ערוץ Microfluidic reconfigurable עם ובמכסה Pin-discretized
12 באפריל 2018
ערוץ microfluidic עם ובמכסה deformable מציע בקרת זרימה, טיפול חלקיקים, ערוץ מימד ההתאמה האישית, אחרים reconfigurations במהלך השימוש. אנו מתארים שיטה בדיית ערוץ microfluidic עם מהמשטחים של מערך של סיכות המאפשר לשנות את צורתם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מכשיר מיקרופלואידית הניתן להגדרה מחדש עם דפנות העשויות ממערך של פינים. היתרון העיקרי של מכשיר מיקרופלואידי זה הוא יכולתו להתמודד עם אובייקטים ומצבים קשים לזרימה שעשויים להיות לא ידועים בשלב תכנון הערוץ. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לחרוט סיכות זעירות בצורות עצמות של כלב.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את ההרכבה של חלקים מיקרופלואידיים רבים והרכבתם על הבסיס רק מהפרוטוקול הכתוב. תמונה זו היא של המכשיר המיקרופלואידי שהושלם עם ערוץ הניתן להגדרה מחדש. כאן, החלק הניתן להגדרה מחדש נמצא לאורך החלק העליון של התמונה.
סכמת תצוגה מפוצצת חושפת כמה ממרכיביה העיקריים. בפרט, שימו לב למיקרו-ערוץ ולפינים המשמשים להגדרתו מחדש. כצעד ראשון, חרוט את הסיכות.
התחל עם סיכות נירוסטה נטולות שומן, בעובי 0.3 מילימטר, בצורת L, באורכים שונים. הכינו ארבעה מיליליטר של 10% חומצה חנקתית, וטבלו בו את הסיכות. לאחר מכן, הכניסו את המיכל לתנור של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר החזרת הסיכות, העבירו אותם בפינצטה בזה אחר זה למיכל מים נטולי יונים. לאחר מכן, סוניקציה אותם במים למשך חמש דקות. בסיום, יבש אותם במגבת נייר.
הכינו 0.5 מיליליטר של חומר לשחרור עובש, וטבלו בו את הסיכות. לאחר שעתיים, הניחו את הסיכות במים נטולי יונים והפכו אותן לסוניקציה למשך חמש דקות. המשך דורש צלחת תחריט.
כלי התחריט בנוי מזכוכית ודבק סיליקון. התחל את תהליך התחריט על ידי חלוקת דבק סיליקון לקצוות הסיכה על הכלי. הניחו את הסיכות כך שהקצות בקצותיהם הישרים טובלים בדבק.
זו המנה לאחר שכל הסיכות נמצאות במקום ומוכנות לשלב הבא. מעבירים את צלחת התחריט לתסיסה לחה שחוממת ל -38 מעלות צלזיוס, וממתינים לילה לריפוי הדבק. כשהוא מוכן, הניחו את צלחת התחריט עם הסיכות על פלטה של 65 מעלות צלזיוס.
יוצקים 0.8 מיליליטר חומצת תחריט על האזור החשוף של הסיכות. לאחר 10 דקות, העבירו את החומצה לכוס בעזרת מיקרופיפטור לאחר מכן, הוסיפו עוד חומצת תחריט לתבשיל כדי לחזור על שלב התחריט.
לאחר התחריט יש לבדוק שרוחב האזור החרוט הוא כ-0.2 מילימטרים. אם כן, מיקרופיפטה חמישה מיליליטר של תמיסת נתרן ביקרבונט על צלחת התחריט כדי לנטרל את החומצה שנותרה. לאחר מכן, השתמש בזוג פינצטה כדי להסיר את הסיכות על ידי משיכה לאורך.
התחל בתבנית מפוברקת. כמו בסכימה זו, התבנית מיועדת למכשיר עם דופן קבועה ומקום לסיכות. יוצרים את התבנית על שקופית זכוכית באמצעות ליתוגרפיה.
הניחו את השקופית המוכנה בתחתית צלחת פלסטיק. כעת, שפכו פרה-פולימר של PDMS על התבנית לעובי של שלושה מילימטרים. מניחים את המנה במייבש ואקום למשך 10 דקות.
לאחר מכן, העבירו אותו לתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה. התוצאה היא לוח שנרפא חלקית. השתמש באזמל כדי לחשוף את הלוח לשלבים הבאים.
מכניסים את הלוח לתנור בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לרפא אותו לחלוטין. כעת, עבדו עם הלוח שנרפא במלואו. יהיו לו קצוות לא סדירים לאורך התבנית המנחה.
השתמש באזמל כדי לקצץ בצורה מדויקת ונקייה את הקצוות הלא סדירים. שימו לב במיוחד למשטח עבור חריצי הכנסת הסיכות כדי ליצור את המכשיר הטוב ביותר. חורר חורים לכניסה/יציאה של החדר הראשי ובמקומות אחרים באמצעות ניקובי ביופסיה.
כעת, בנה מכלול מיקרו-ערוץ. מחממים תמיסת ניקוי ל-60 מעלות צלזיוס, ומקבלים כיסוי מספר ארבע. מידות הכיסוי 10 מילימטרים על 20 מילימטרים.
טבלו את זכוכית הכיסוי בתמיסה למשך 10 דקות. הנח את זכוכית הכיסוי השטופה והמיובשת ואת לוח ה-PDMS על האלקטרודה התחתונה של ציפוי מקרטע. צור פלזמה ואקום אוויר למשך 30 שניות.
חבר את הפריט שאוחזר כך שהקצוות יתיישרו ותכונות הערוץ יהיו גלויות מבעד לזכוכית הכיסוי. השתמש במיכל סטרילי כדי לקחת את השכבות המודבקות למכסה המנוע כדי לעקר אותן. בסיום, הכנס את הפינים לחריץ.
סיכות סמוכות צריכות להיות באורכים שונים. הסיכות יוצרות את הדופן השנייה של המיקרו-תא. המשך לעבוד במכסה המנוע הלמינר.
עבור השלבים הבאים, הכינו בסיס למכשיר. הכן מילוי פער על ידי הומוגניזציה של תערובת של פטרולאטום לבן ואבקת פוליטטרפלואורואתילן. יוצקים את התערובת ההומוגנית למזרק מתקן, ומכניסים בוכנה.
דחוף את הבוכנה כדי למלא את קצה המזרק. לאחר מכן, חבר מחט ודחף את הבוכנה עד שהמחט מתמלאת. הכינו מזרק שני עם דבק סיליקון בצורה דומה, וחברו כל אחד למתקן פנאומטי.
כעת, הוציאו דבק סיליקון על הבסיס. הניחו אותו לאורך אחד הכיסים. לאחר מכן, הניחו כיסוי מספר ארבע על הכיס, ולחצו עליו בחוזקה כדי להדביק אותו.
לאחר מכן, חלק דבק סיליקון לאורך שני החריצים החיצוניים של הבסיס על ידי ציור מקטעים בעומק של כמילימטר אחד. לאורך חריץ נוסף באמצע, יש להוציא מילוי רווחים בקטע בעומק של מילימטר אחד. שים עוד דבק בקצה הכיס השני.
הנח מכלול מיקרו-ערוצים על הכיס ולחץ עליו בחוזקה. שוב, הכניסו מילוי פערים לחריץ לאורך אמצע הבסיס. עקוב אחר זה עם הנחת דבק על החריצים הסמוכים.
תן למכשיר לעמוד יום אחד במכסה המנוע הסטרילי. לאחר הריפוי, במכסה המנוע הלמינר, הזיזו כל סיכה עד מילימטר אחד לאורך הפינים הסמוכים לה כדי לשחרר אותם מהמחסום האלסטומרי. הגדר בדיקת פלואורסצנטיות לדליפה על ידי דילול צבע פלואורסצנטי ירוק במים מיוננים.
לאחר מכן, פתח את המיקרו-ערוץ כך שיהיה לו רוחב אחיד לכל אורכו. השתמש במיקרופיפטה כדי להעביר צבע ליציאת קצה אחת של המיקרו-ערוץ, ומלא אותו בתמיסה. בכלי פלסטיק גדול, הניחו שתי פיסות נייר סופג רטובות במים נטולי יונים ואת המכשיר בפנים.
דגרו את המנה ב -5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפחות בחום של 37 מעלות צלזיוס. צפה במכשיר שאוחזר במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך, והקלט תמונות. השתמש בהם כדי לוודא שאין דליפה סביב הסיכות.
תמונות אלה הן של דגימה דולפת ולא דולפת. בדיקה נוספת כוללת זריעת תאים. פתח את המיקרו-ערוץ כדי ליצור תעלה ישרה ברוחב 400 מיקרון עם הדופן שטוחה ככל האפשר לכל אורכה.
הוסף מתלה תאים ליציאת קצה אחת כדי למלא את הערוץ. אתר את הפינים המגדירים את דופן האזור כדי להתחיל את תרבית התאים, וסגור אותם כדי לסגור את התאים באזור. התחילו בסמוך לאזור, סגרו את כל הפינים על מנת להוציא את התאים בערוץ.
לאחר שאיבת מתלים מיציאות הקצה, הוסף בינוני. הניחו את המכשיר במיכל פלסטיק עם נייר סופג רטוב. דגרו אותו למשך 24 שעות לפחות.
חפש את התאים שיהיו בערך 10 תאים באזור הסגור. לאחר מכן, משוך לאט סיכה כדי להרחיב את אזור התרבות. תמונות אלה הן של תאי COS-7 הגדלים במיקרו-ערוץ הניתן להגדרה מחדש.
במהלך תשעה ימים הורחב שטח התרבית של המיקרו-ערוצים. הנתונים שנאספו מאפשרים תרשים של ספירת התאים והצפיפות כפונקציות של זמן. הנקודות הכחולות והתאמת העקומה מיועדות לספירת התאים.
הסמלים האדומים וההתאמות מיועדים לצפיפות. עבור הצפיפות, החצים האנכיים מצביעים על התרחבות שטח תרבית התאים ביומיים, חמישה ושישה ימים. הצפיפות מחושבת עבור אותם אזורי תרבות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבנות דופן נטולת דליפות של תעלה מיקרופלואידית מסיכות קטנות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבוע אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבצע כל אחד משלבי הפרוטוקול בזהירות וביסודיות.
אל תשכח שעבודה עם חומצה חזקה עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הכנת כמות מספקת של חומר מנטרל. בעקבות הליכים אלה, ניתן להכניס תאים אחרים עם נוזל על מנת ליצור תרביות תאים מורכבות יותר.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לייצור התקן מיקרופלואידי בעל תכונה של הגדרה מחדש (reconfigurable) עם דפנות צד דפורמביליות העשויות ממערך של פינים. ההתקן מאפשר בקרה משופרת על הזרימה וטיפול בחלקיקים, תוך התאמה לתנאי ניסוי שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ייצור התקנים
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- התקנים מיקרופלואידיים חיוניים ליישומים ביולוגיים שונים.
- התקנים מסורתיים מתקשים לעיתים קרובות להתמודד עם תנאי זרימה לא ידועים.
- תכנונים ניתנים להגדרה מחדש יכולים לשפר את יכולת ההסתגלות בניסויים.
- הדגמות חזותיות משפרות את ההבנה של תהליכי הרכבה מורכבים.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרופלואידי שניתן להגדירו מחדש בקלות במהלך השימוש.
- מתן פרוטוקול ייצור מפורט עבור חוקרים.
- הדגמת היתרונות שבשימוש בפינים לעיצוב מחדש של הדפנות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכסית של פיני פלדה אל-חלודה לבניית דפנות צד.
- שימוש ב-PDMS להרכבת המיקרו-ערוצים.
- שימוש בדבק סיליקון להדבקת רכיבים.
- ביצוע בדיקות פלואורסצנציה להערכת דליפות ותקינות.
תוצאות עיקריות
- ההתקן המיוצר הדגים בהצלחה יכולת תכנון מחדש (reconfigurability).
- בקרת הזרימה נוהלה ביעילות באמצעות דפנות צדדיות ניתנות לכיוונון.
- עזרים חזותיים שיפרו את ההבנה של תהליך ההרכבה.
- בדיקות אישרו את השלמות והביצועים של הערוצים המיקרופלואידיים.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה ליצירת התקני מיקרופלואידיקה גמישים.
- יישומים עתידיים עשויים להפיק תועלת מהגמישות של תכנון זה.
- מחקרים נוספים עשויים לבחון תצורות ושימושים נוספים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכות מיקרופלואידיקה הניתנות להגדרה מחדש מענייות לפתרון האתגר של טיפול בדגימות ביולוגיות לא ידועות או משתנות בשלבי הגילוי המוקדמים, כאשר לא ניתן לחזות את התנהגות הזרימה של תאים, נוזלים צמיגיים או חלקיקים במהלך תכנון המכשיר. טכנולוגיית דפנות המבוססת על פינים זו מאפשרת שליטה מרחבית-זמנית לפי דרישה בדינמיקת הנוזלים, ובכך תומכת בניסויים אדפטיביים ללא צורך בתכנון מחדש. היא מגבירה את הוודאות החיזויית בביצועי הבדיקה על ידי מתן אפשרות להתאמה בזמן אמת לדרישות הטיפול הספציפיות של הדגימה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תגובות תאיות תחת הגבלה הניתנת לכוונון דינמי, ובכך תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באוכלוסיות הטרוגניות.
- ערך תפעולי: מאפשר הגדרה מחדש מהירה של גיאומטריית התעלה לבדיקת השערות מכניסטיות ללא צורך בייצור התקנים חדשים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מספק פרופילי גזירה וזרימה ניתנים לכיוון עבור סריקה סטנדרטית של תרכובות בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך תפעולי: מפחית את הצורך במספר גרסאות של מכשירים על ידי מתן אפשרות לפלטפורמה אחת לדמות סביבות מיקרו מגוונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במחקרי תרביות תאים אורכיים שבהם הרחבת שטח התרבית מדמה צמיחת רקמה או בדיקות פלישה.
- ערך תפעולי: מקל על מעבר חלק משלב הגילוי לתהליכי עבודה פרה-קליניים על ידי שמירה על תאימות עקבית של תוצאי המדידה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אפשור בדיקות ביולוגיות אדפטיביות, ממשיכה לשלב הסריקה באמצעות בקרת זרימה הניתנת לשחזור, ותומכת במחקר תרגומי באמצעות סביבות תרבית יציבות לטווח ארוך.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות לחוקרים לווסת רמזים מהמיקרו-סביבה בזמן אמת במהלך סריקה פנוטיפית.
- סריקה: משפרת את מוכנות הבדיקה באמצעות דפנות צדדיות הניתנות לשחזור וללא דליפות, המבטיחות חשיפה עקבית של תרכובות בין הבארות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של תגובות תאיות תחת זרימה מבוקרת, ובכך משפרת את מהימנות הנתונים לצורך בחירת פגיעות (hits).
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להרחבת תרביות ניתנת להרחבה (scalable) המשקפת תגובות ברמת הרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כנכס פלטפורמה הניתן להגדרה מחדש עבור פרויקטים מרובים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של התקנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות הביולוגית במבחנים הרגישים לזרימה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות איטום מחסום אלסטומרי והפעלה מבוססת פינים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לאופטימיזציה של המבחן בהתאם לתנאים ספציפיים ללא שינויים בחומרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם לסיכון, בהתבסס על ביצועים תחת תנאים רלוונטיים דינמיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידי, תעיית פינים וטכניקות הדבקה של PDMS.
- תלוי בגישה לציוד תעייה, למייבשי ואקום ולכלי דיספנסינג מדויקים עבור חומר מילוי המרווחים והדבק.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הפעלת הפינים כדי להבטיח דפורמציה ניתנת לשחזור של התעלות.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר לסוגי תאים או לצמיגויות שונות, בשל סיכונים לדליפה הקשורה למניסקוס.
- מוגבל על ידי מהלך התנועה הפיזי של הפינים ועל ידי פוטנציאל להיצמדות הקשורה למרווחים במידה וחומר המילוי לא ייושם כראוי.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
The Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls
1:11
Etching the Pins
3:26
Fabrication of the Silicone Slab with Reservoirs and a Space for Pins
4:42
Assembly of the Device with In-place Fabrication of Gap Filler and Barrier
7:18
Evaluation of the Microfluidic Device
8:57
Results: Progressive and Continuous Cell Growth with Variable Cell Culture Area in a Reconfigurable Microchannel
9:39
Conclusion
