Ca v2.1 [EFb] (מיר EFb2) ביטל אותו (דמות תלת-ממד, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> איור 1: ערכה של המבנה עבור ביטוי בשילוב של optogenetic מרביים בדיקה ChETA, מירס isoform ספציפיים כנגד Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]. (א) לבנות מפה של rAAV pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, המכיל מקדם synapsin (Syn), channelrhodopsin מרביים ChETA התמזגו TdTomato ו, על צינתור 3' UTR, מיר isoform ספציפיים splice Cav2.1. אנזימי הגבלה המוצגים הינם מחתך יחיד. (B) העליון, בסכמה הקלטת הביטוי. יזם synapsin כונני הביטוי של ChETA-TdTomato והן של מיר isoform ספציפיים. התחתון, המשלים הפוכה של הרצף 21-נוקלאוטיד היעד, אשר מהווים חלק בקלטת מיר. עבור מיר EFb2 שתי קלטות מיר זהים היו ביטוי טנדם אחד אחרי השני. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> באיור 2. הערכה של יעילות תמונות ציפורים, סלקטיביות של מירס isoform ספציפיים עבור Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb]. ניתוח Isoform ספציפיים לרביעיית-PCR על RNA מבודד 17-18 DIV העיקרי תרבויות נגוע ב- 6 DIV rAAVs לבטא מירס מיקוד גם Cav2.1 [EFa] (מיר EFa1 ומיר EFa3) או Cav2.1 [EFb] (מיר EFb2). הנתונים הם מנורמל לפקד שלילי (miR שליטה). מיר EFa1 ו מיר EFa3 באופן משמעותי, באופן סלקטיבי להקטין mRNA של Cav2.1 [EFa] (n = 8 ו-7 תרבויות, בהתאמה), בעוד מיר EFb באופן משמעותי, באופן סלקטיבי מפחית mRNA של Cav2.1 [EFb] (n = 4 תרבויות; * * * p &lt; 0.001; חד-כיווני ניתוח סטיה מבחן ולאחריו במבחן Tukey אין-ספור השעות שלאחר). הנתונים מוצגים אומר ± ב- SEM... איור זה כבר ממאמרו של Thalhammer, א. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> איור 3. להעריך את התפקיד של Cav2.1 [EFa] ו- Cav2.1 [EFb] בהיפוקמפוס מקורית מאת ממוקד גירוי של נוירונים הפילו-למטה עם optogenetics. (א) בסכמה הקלטת ביטוי של המבנה rAAV המשמש ויוו זיהום. (B) סעיף בהיפוקמפוס מציג את זריחה TdTomato היא מוגבלת לאזור CA3 התחזיות שלה. תצורת ניסיוני (C) : קרן לייזר בוים על CA3 somata, תיקון קלאמפ ההקלטות בוצעו מ CA1 כפירמידה נוירונים. (ד) 2 ms-ארוך כחול (473 ננומטר) להבזקי האור הלייזר כיוונו 20 הרץ לעורר EPSCs את PPF אשר גדל במירס מיקוד Cav2.1 [EFa], ביטל מאת מיר עבור Cav2.1 [EFb]. סיכום (E) של דופק לזווג יחס לניסויים כמו (D), מראה עלייה PPF מיר EFa1, מיר EFa3, ירידה של מיר EFb2, באופן יחסי מיר שליטה (n = 9-11 הקלטות; * p = 0.02; * * p = 0.01; * * * p &lt; 0.0004; ניתוח של המשותפת). הנתונים מוצגים אומר ± ב- SEM... איור זה כבר ממאמרו של Thalhammer, א. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה על כיצד לשלב מלאכותי בתיווך microRNA RNA הפרעה optogenetics לעורר במיוחד presynaptic עם העיתון ons עם ביטוי מופחתת של gene (s) סלקטיבי בתוך מעגלים עצביים ללא פגע.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

המטרה הכוללת של שילוב הפרעות RNA בתיווך מיקרו-רנ"א מלאכותי עם אופטוגנטיקה היא לאפיין את ההשפעה של הפלת גנים על תפקוד פרה-סינפטי בתוך מעגלים עצביים שלמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית, כגון התייחסות לתפקיד הפיזיולוגי של חלבונים פרה-סינפטיים במעגלי מוח שלמים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנטר העברה סינפטית באופן סלקטיבי בתאי עצב עם ביטוי מופחת של החלבון הפרה-סינפטי הנחקר.כמו כן, השתמשנו בשיטה הזו כדי לחקור תפקוד פרה-סינפטי בפרוסות מוח חדות. ניתן ליישם אותו גם כדי לתפעל ולחקור את האבטחה העצבית in vivo. תדגים את ההליך כרמלה ויטאלה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.לאחר תכנון המיקרו-רנ"א ובניית וקטור רקומביננטי לביטוי המיקרו-רנ"א והגשושית האופטוגנטית, הכינו תרביות עצביות ראשוניות מאזור המוח המעניין. לשם כך, עקוב אחר פרוטוקול קורטיקוקולטורציה מבוסס על ידי L.A.Cingolani ושות' עם השינויים הבאים. ראשית, השתמש בצלחות של שש בארות, צלחת חצי מיליון נוירונים לבאר והשתמש ב-2.5 מיליליטר של מדיום התקשרות לבאר.לאחר דגירה של הצלחת במשך ארבע שעות, עבור ל-3.3 מיליליטר של מדיום תחזוקה לבאר, ואם נצפתה צמיחת יתר של אסטרוציטים הוסף 0.5 מיליליטר של מדיום תחזוקה בתוספת 7.5 מיקרו-מולר של AraC בשלושה עד ארבעה DIVs. בחמישה עד שישה DIVs, הדביקו שלוש בארות עבור כל מיקרו-RNA לבדיקה. השתמש במינון הזיהומי הנמוך ביותר שידביק לפחות 99% מהנוירונים.מוסיפים את הנגיף ישירות לתאי העצב, מערבבים בעדינות ומניחים את הצלחות בחזרה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ב-17 עד 18 DIVs, ליזה את הנוירונים למיצוי RNA. הטה את הצלחות והשתמש בפיפטות זכוכית כדי להסיר את כל המדיום מכל באר.לאחר מכן, הוסף מיד 700 מיקרוליטר של מגיב ליזה לכל באר. לאחר ערבוב קצר, העבירו את הליזאט של התא מכל באר ולצינורות נפרדים של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 140 מיקרוליטר כלורופורם לכל ליזאט.יש לכסות ולנער במהירות את השפופרות בחוזקה למשך 15 שניות כדי להפוך את התוכן לתחליב. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השלב המימי העליון המכיל RNA לצינור חדש.אל תתנו לקצה הפיפטה לגעת בשלב האורגני. לשלב המימי הוסיפו 1.5 נפחים של 100% אתנול, ופיפטו את התמיסה לאט שלוש פעמים לערבוב. לאחר מכן, טהר את ה-RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית, וכמת את התפוקות.צפו לפחות 3.5 מיקרוגרם לדגימה. היחס לטוהר על פני חלבונים ותרכובות אורגניות צריך להיות לפחות 1.9. לאחר מכן, השתמש בערכה כדי לתמלל מחדש 250, 500 או 1,000 ננוגרם של RNA.לאחר מכן, כמת את יעילות הנוקדאון עבור הגן האנדוגני המעניין על ידי RTPCR כמותני. לשאוף ליעילות נוקדאון של לפחות 60%עבור פרוטוקול זה השתמש בבעל חיים ש-15 יום לפני או יותר הוזרק RAAV12 למוח על פי פרוטוקול שפורסם בעבר על ידי A.Cetin and Company. בודדו את המוח, וצרו פרוסות מוח חדות עם ויברטום ו-ACFF קר כקרח.אסוף את הפרוסות של אזור העניין, ומזער את החשיפה שלהן לאור כדי למנוע הפעלת הבדיקה האופטוגנטית. תנו לפרוסות להתאושש במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס באותו ACFF. השתמש בתא שתוכנן במיוחד להחזקת פרוסות מוח.לאחר מכן, החזירו את הפרוסות לטמפרטורת החדר, שם הן יישארו בריאות במשך שש עד שמונה שעות. כדי להמשיך, העבירו פרוסה לתא ההקלטה, ומזגו אותה בשני מיליליטר לדקה של ACFF. לאחר מכן, בדוק בקצרה את האות של המדווח הפלואורסצנטי המבוטא כדי לוודא את המיקום ועוצמת הזיהום.לאחר מכן, מלאו אלקטרודת תיקון בתמיסה התוך תאית. כעת, תחת תאורת אינפרא אדום, השיגו תצורה סיטונאית אטומה היטב על תא עצב שמקבל קלט סינפטי מהנוירונים הנגועים. ניתן להשאיר את התנגדות הסדרה ללא פיצוי, אך היא צריכה להיות קבועה ונמוכה.לדוגמה, אם נוירונים פירמידליים CA3 נדבקו, תיקון נוירונים פירמידליים בדרכי הפרוקסימלי עד המדיאלי של אזור CA1. כאשר התאים מתחילים להיראות מכווצים או נפוחים, כאשר התיקון נעשה קשה, או כאשר הקבוצות אינן יציבות, אז הפרוסות שנבחרו כבר אינן בריאות מספיק כדי לתעד מהן. לאחר מכן, השתמש בפרמקולוגיה כדי לבודד את הזרמים הסינפטיים הנחקרים.לדוגמה, אם המטרה היא לחקור העברה סינפטית מעוררת, חסום העברה סינפטית מעכבת על ידי הוספת ביקוקולין לאמבטיה. לאחר מכן, עוררו זרמים סינפטיים, כגון זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים, באמצעות לייזר כחול של 473 ננומטר המחובר לסיב אופטי הממוקם על הסומטה של הנוירונים הנגועים. אל תכוון את הלייזר אל הנוירונים.לדוגמה, הימנע מלשפוך אור על הביטחונות של שאפר. דפולריזציה ישירה של האקסונים אינה רצויה. לאחר מכן, התאם את אורך הגירוי למינימום כדי להפחית את האפשרות לעורר יותר מפוטנציאל פעולה אחד לכל פולס אור.לאחר מכן, חדדו את עוצמת הלייזר כדי לעורר זרם סינפטי קטן אך ניתן לזיהוי בבירור. לדוגמה, עבור העברה סינפטית מעוררת בין נוירונים פירמידליים CA3 ו-CA1, התאם את עוצמת הלייזר כדי לעורר זרמים סינפטיים של 20 עד 50 פיקואמפים. בסוף הניסוי יש למרוח טטרודוטוקסין בעוצמה של 0.5 מיקרומולר כדי לחסום את תעלות הנתרן.הרגישות של הזרמים המעוררים אופטית לטטרודוטוקסין מצביעה על כך שהם מונעים על ידי פוטנציאל פעולה. המשיכו לאסוף נתונים עד שלפחות שמונה נוירונים תוקנו למצב נתון מלפחות שלושה בעלי חיים שונים. אלה הנתונים המינימליים הדרושים לניתוח תוצאות.באמצעות השיטה המתוארת, איזופורמים חלופיים של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג P/Q פרה-סינפטיות הופלו. ערוצים אלה נחשבים כמווסתים את הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר בסינפסות מעוררות CA3 עד CA1. נוצרו ארבעה מבנים שונים המבטאים מיקרו-רנ"א ספציפיים לאיזופורמים; כל אחד מהם בא לידי ביטוי יחד עם רודופסין ערוץ מהיר במיוחד יחד עם החלבון הפלואורסצנטי Td-Tomato.ראשית, כל מבנה אושר כבעל יעילות וסלקטיביות מספקת בתרביות עצביות ראשוניות של חולדות באמצעות RTPCR כמותי ספציפי לאיזופורם. לאחר מכן, כל מבנה הוזרק להיפוקמפוס של חולדות P18. בסופו של דבר, השפעת המבנים על הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר בסינפסות CA3 עד CA1 נחקרה על ידי גירוי נוירונים פירמידליים CA3 נגועים עם פולסים קצרים של אור 473 ננומטר ועל ידי רישום ה-EPSCs המתקבלים בתצורה סיטונאית מנוירונים פירמידליים של אזור CA1.הפלה של איזופורמים שונים של חיבור השפיעה על התגובות לגירוי דופק מזווג בכיוונים מנוגדים. נוקדאון של איזופורם A הגביר את הקלת הדופק הזוגי; ואילו הפלת האיזופורם B ביטלה אותו. שילוב אופטוגנטיקה של הפרעות RNA מאפשר למחקר בתחום הפיזיולוגיה הסינפטית לחקור כיצד חלבונים פרה-סינפטיים מווסתים את הפלסטיות הסינפטית לטווח קצר במעגלים שלמים.לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לאמת מיקרו-רנ"א להפרעות רנ"א וכיצד לשלב אותם עם אופטוגנטיקה כדי לחקור העברה סינפטית בפרוסות מוח חריפות

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים סינפטיים מעוררים בפרוסות מוח של עכבר בהיפוקמפוס. תאי העצב CA3 היו נגועים בווקטור נגיפי רקומביננטי בעל מבנה להבעת כתב פלואורסצנטי, תעלת קרום המופעלת על ידי אור, ומיקרו-רנ"א המווסת את הביטוי של תעלות סידן מגודרות מתח. לאחר הנחת פרוסה בתא הקלטה ותיקון תא עצב CA1 עם פיפטת הקלטה, נעשה שימוש בפעימות אור כדי לעורר את התעלה המופעלת על ידי האור, וכתוצאה מכך זרם יונים וליצור פוטנציאל פעולה. היעדר תעלות סידן מגודרות מתח בנוירונים CA3 מעכב שחרור מוליכים...

עיכוב בתיווך מיקרו-רנ"א של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים בפרוסות היפוקמפוס עכבר

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.

שיטה לנאמנות גבוהה בקרת optogenetic של פרט פירמידת נוירונים<em&gt; בvivo</em

אנו מתארים שיטה לאפיון הטופוגרפיה התפקודית והתכונות הסינפטיות של מעגלי המוח הקדמי באמצעות גישה אופטוגנטית לגירוי אוכלוסיות עצביות במבחנה.

Photostimulation לייזר לסריקת של מעגלים מוח קדמי ממוקדים Optogenetically

אופטוגנטיקה הפכה לכלי רב עוצמה לשימוש בניסויים במדעי המוח ההתנהגותיים. פרוטוקול זה מציע מדריך שלב אחר שלב לתכנון והקמה של מערכות לייזר, ומספק פרוטוקול מלא לביצוע גירויים אופטוגנטיים מרובים ובו זמנית התואמים לרוב פרדיגמות הבדיקות ההתנהגותיות של מכרסמים.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

מתואר פרוטוקול ליצירת מערכת תרבית משותפת המורכבת מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), נוירונים ראשוניים בקליפת המוח ואסטרוציטים. מערכת קו-תרבית זו מאפשרת לזהות היווצרות של מגעים ומעגלים סינפטיים בין נוירונים חדשים שמקורם ב-iPSC לבין נוירונים קיימים בקליפת המוח המבטאים channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

כאן, אנו מתארים שיטות של מניפולציה אלקטרואופטיקה של סוגים מסוימים של נוירונים במהלך ניטור של שינה/ערנות מדינות בעכברים, הצגת העבודה האחרונה שלנו על גרעין המיטה של מסוף הניסטריה כדוגמה.

מניפולציה אלקטרואופטיקה של מעגלים עצביים בזמן ניטור שינה/ערות מדינות עכברים

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.

Assaying בוויסות מעגל ספציפי של היפוקמאל מבוגרים תאים מקודמן עצבי

עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורים במוח, התנהגות ניתן לשנות עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה בבעלי חיים נעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון של אפנון עצבי ובדיקות התנהגותיות.

מניפולציה אופטוגנטית של פעילות עצבית לווסת את ההתנהגות בעכברים נעים בחופשיות

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר התמרה ויראלית של אזורי מוח בדידים עם מבנים אופטוגנטיים כדי לאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ספציפי לסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים חריפים.

אקס ויוו חקירה אופטוגנטית של העברה סינפטית ארוכת טווח ופלסטיות מקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית ועד קליפת המוח האנטורינלית הלטרלית

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

למד שילוב אופטוגנטיקה עם microRNA מלאכותי לאפיון השפעת נוקאאוט גנטי על פונקציה פרה-סינפטית במעגלים עצביים שלמים. השיטה מאפשרת מעקב סלקטיבי אחרי העברה סינפטית בנוירונים עם ביטוי מופחת של חלבונים פרה-סינפטיים.

שילוב Optogenetics עם מיקרו Rna מלאכותי כדי לאפיין תופעות נוקאאוט גנטי על פונקציה Presynaptic בתוך מעגלים עצביים ללא פגע

גלה סרטונים נוספים