דגם ארנב של ביטוי Transgene עמיד ומוחלף כדי שתלי Interposition נפוצים של העורק הראשי
10 בספטמבר 2018
שיטה זו מתארת את המיקום של שתלי העורק interposition בארנבים, את התמרה חושית של השתלים, ההישג של הביטוי transgene עמיד. דבר זה מאפשר החקירה של תפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של transgenes ומוצרים שלהם חלבון בורידים המושתל, ובדיקות של ג'ין טיפולים למחלות שתל הווריד.
שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח לגבי הפתוגנזה של כשל בהשתלת ורידים. לדוגמה, הוא יכול לזהות מתווכים של כישלון השתל ואסטרטגיות בדיקה שמטרתן למנוע כישלון השתל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא יכולתה להשיג ביטוי טרנסגן עמיד ויציב באנדותל השתלת הוורידים.
לאחר הרדמת ארנב על פי פרוטוקול הטקסט, יש לגלח את החיה מחריץ החזה ועד לקצה הלסת התחתונה. עם השלמת המערך הכירורגי השתמש בצריבה חשמלית כדי לחתוך את העור לאורך קו האמצע בין חריץ החזה ללסת התחתונה, באורך של כשבעה עד תשעה סנטימטרים. לאחר מכן חבר מגבת clamps כדי להחזיק את החתך פתוח.
לנתח בצורה בוטה מתחת לפאשיה לאורך כל קו האמצע. לאחר מכן השתמש בצריבה חשמלית כדי לחתוך את שכבת הפאשיה המנותחת לאורך קו האמצע. לאחר מכן, החל מהצד הימני, נתח בין שריר ההיואיד החזה המכסה את קנה הנשימה לבין השריר הסטרנואפלי כדי לחשוף את עורק הצוואר המשותף.
לאחר מכן נתח בזהירות קטע של ארבעה עד חמישה סנטימטרים מעורק הצוואר המשותף וענפיו הגדולים יותר נקיים מהרקמות שמסביב. השתמש בתפרי משי 5-0 כדי לקשור את הענפים הגדולים יותר של עורק הצוואר המשותף לפני חיתוך כל ענף דיסטלי לתפר. לאחר חזרה על הדיסקציה על הצוואר הנפוץ השמאלי, השתמש במלקחיים המחזיקים רקמות כדי לסגור זמנית את שכבת הרקמה התת עורית.
לאחר מכן נתח את הפאשיה השטחית מהעור בצד ימין עד לחשיפת וריד הצוואר החיצוני. נתח קטע של ארבעה עד חמישה סנטימטרים של וריד הצוואר החיצוני ושחרר את ענפיו מהרקמה שמסביב. השתמש בתפרי משי 5-0 כדי לקשור את הענפים, ואז חתוך את הענפים.
לאחר מכן קשרו את הווריד המבודד בשני הקצוות, חתכו את קצה הגולגולת ושטפו את הלומן במי מלח הפריניזציה. כדי לבצע השתלת ורידים, השתמש בקליפ כלי דם כדי להדק את עורק הצוואר המשותף הימני בקצה הגולגולת של הקטע המבודד. לאחר מכן הניחו קליפ כלי דם בקצה הזנב.
כעת בצע כריתת עורקים זנבית רק גולגולת למהדק הזנב השווה באורכו לקוטר קצה הגולגולת של קטע הווריד. לאחר מכן הכנס קטטר IV המחובר למזרק של מי מלח רגילים דרך עורקי הזנב ושטוף את לומן עורק הצוואר. הנוזל ייצא דרך כריתת העורקים.
חוזרים לווריד הצוואר, כורתים את הווריד ומניחים אותו ליד העורק הקרוטי. באמצעות תפרים בודדים של 7-0 תפר פוליפרופילן את הקצה הזנבי של עורקי הזנב לקצה הגולגולת של קטע הווריד. לאחר מכן הניחו תפר שני 180 מעלות מהתפר הראשון כדי לתפור את קצה הגולגולת של עורקי הזנב לקצה הגולגולת של קטע הווריד.
הניחו תפר שלישי בנקודה במרחק שווה משני התפרים הראשונים בצד הצדדי של האנסטומוזיס. לאחר מכן הניחו תפר רביעי בצד המדיאלי של האנסטומוזיס במרחק שווה משני התפרים הראשונים ומול התפר השלישי. הנח ארבעה תפרים נוספים בין כל אחד מהתפרים אחד עד ארבעה.
בצע את כריתת עורקי הגולגולת בצד הזנב של הקליפ הדיסטלי. המרחק בין קצה הגולגולת של עורקי הגולגולת לקצה הזנב של כריתת העורקים הזנביים צריך להיות זהה לאורך קטע הווריד. אורך כריתת עורקי הגולגולת שווה לקוטר הקצה הזנבי של קטע הווריד.
כאשר הווריד מורחב בגולגולת מהאנסטומוזה לאורך הצוואר, ודא שהווריד אינו מעוות. לאחר מכן השתמש במי מלח רגילים של הפרין כדי לשטוף את עורק הצוואר והווריד דרך כריתת עורקי הגולגולת. לאחר מכן, הניחו תפר ראשון לתפירת הקצה הזנבי של עורקי הגולגולת לקצה הזנב של קטע הווריד.
לאחר מכן הניחו תפר שני 180 מעלות מהתפר הראשון כדי לתפור את קצה הגולגולת של עורקי הגולגולת לקצה הזנב של קטע הווריד. השלם את האנסטומוזה כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. שחרר זמנית את קליפ הגולגולת כדי לאפשר לשתל הווריד להתמלא בדם ולהפעיל לחץ עדין עם גזה יבשה כדי לעצור כל דימום.
חזור על שלב זה עד שהאנסטומוזה כבר לא מדממת. לאחר מכן הסר את קליפס הגולגולת והזנב. השתמש בגזה כדי לעצור כל דימום נוסף באנסטומוזות.
השתמש בתפר משי 3-0 כדי לקשור את שני הקצוות של קטע עורק הצוואר המשותף בין האנסטומוזות. לאחר מכן מחלקים את הצוואר באמצע הדרך בין הקשרים. יש לראות פעימות מהירות בשתל הווריד.
חזור על מיקום השתלת הווריד בצד שמאל. עם תפר PGA 5-0, סגור את הרקמה התת עורית בתבנית רציפה. לאחר מכן השתמש בתפר PGA 3-0 כדי לסגור את העור בתבנית תוך-עורית ולקבור את הקשרים בשני הקצוות.
בצע טיפול לאחר ניתוח ואולטרסאונד דרך העור על פי פרוטוקול הטקסט. כדי לבצע ניתוח העברת גנים, יש לבודד בזהירות את שתל הווריד הימני כולל 1.5 עד שני סנטימטרים מעורק הצוואר הסמוך לשתל הן בצד הגולגולת והן בצד הזנב. חזור על הדיסקציה בצד שמאל באותו אופן.
השתמש במי מלח רגילים כדי למלא את חלל הפצע הניתוחי בצד ימין כדי לאפשר העברת גלי קול. חבר בדיקה של זרימה פרי-וסקולרית של שני מילימטר למד זרימת נפח וטבול את הגשושית במי המלח בחלל הפצע. הגדר את קצב הזרימה לאפס.
הנח את בדיקת הזרימה סביב עורק הצוואר הזנב או הגולגולת לשתל הווריד. לאחר מכן השתמש במערכת רכישת נתונים אלקטרונית כדי להקליט נתונים מבדיקת הזרימה. לאחר הזרקת הפרין לארנב דרך צנתר העירוי ושטיפתו במי מלח, השתמש בקליפ כלי דם כדי להדק את עורק הצוואר המשותף בקצה הגולגולת של שתל הווריד.
ואז למרוח קליפ שני על הצוואר כ -10 מילימטרים זנב על האנסטומוזיס הזנב כדי להשאיר מקום לכריתת העורקים. לאחר מכן הניחו שני קשרי משי באופן רופף סביב עורק הצוואר רק זנב לשתל הווריד. לאחר מכן באמצעות מחט כפופה שהוכנה בעבר בגודל 21, נקב את הזנב הצוואר לשתל ופשוט גולגולת לקליפ כלי הדם הזנבי.
קדם את המחט לתוך הלומן קדימה ואחורה פעמיים כדי לוודא שהלומן נקי. ואז משוך בזהירות את המחט. לאחר הכנת מזרק וצנתר IV עם DMEM על פי פרוטוקול הטקסט, הכנס אותו לתוך עורקי הצוואר הנפוץ עד לנקודת העיקול ושטוף את לומן השתלת הווריד על ידי מילויו ב-0.5 מיליליטר DMEM פעמיים.
הסר את ה-DMEM מהשתל באמצעות אצבע עטויה כפפה כדי ללחוץ קלות על קצה הגולגולת של השתל. לאחר מכן החלק בזהירות את האצבע לאורך השתל לכיוון הקצה הזנבי של השתל כדי לשטוף את התוכן הלומינלי החוצה דרך כריתת העורקים. הסר את מזרק ה-DMEM מהקטטר והשאיר את הקטטר בכלי.
חבר את המזרק המכיל את תמיסת הנגיף וודא שלא נכנס אוויר לקטטר. הזיזו את קשרי המשי הרופפים במורד העורק עד שהם סביב קצה הצנתר אך אל תהדקו אותם. החדירו 0.03 מיליליטר של תמיסת וירוס כדי לדחוף את ה-DMEM הנותר החוצה מהצנתר.
לאחר מכן, בעזרת אצבע, הסר את כל הנוזלים מלומן השתלת הווריד ולחץ בעדינות מהגולגולת לזנב. הדק את שני הקשרים סביב העורק וקצה הצנתר כדי לאטום את הלומן. לאחר מכן יש להחדיר את תמיסת הנגיף עד לנפיחותו של הווריד.
הניחו בעדינות את המזרק על קן גזה. לאחר 20 דקות, השתמש במזרק ריק כדי לשאוב בעדינות את התמיסה המכילה את הנגיף מהשתל עד לקריסת הכלי. הסר את המזרק והשאיר את הקטטר במקומו.
לאחר מכן חתוך ושחרר את תפרי המשי והוציא את הקטטר מהכלי. כעת השתמש בתפר פוליפרופילן 7-0 בתבנית X כדי לסגור את כריתת העורקים. לאחר מכן משוך בעדינות את קצוות התפרים וקשר אותם יחד עם שני קשרים מרובעים.
לאחר החזרת זרימת הדם בשתל הווריד הימני כמתואר בפרוטוקול הטקסט, חזור על עירוי הנגיף בצד שמאל. כדי לקצור את השתלים המועברים, נתח את שתלי הוורידים ועורקי הצוואר הנפוצים ובצע מדידות זרימה הן בצד שמאל והן בצד ימין כפי שהודגם קודם לכן. השתמש בתפר משי 3-0 כדי לקשור את עורק הצוואר המשותף הימני גולגולת לשתל.
לאחר מכן השתמש בתפר משי 3-0 כדי לקשור את זנב הצוואר לשתל. כריתת שתל הווריד הימני על ידי חלוקת עורק הצוואר הסמוך בין כל אחת מהקשרים לבין האנסטומוזיס הסמוך. לאחר מכן הסר את שתל הווריד מהארנב והשתמש במי מלח כדי לשטוף את הלומן.
אבן הדרך הראשונה שמפעיל חדש חייב להשיג היא סבלנות השתלת ורידים עקבית הן לאחר ניתוח השתלת הווריד הראשוני והן לאחר ניתוח ההעברה המושהה שלאחר מכן. כאשר השתלת וריד מוגנת בפטנט, בדיקת האולטרסאונד תחשוף כלי דם גדול עם זרימת דם נמרצת מזנב לגולגולת. השתלים נקצרו שלושה ימים לאחר ההעברה, נחתכו לחלקים ונצבעו ב-X-gal.
הדמיה פנים אל פנים של המשטחים הלומינליים הראתה שתלי ורידים עם התמרה יעילה והתמרה לקויה. כפי שמוצג בתרשים זה, רמות ה-mRNA של בטא גלקטוזידאז בשתלי ורידים שהועברו על ידי המפעיל החדש, לא היו שונות באופן משמעותי מרמות ה-mRNA של בטא גלקטוזידאז בשתלי ורידים שהועברו על ידי מפעיל מנוסה. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור להפוך את השתלת הווריד גולגולת לזנב לפני הידבקות באנסטומוזיס.
זה הכרחי כדי למנוע חסימה של זרימת הדם על ידי בולוס ורידי. לאחר השליטה ניתן להשלים ניתוחים אלה תוך כשלוש שעות להליך השתלת הוורידים, שעתיים להליך העברת הגנים של השתלת הווריד ו-45 דקות להליך הקציר. אל תשכח שמכיוון שפרוטוקול זה דורש עבודה עם וקטורים ויראליים וחפצים חדים, יש להקפיד על נהלי בטיחות ביולוגית וחדים נאותים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטה זו מתארת את השתלת השתל ורידי ביניים בארנבונים, המאפשרת לחקור ביטוי של גנים זרים ותפקידיהם הפיזיולוגיים. היא מספקת פלטפורמה לבדיקת טיפולים גנטיים המיועדים למחלות של השתלים ורידיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- תרפיה גנומית
- ביולוגיה של כלי דם
- ביטוי טרנסגן
רקע
- כישלון של הש transplanted vein (השתקת וריד) הוא בעיה קלינית משמעותית.
- הבנת הפתוגנזה של כישלון השתקה יכולה להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
- ביטוי עמיד של טרנסגן בהשתקות וריד יכול להקל על המחקר.
- שיטה זו מאפשרת זיהוי של מתווכים של כישלון השתקה.
מטרת המחקר
- לבחינת התפקידים הפיזיולוגיים והפתולוגיים של טרנסגנים בוורידים מושתלים.
- לבחינת אסטרטגיות שמטרתן למנוע כשל של השתלי וריד.
- להשגת ביטוי יציב של טרנסגנים באנדותל של השתל הוורידי.
שיטות במחקר
- השתלה של השתולי וריד ביניים בארנבים.
- טרנסדוקציה של ההשתלים לצורך ביטוי גנים.
- הערכת יציבות ביטוי הגן המועבר.
- הליכים כירורגיים הכוללים הרדמה וטכניקות של חתך.
תוצאים עיקריים
- הושגה בהצלחה ביטוי עמיד של הגן התחליפי.
- השיטה מאפשרת חקירה של מתווכי כשל בשתיל.
- ניתן לבחון אסטרטגיות פוטנציאליות למניעת כשל בשתיל.
- אושר ביטוי יציב באנדותל של השתיל הוורידי.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי בעל ערך לחקר מחלות של השתקת ורידים.
- היא משפרת את ההבנה של תפקידי הגנים התחליפיים (transgenes) בביולוגיה של כלי דם.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו לקידום פיתוחים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביטוי עמיד של טרנסגן בגרפטים של השמה (interposition grafts) מהוריד הג'וגולרי לעורק התריס בשפנים מאפשר חקירה קפדנית של תפקוד גנים ואסטרטגיות טיפוליות לכשל בגרפטים ורידיים. מודל זה תומך בביטחון חיזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור מועמדים לטיפול גנטי וסקולרי. יכולת השחזור וההתרחבות שלו ממיגות אותו כנכס בעל ערך לגילוי מוקדם ומחקר תרגומי בתיקי פיתוח של תרופות למערכת לבביות וכלי דם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של תפקודי גנים במנגנוני התאמה וכשל של השתלה של וריד.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להערכה ישירה של השפעת הגן המועבר (transgene) על פתולוגיה וסקולרית.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בבחירת מטרות לאסטרטגיות אנטי-תרומבוטיות ואנטי-אתרוסקלרוטיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo שעברה תיקוף להערכה כמותית של ביטוי גנים זרים ותוצאות קרייתיות.
- מאפשר סטנדרטיזציה של פרוטוקולי העברה וביטוי של גנים לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- תומך בסריקה המשכית של וקטורים לטיפול גנטי והתערבויות מועמדות במודל הניתן להרחבה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתואם עם נקודות סוף רלוונטיות למחלה, כגון צמיחה נאואינטימלית, דלקת כלי דם ואתרוסקלרוזיס.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לאישוש פרה-קליני על ידי מתן אפשרות למחקרים אורכיים של ביולוגיית השת Transplant.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי מידול מנגנוני כשל של השתקת ורידים הרלוונטיים מבחינה קלינית.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
מודל ארנב זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לאישור פרה-קליני עבור תרפיה גנטית כלי דם, ותומך בבדיקת השערות, תיקוף יעדים ומחקרים מכניסטיים לפני זיהוי המועמד המוביל.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקה חזקה של השערת האפס לגבי תפקוד גנים בהסתגלות ובכישלון של השתלה של וריד.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של ביטוי טרנסגנים ותוצאים כליים.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית של יעילות העברה גנטית ונקודות קצה ביולוגיות בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מדמה תהליכים רלוונטיים למחלה לצורך התאמה של סממנים ביולוגיים וקידום מותאם לסיכון.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה וכלכלית להערכה איטרטיבית של טיפול גנטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של טיפול גני בכלי דם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולים להעברה וביטוי של גנים in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ובקצאת הון באמצעות אספקת נתונים פרה-קליניים חזקים.
- השפעה על הפורט폴יו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לטיפול גני המכוונים לכישלון של השתקת ורידים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות כירורגית בהשת라는ות כלי דם ובטכניקות להעברת גנים.
- נדרש גישה למכשור למדידת זרימה ולפלטפורמות לניתוח מולקולרי.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים כירורגיים ואנליטיים לצורך הדירות.
- התאמה למודלים וסקולריים אחרים עשויה לדרוש שינויים בפרוטוקול ותיקוף.
- נהלי בטיחות ביולוגית וטיפול קפדני במכשירים חדים חיוניים בשל השימוש בוקטורים ויראליים.
