מבחני Electrochemiluminescence עבור האדם איון עצמיים

המטרה הכוללת של בדיקת אלקטרוכימילומינסנציה זו היא לזהות נוגדנים אטוטו-איים בסוכרת אוטואימונית מסוג 1, עם רגישות גבוהה וסגוליות גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסוכרת מסוג 1, כגון זמן התחלת אוטואימוניות באי וחיזוי סיכון גבוה לסוכרת מסוג 1. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא רגיש יותר, ספציפי יותר למחלה ולא רדיואקטיבי בהשוואה לבדיקות הרדיואקטיביות הסטנדרטיות הנוכחיות.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על חיזוי ואבחון סוכרת מסוג 1 מכיוון שהנוגדנים העצמיים הללו מופיעים חודשים עד שנים לפני מחלה קלינית סימפטומטית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הנבואה לסוכרת מסוג 1, ניתן ליישם אותה גם לחקר מחלות אוטואימוניות אחרות, כגון נוגדנים עצמיים לטרנסגלוטמינאז למחלת צליאק ל-TPO ותירוגלובולין למחלת בלוטת התריס האוטואימונית ועוד כמה. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשגילינו שהטכניקה מבוססת על רגישות גבוהה ולא רדיואקטיביות.

בניגוד לשיטת ELISA הקונבנציונלית שאינה עובדת היטב עבור כל זיהוי נוגדנים עצמיים באיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה לתאר בטקסט בדיקת נוגדנים עצמיים של אינסולין עם טיפול בחומצה בסרום. מי שידגים את ההליך יונג גו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.

ראשית, ערבבו את האוטואנטיגן של האי האנושי עם ביוטין או SULFO-TAG ביחס של 1 עד 5 מולארי בשפופרת. וכסו את הצינור בנייר אלומיניום מכיוון ששני התגים רגישים לאור. לאחר מכן, דגרו את הצינור למשך שעה בטמפרטורת החדר.

בינתיים, כאשר הדגירה נמשכת, עמוד הסיבוב עם מי מלח חוצצים פוספט כפול. לאחר מכן, צנטריפוגה של העמודה בכוח הכבידה פי 1,000 למשך שתי דקות בכל פעם. לאחר מכן, צנטריפוגה את תערובת תג האנטיגן העצמי בעמודת הסיבוב בכוח הכבידה פי 1,000 למשך שתי דקות.

לאחר מכן, יש לאחסן ולאחסן את האנטיגן המסומן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בריכוז הרציונלי של האנטיגן המסומן ביוטין SULFO-TAG בהתבסס על בדיקת לוח השחמט עבור מאגר האנטיגן, כדי להכין שלושה מיליליטר של תמיסת אנטיגן לכל צלחת של 96 בארות. לאחר מכן, בכל באר, הוסיפו ארבעה מיקרוליטר של סרום והתאימו את הנפח הסופי ל-20 מיקרוליטר עם מי מלח פוספט בקיפול אחד.

לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת אנטיגן מסומנת בכל באר. וכסו את הצלחת בנייר כסף איטום מונעים אור. לאחר מכן, העבירו את הצלחת על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר שהשייקר נעצר, השאירו את הצלחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במקרר למשך 18 עד 24 שעות. כעת, ערבבו 15 מיקרוליטר סרום עם 18 מיקרוליטר של 0.5 חומצה אצטית טוחנת לכל דגימה ודגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. על בסיס בדיקת לוח השחמט, השתמש בריכוז הרציונלי של האנטיגן המסומן ביוטין SULFO-TAG כדי להכין את תמיסת האנטיגן.

לאחר מכן, ציטט 35 מיקרוליטר של מאגר האנטיגן בכל באר של לוחית PCR חדשה. רגע לפני סיום מהלך הדגירה של תערובת הסרום, הוסף 3.8 מיקרוליטר של מאגר טריס טוחנת אחת ב-PH 9, יחד עם כל באר על צלחת האנטיגן. לאחר סיום הדגירה העבירו במהירות 25 מיקרוליטר של הסרום שטופל בחומצה אצטית בכל באר של צלחת האנטיגן וערבבו את התמיסה.

לאחר מכן, כסו את לוחית ה-PCR בנייר כסף כדי למנוע אור והניחו על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר שתסיים, מעבירים את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למקרר ודוגרים למשך 18 עד 24 שעות. מוציאים צלחת סטרפטווידין מהמקרר בארבע מעלות צלזיוס ונותנים לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר.

לאחר שצלחת הסטרפטווידין מגיעה לטמפרטורת החדר, מוסיפים 150 מיקרוליטר של חוסם 3% A בכל באר ומכסים את צלחת ה-PCR בנייר איטום ודוגרים במקרר במהלך הלילה. למחרת מוציאים את צלחת הסטרפטווידין מהמקרר ומוציאים את המאגר מהבארות. לאחר מכן, יבש את הצלחת על ידי הנחתה הפוכה על כמה מגבות נייר כדי שהמאגר הנותר ייספג.

לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר PBST מתקפל אחד כדי לשטוף את הבאר במשך שלוש כביסות רצופות. לאחר מכן, העבירו 30 מיקרוליטר של אנטיגן בסרום בכל באר של צלחת הסטרפטווידין וכסו את הצלחת בנייר כסף כדי למנוע אור. לאחר מכן, העבירו את הצלחת על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שעה יש להשליך את האנטיגן בסרום מהצלחת ולהוסיף 150 מיקרוליטר של מאגר PBST מתקפל אחד כדי לשטוף את הבאר שלוש פעמים. לאחר סיום הכביסה, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר קריאה לכל באר לקריאה בקורא צלחות. לפני ניתוח דגימות לא ידועות, הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים נקבעה על ידי בדיקת כ-100 חולי סוכרת מסוג 1 וכ-100 בקרות בריאות.

לאחר מכן, שורטטה עקומת ROC כדי לקבוע את האינדקס האופטימלי של הגבול העליון של הנורמה עבור בדיקת GADA, שהיה 0.023, כדי להשיג את הרגישות והספציפיות הטובות ביותר. לאחר מכן, התוצאה של הדגימה הלא ידועה חושבה באמצעות משוואה הנגזרת מתקני בקרה חיוביים גבוהים, חיוביים ושליליים נמוכים. לאחר מכן, שורטט גרף כדי לקבוע את האותות המתקבלים במבחן אוטוטיבודנים של איים על דגירה של נוגדן חד שבטי אינסולין עם סרום אנושי רגיל בנוכחות ובהיעדר טיפול בחומצה.

התרשים מראה כי האות נחסם באופן ניכר עם הוספת סרום רגיל בהיעדר טיפול בחומצה. נהפוך הוא, האות המתקבל גבוה יותר באופן יחסי כאשר הסרום נתון לטיפול חומצי לפני הדגירה עם הנוגדן החד-שבטי של האינסולין. גרף דומה תוכנן גם כדי לקבוע את האותות המתקבלים באמצעות סרה של מטופל זר בנוכחות ובהיעדר טיפול בחומצה.

טיפול בחולה סרה עם חומצה לפני הדגירה עם הנוגדן מגדיל משמעותית את האותות בבדיקת נוגדנים עצמיים באי בהשוואה בהיעדר טיפול. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בקלות עבור כמה מאות דגימות ביום אחד אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את בדיקת לוח השחמט עבור כל בדיקת נוגדנים עצמיים כדי לייעל את מצב הבדיקה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסוכרת האוטואימונית מסוג 1 לחיזוי ומניעה. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב באיזו קלות לבצע בדיקה זו. אל תשכח שעבודה עם דגימות סרום עלולה להיות מסוכנת ומדבקת.

יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר עם העור בעת ביצוע הליך זה.